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1、熒光顯微鏡熒光顯微鏡Fluorescence microscopy 熒光顯微鏡是用來觀察研究樣品熒光現(xiàn)象的光學(xué)顯微鏡,目前主要由光源、濾片系統(tǒng)、光路系統(tǒng)等組成。 廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域,可對(duì)組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、蛋白質(zhì)表達(dá)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等進(jìn)行定位、定性觀察及分析。第1頁(yè)/共42頁(yè)熒光顯微鏡熒光顯微鏡儀器型號(hào): OLYMPUS IX73 研究級(jí)倒置熒光顯微鏡Fluorescence microscopy參加過儀器使用培訓(xùn),通過網(wǎng)上儀器知識(shí)考試,網(wǎng)上提前預(yù)約,管理員審核通過方可使用。注意事項(xiàng):汞燈使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù);燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng);點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉,以免水銀蒸發(fā)不完全而損

2、壞電極,一般需要等15min 放置地點(diǎn) :401-1312室 管理員:吳安慶老師第2頁(yè)/共42頁(yè)顯微鏡參數(shù) 1主機(jī)功能:系統(tǒng)具有明場(chǎng)、相差、微分干涉、熒光觀察功能; 2透射光光源:外置電源供應(yīng)器100W鹵素?zé)敉干涔庹彰餮b置; 3物鏡:長(zhǎng)工作距離萬能平場(chǎng)半復(fù)消色差相差(熒光)物鏡:4(數(shù)值孔徑N.A.0.13)、10(N.A.0.3),20(N.A.0.7)、40(N.A.0.6),60X(N.A.0.7) 4物鏡轉(zhuǎn)盤:6孔以上編碼型物鏡轉(zhuǎn)盤,與軟件連接后能夠保存物鏡信息,隨物鏡轉(zhuǎn)換能夠自動(dòng)校準(zhǔn)標(biāo)尺; 5載物臺(tái):精確定位功能手動(dòng)載物臺(tái);具備XY鎖定和復(fù)位功能, 可重現(xiàn)標(biāo)本位置,游標(biāo)尺的精度100

3、m; 6聚光鏡:超長(zhǎng)工作距離萬能聚光鏡,孔位數(shù)5;第3頁(yè)/共42頁(yè) 7熒光照明器:主機(jī)反射熒光系統(tǒng)可采用復(fù)眼照明技術(shù),平均熒光視野亮度,便于量化分析; 8. 熒光光源:130W以上長(zhǎng)壽命熒光光源, 光導(dǎo)管傳輸,長(zhǎng)度1.5米,符合RoHS 和WEEE法令要求; 9. 高通透性熒光激發(fā)塊:紫外, BP340-390, DM410,BA420-IF 藍(lán)色,BP460-495, DM505,BA510-IF 綠色,BP530-550, DM570,BA575-IF; 10熒光激發(fā)塊轉(zhuǎn)盤:編碼型熒光激發(fā)塊轉(zhuǎn)盤,7孔位設(shè)計(jì),便于今后擴(kuò)展應(yīng)用,無需工具即可更換濾色鏡組,與軟件連接后能夠隨圖片保存熒光濾色鏡組

4、信息; 11濾色鏡:透射用日光平衡濾色片、綠色濾色片,熒光用減光片ND6/ND25; 12DIC附件:40X、60X物鏡配置微分干涉附件。顯微鏡參數(shù)第4頁(yè)/共42頁(yè) 基本原理基本原理激發(fā)濾鏡:激發(fā)濾鏡:從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。(一般有紫外、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片)(一般有紫外、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片) 帶通濾色鏡帶通濾色鏡( (BP)BP):有寬、窄帶之分。如:有寬、窄帶之分。如:BP450-490BP450-490 長(zhǎng)、短通濾色鏡組合長(zhǎng)、短通濾色鏡組合(LP LP + + KPKP):):LP450 + KP490LP450 + KP490 雙色鏡:雙

5、色鏡:雙色分光鏡;反射短波長(zhǎng),透過長(zhǎng)波長(zhǎng)。雙色分光鏡;反射短波長(zhǎng),透過長(zhǎng)波長(zhǎng)。阻斷濾鏡:阻斷濾鏡:吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡;選擇并讓特異的熒光透過,表現(xiàn)出專一的熒光色彩。吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡;選擇并讓特異的熒光透過,表現(xiàn)出專一的熒光色彩。 多為長(zhǎng)通濾色鏡;多為長(zhǎng)通濾色鏡;LP490LP490紫外藍(lán)綠高壓汞燈被熒光探針染色的生物樣本激發(fā)被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的熒光光學(xué)圖像光學(xué)成像濾鏡分光第5頁(yè)/共42頁(yè)標(biāo)本制作要求 (一)載玻片 載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔,厚度均勻,無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。 (二)蓋玻

