蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育以及菌種鑒定

1、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文本 科 畢 業(yè) 論 文蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育以及菌種鑒定專業(yè)名稱：生 物 科 學(xué) 1302學(xué)生姓名： 賈 旭 學(xué) 號(hào)： 2013044020206 導(dǎo) 師： 韓 軍 蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育以及菌種鑒定摘 要分離和純化培養(yǎng)法在實(shí)驗(yàn)中常常是分離雜菌篩選所需菌落的有效方法，紫外線誘變可以試驗(yàn)出菌落突變率最高的誘變時(shí)間或誘變強(qiáng)度，從而選擇最適劑量對(duì)純化菌株進(jìn)行誘變，產(chǎn)生性能更加優(yōu)秀的可育后代，這就是菌株的選育過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用以上方法對(duì)土壤中的雜菌進(jìn)行分離純化，得到純化的能分解蛋白質(zhì)的菌株，通過(guò)紫外線誘變而獲得分解能力強(qiáng)的菌株，即高產(chǎn)蛋白酶的菌株。菌種鑒定則是對(duì)微生物快速深入了解的捷

2、徑。關(guān) 鍵 字 滅菌、培養(yǎng)基、無(wú)菌操作、分離純化、紫外線誘變、菌種鑒定Abstract 英文省略。正 文1.蛋白酶菌種的采樣由于采樣的菌種需要有分解蛋白質(zhì)的能力，所以采樣地點(diǎn)可以是餐飲聚集地或者種植大豆等富含高蛋白植物的土地。2.蛋白酶菌種的分離純化2.1.實(shí)驗(yàn)用品的滅菌滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物,滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類.本實(shí)驗(yàn)主要介紹物理方法的一種,即加熱滅菌. 加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種.通過(guò)加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性,從而達(dá)到殺菌目的.蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān),含水量越高,其凝固所需要的溫度越低.在同一溫度下,濕熱的殺菌效力比干熱大,因?yàn)樵跐駸崆闆r

3、下,菌體吸收水分,使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng),可增加滅菌效力.本實(shí)驗(yàn)采用高壓蒸汽滅菌法。2.1.1.滅菌前的準(zhǔn)備 玻璃器皿等在滅菌前必須經(jīng)正確包裹和加塞,以保證玻璃器皿于滅菌后不被外界雜菌所污染.常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內(nèi)；三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙,用棉繩以活結(jié)扎緊,以防滅菌后瓶口被外部雜菌所污染；吸管以拉直的曲別針一端放在棉花的中心,輕輕捅入管口,松緊必須適中,管口外露的棉花纖維統(tǒng)一通過(guò)火焰燒去,滅菌時(shí)將吸管裝入金屬管筒內(nèi)進(jìn)行滅菌,也可用紙條斜著從吸管尖端包起,逐步向上卷,頭端的紙卷捏扁并擰幾下,再將包好的吸管集中滅菌. 2.1.2.高壓

4、蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣,效率高,是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的滅菌方法.這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的.當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時(shí),水蒸氣的溫度升高到121,經(jīng)1530min,可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢.一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。2.1.3火焰滅菌 直接用火焰灼燒滅菌,迅速?gòu)氐?對(duì)于接種環(huán),接種針或其它金屬用具,可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌.此外,在接種過(guò)程中,試管或三角瓶口,也采用通過(guò)火焰而達(dá)到滅菌的目的.2.1.3.操作方法和注意事項(xiàng) 加水：打開(kāi)滅菌鍋蓋,向鍋內(nèi)加水到水位線.立式

5、消毒鍋?zhàn)詈糜靡阎箝_(kāi)過(guò)的水,以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存.注意水要加夠,防止滅菌過(guò)程中干鍋. 裝料、加蓋：滅菌材料放好后,關(guān)閉滅菌器蓋,采用對(duì)角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋,使蒸汽鍋密閉,勿使漏氣. 排氣：打開(kāi)排氣口(也叫放氣閥).用電爐加熱,待水煮沸后,水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出,當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí),維持5min,使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈. 升壓、保壓和降壓：當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí),即可關(guān)閉排氣閥,壓力開(kāi)始上升.當(dāng)壓力上升至所需壓力時(shí),控制電壓以維持恒溫,并開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間,待時(shí)間達(dá)到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121,20min）后,停止加熱,待壓力降至接近“0”時(shí),打開(kāi)放氣閥.注意不能過(guò)早過(guò)急地排氣,

6、否則會(huì)由于瓶?jī)?nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶?jī)?nèi)液體沖出容器之外. 滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)：滅菌后的培養(yǎng)基放于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng),經(jīng)24h培養(yǎng)無(wú)菌生長(zhǎng),可保存?zhèn)溆?；斜面培養(yǎng)基取出后,立即擺成斜面后空白培養(yǎng)；半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后,空白培養(yǎng).2.2菌液的配置準(zhǔn)備10支試管，第一支加入10mL蒸餾水，其余加入9mL并編號(hào)110。將采樣的土壤取1g放入到裝有10mL蒸餾水的試管中，依次在前邊一個(gè)試管中取1mL加入后一試管中做梯度稀釋，直到最后一試管。（每次做梯度稀釋時(shí)都要將前一個(gè)試管中的菌液混勻）2.3.培養(yǎng)基的配置2.3.1.培養(yǎng)基的原理培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料.

7、由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類型,對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同,加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同,所以培養(yǎng)基的種類很多,使用的原料也各有差異,但從營(yíng)養(yǎng)角度分析,培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)素以及水分等.另外,培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓.2.3.2.培養(yǎng)基配置的步驟流程：稱藥品溶解加牛奶調(diào)pH值倒平皿根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品,放入適當(dāng)大小的錐形瓶中。用量筒取一定量蒸餾水倒入錐形瓶中,攪拌混勻，使瓊脂或蛋白胨等藥品完全溶解，用透氣濾紙塑料膜封口，放在微波爐中加熱，注意控制溫度不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全溶化后取出冷卻到50左

8、右，加入牛奶混勻。后根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求,用5%NaOH或5%HCl溶液調(diào)至所需pH.測(cè)定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等（此步驟可以省略）。在溫度沒(méi)有下降到培養(yǎng)基的凝固溫度時(shí)快速將錐形瓶中的溶膠物質(zhì)分倒入到準(zhǔn)備好的平皿中，編號(hào)110。將試管中的菌液分別取200L分別涂布到對(duì)應(yīng)編號(hào)的平皿中。（涂布菌液要均勻，盡量將菌落分開(kāi)）2.3.2.1.注意事項(xiàng)此步驟中凡是滅菌的實(shí)驗(yàn)用品都要在無(wú)菌環(huán)境中操作（例如涂布和倒平皿等步驟），可以在超凈工作臺(tái)中操作，也可以在酒精燈火焰附近的無(wú)菌區(qū)操作。倒平皿時(shí)當(dāng)溶膠物質(zhì)覆蓋平皿底部3/4時(shí)即可，不宜太多，后通過(guò)其流動(dòng)而均勻覆蓋整個(gè)平皿底部。2.3.2.2.微生物培養(yǎng)的方

9、式 澆注平板法和涂布平板法。2.4菌株的培養(yǎng)將平皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度37，恒溫培養(yǎng)45d。培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)時(shí)將培養(yǎng)皿取出，觀察各個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落，菌株旁邊有透明圈的即為蛋白酶菌落。（此蛋白酶菌因?yàn)橛蟹纸獾鞍踪|(zhì)的能力，所以將其周圍的牛奶分解利用而形成了空圈）選擇菌落直徑足夠小，分解蛋白的透明圈足夠大，即透明圈與菌落圈的直徑比最大的菌落作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用或者作為工程菌來(lái)培養(yǎng)，其分解蛋白的能力最強(qiáng)。2.4.1.菌種的初步篩選根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選：透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）；抑菌圈法（抗生素）；變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）。透明圈直徑（H）/菌落直徑（C

10、）：產(chǎn)量高低（初步篩選指標(biāo)）2.4.2.注意事項(xiàng)微生物培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)皿一般要倒置，主要是減少水分散失,避免培養(yǎng)基的成分（鹽分等）濃度變大,滲透壓發(fā)生變化不利于細(xì)菌生長(zhǎng).培養(yǎng)皿倒置也可以減少操作過(guò)程中落入平皿內(nèi)的灰塵細(xì)菌植入培養(yǎng)基而發(fā)生污染.另外,培養(yǎng)皿倒置取出時(shí)不容易脫蓋（尤其是若干個(gè)培養(yǎng)皿疊放的時(shí)候），防止不小心的污染。2.4. 劃線接種分離純化取準(zhǔn)備好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，用接種環(huán)無(wú)菌操作挑取能分解蛋白質(zhì)的菌落分區(qū)劃線。先在培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線34條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用同法通過(guò)第2次平行劃線部分作第

11、3次平行劃線和通過(guò)第3次平行劃線部分作第4次平行劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45d。培養(yǎng)結(jié)束后取出，第四次劃線部位出現(xiàn)的單個(gè)細(xì)菌形成的菌株就是純化的菌體。3.蛋白酶菌種的紫外線誘變3.1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庹T變劑對(duì)微生物的殺菌和誘變的雙重生物學(xué)效應(yīng)；學(xué)習(xí)紫外線誘變的方法級(jí)測(cè)定誘變劑最適量的方法。3.2實(shí)驗(yàn)原理基因突變可分為自然突變和誘變突變，許多物理因素、化學(xué)因素和生物因素對(duì)微生物都有誘變作用，能使突變率提高到自發(fā)突變水平以上的因素成為誘變劑。3.2.1紫外線誘變紫外線（UV）是一種最常用的物理誘變因素，UV的生物學(xué)效應(yīng)主要是它能引起DNA的結(jié)構(gòu)變化。紫外線的波長(zhǎng)在200380

12、nm之間，但對(duì)誘變最有效的波長(zhǎng)僅僅是在253265nm，一般紫外線殺菌燈所發(fā)射的紫外線大約有80%是254nm。DNA損傷或突變后，可被光激活酶所修復(fù)，故一般要求操作應(yīng)在紅光下進(jìn)行，處理后在暗處培養(yǎng)。隨著照射時(shí)間的增長(zhǎng)，殺菌率和突變率隨之提高，但照射時(shí)間繼續(xù)增加到一定程度時(shí)，其殺菌率隨之增大，而突變率卻降低。紫外線照射劑量、強(qiáng)度單位為爾格/mm²，由于測(cè)定困難，在實(shí)際誘變育種中常用UV照射時(shí)間或致死率表示相對(duì)劑量（其中以致死率表示具有實(shí)際意義）。3.3.紫外線誘變的流程出發(fā)菌株（純化）前培養(yǎng)期（培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期）離心、洗滌菌懸液制備誘變處理（活菌計(jì)數(shù)）取樣稀釋涂板（培養(yǎng)基提前制好）避光培

13、養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)出發(fā)菌株的來(lái)源可以是野生型菌株，本實(shí)驗(yàn)采用上一步驟純化的蛋白酶菌株，用接種環(huán)挑取一定量的菌接種到有LB培養(yǎng)液的試管中，放到搖床中37培養(yǎng)1d左右培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期。8000r離心5min，棄上清，用緩沖液或者滅菌蒸餾水重懸洗滌，離心，棄上清，重懸到盛有滅菌水的培養(yǎng)皿中。取50支試管，分為5組，組內(nèi)試管都需要編號(hào)110，組別試管編號(hào)一五組，所有試管中都加入9mL滅菌蒸餾水。第五組試管作為對(duì)照組，其中第一號(hào)試管直接取1mL沒(méi)有誘變的菌液，做梯度稀釋，取10-5,10-6,10-7,10-8試管中的菌液200L涂板，每個(gè)稀釋梯度涂布兩個(gè)培養(yǎng)皿，并作標(biāo)記。第一組到第四組的菌液誘變時(shí)間分別是30s，

14、60s，90s，120s，其涂板稀釋梯度為10-510-8，10-410-7，10-410-7，10-310-6，分別取菌液200L，每個(gè)培養(yǎng)皿涂布兩個(gè)培養(yǎng)皿并作標(biāo)記。從誘變后開(kāi)始的操作全部在紅光下操作，而且要求無(wú)菌環(huán)境，后將培養(yǎng)皿倒置疊放在黑色塑料袋中放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45d。將培養(yǎng)皿取出，計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌株的數(shù)目即CFU數(shù)，求出每個(gè)時(shí)間誘變后和誘變前的單位體積（m L）存活菌數(shù)。3.4制作劑量存活曲線以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，以致死率為縱坐標(biāo)，突變率為最高值，相應(yīng)的致死率即為最適劑量。致死率（%）=（對(duì)照每毫升CFU數(shù)-處理后每毫升CFU數(shù)）/對(duì)照每毫升CFU數(shù)*1004.菌種的鑒定4.1

15、.革蘭氏染色用接種環(huán)挑取純化菌株中的菌制成菌懸液，在載玻片上滴一滴菌液，再滴一滴大腸桿菌液作為對(duì)照（革蘭氏陰性桿菌），結(jié)晶紫1min，自來(lái)水沖洗，加碘液覆蓋涂面染色1min，95%乙醇數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色2030，水洗吸去水分，番紅復(fù)染23min，自來(lái)水沖洗，自然干燥，滴松柏油顯微鏡下油鏡觀察。本試驗(yàn)觀察的待測(cè)菌顯色為紫色，是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，大腸桿菌顯色紅色，印證陰性反應(yīng)。4.2.動(dòng)力試驗(yàn)（半固體）4.2.1.原理培養(yǎng)基為胰蛋白胨的半固體培養(yǎng)基，有動(dòng)力的細(xì)菌眼穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)。4.2.2.過(guò)程配置培養(yǎng)基：根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品,放入適當(dāng)大小的錐形瓶中。用量筒取一定量蒸餾水倒入錐形

16、瓶中,攪拌混勻，在電磁爐上稍稍加熱，使蛋白胨瓊脂等充分融解，分裝于三支無(wú)菌玻璃試管中，垂直待其冷凝。操作步驟：用接種針挑取待測(cè)細(xì)菌，然后垂直從半固體瓊脂表面插下去，插到離試管底部只有5mm左右時(shí)再垂直抽回來(lái)，即做一條刺線，培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。本試驗(yàn)待測(cè)菌種沒(méi)有在瓊脂表面以下生長(zhǎng)，認(rèn)為此菌種為嚴(yán)格好氧菌。4.3.VP試驗(yàn)根據(jù)培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確配配制培養(yǎng)基，分裝于三支試管中，培養(yǎng)48h后，加入甲液0.5mL，加入乙液0.2mL（40%KOH），觀察結(jié)果。本試驗(yàn)培養(yǎng)基顯色為紅色，陽(yáng)性。4.4.蔗糖、葡萄糖、甘露糖培養(yǎng)基試驗(yàn)除甘露糖培養(yǎng)基外，根據(jù)培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確配配制培養(yǎng)基，分裝于三支試管中，引入菌種，培

17、養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。本試驗(yàn)中培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色，菌種可以利用蔗糖和葡萄糖，陽(yáng)性。甘露糖培養(yǎng)基中接種細(xì)菌，保鮮膜封口，培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。本試驗(yàn)中培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色，陽(yáng)性。4.5.淀粉培養(yǎng)基試驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)瓊脂加0.2%可溶性淀粉配成的培養(yǎng)基澆注培養(yǎng)皿，接種待測(cè)菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后向菌落滴加碘液，觀察結(jié)果。本試驗(yàn)培養(yǎng)皿上菌落旁出現(xiàn)空圈，說(shuō)明細(xì)菌能夠利用淀粉，陽(yáng)性。4.6.檸檬酸鹽利用試驗(yàn)根據(jù)培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確配配制培養(yǎng)基，分裝于三支試管中，放置斜面，待其冷卻后用接種環(huán)挑取細(xì)菌劃線培養(yǎng)，一段時(shí)間后觀察。如果菌落可以分解檸檬酸鹽，則其產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，此時(shí)培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色，不能利用檸檬酸鹽為碳源則不生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基由綠變藍(lán)，陽(yáng)性。4.7.硝酸鹽培養(yǎng)基試驗(yàn)根據(jù)