6、片 蓋玻片厚度在0.17mm左右,光潔。 (三)標(biāo)本 組織切片或其他標(biāo)本不能太厚,如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部,而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外,細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋,影響判斷。 (四)封裱劑 封裱劑常用甘油,必須無自發(fā)熒光,無色透明,熒光的亮度在pH8.59.5時(shí)較亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。 (五)鏡油 一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí),必須使用鏡油,最好使用特制的無熒光鏡油,也可用上述甘油代替。第6頁(yè)/共42頁(yè)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): :1 1、為延長(zhǎng)汞燈壽命,打開汞燈后不可立即關(guān)閉,以免水銀蒸發(fā)不完全而

7、損壞電極,一般需要等15分鐘后才能關(guān)閉。2、汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動(dòng),否則燈內(nèi)汞蒸氣尚未恢復(fù)到液態(tài),內(nèi)阻極小,再次施加電壓,會(huì)引起短路,導(dǎo)致汞燈爆炸。這樣不僅損壞電器,更重要的是汞蒸氣溢出,將導(dǎo)致工作室污染。故關(guān)閉汞燈之后,不能馬上再次打開,必須等待至少30分鐘。開了不能馬上關(guān),關(guān)了不能馬上開。開了不能馬上關(guān),關(guān)了不能馬上開。第7頁(yè)/共42頁(yè)熒光顯微鏡的不足熒光顯微鏡的不足: :1.無法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光,透射光的同時(shí)采集,無法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)采集及共定位。2.熒光散射光太強(qiáng),造成實(shí)際分辨率的大大下降。3.熒光漂白及對(duì)細(xì)胞組織的照射損傷。4.無法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3D的工作。5.只能在

8、二維環(huán)境下觀察。6.樣品不能太厚。第8頁(yè)/共42頁(yè)激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡(LaserscanningConfocalMicroscopy,LSCM ) 以激光作為光源,采用光源針孔與檢測(cè)針以激光作為光源,采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛聚焦技術(shù),對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描,以孔共軛聚焦技術(shù),對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描,以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)第9頁(yè)/共42頁(yè)共聚焦顯微鏡的類型 點(diǎn)(慢)掃描共聚焦顯微鏡 分辨率高,圖像清晰,采集圖像速度慢 線(狹縫)掃描共聚焦顯微鏡 分辨率低,速度快,噪音高 轉(zhuǎn)盤式掃描共聚焦顯微鏡 性能介于上述兩者之間第10頁(yè)/共4

9、2頁(yè)激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡OLYMPUS FV1200 研究級(jí)倒置熒光顯微鏡 參加過儀器使用培訓(xùn),通過網(wǎng)上儀器知識(shí)考試,網(wǎng)上提前預(yù)約,管理員審核通過方可使用。注意事項(xiàng):1、開機(jī)和關(guān)機(jī)需要管理員來操作2、換樣本的時(shí)候需要將物鏡降下來,或點(diǎn)擊軟件上Escape3、能用普通熒光顯微鏡觀察拍照的樣本就不要用共聚焦顯微鏡,節(jié)約激光器壽命。放置地點(diǎn):401-1312室管理員:吳安慶老師收費(fèi):200元/小時(shí) 第11頁(yè)/共42頁(yè)上轉(zhuǎn)換共聚焦掃描顯微鏡上轉(zhuǎn)換共聚焦掃描顯微鏡多線氬離子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm)半導(dǎo)體激光器:405 nm, 559 nm, 635 nm

10、上轉(zhuǎn)換專用激光器:808 nm,980 nm活細(xì)胞CO2培養(yǎng)系統(tǒng)OLYMPUS FV1200放置地點(diǎn):401-1111管理員:吳艷普通激光共聚焦顯微鏡的功能上轉(zhuǎn)換材料的成像檢測(cè)普通共聚焦:400元/小時(shí)上轉(zhuǎn)換共聚焦:1000元/小時(shí)院內(nèi)5折,校內(nèi)8 折只允許3天后15天內(nèi)的預(yù)約第12頁(yè)/共42頁(yè)儀器參數(shù)儀器參數(shù)針孔光欄分光鏡發(fā)射熒光單色器及檢測(cè)器多線氬離子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm)半導(dǎo)體激光器:405 nm, 559 nm, 635 nm上轉(zhuǎn)換專用激光器:808 nm,980 nm計(jì)算機(jī)圖像存儲(chǔ)與處理及控制系統(tǒng)IX83第13頁(yè)/共42頁(yè)儀器參數(shù)儀器參數(shù)第14頁(yè)/共4

11、2頁(yè)儀器參數(shù)儀器參數(shù)第15頁(yè)/共42頁(yè)儀器參數(shù)儀器參數(shù)第16頁(yè)/共42頁(yè)基本原理基本原理第17頁(yè)/共42頁(yè)激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片基本原理基本原理第18頁(yè)/共42頁(yè)入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器基本原理基本原理第19頁(yè)/共42頁(yè)入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器基本原理基本原理第20頁(yè)/共42頁(yè)儀器特點(diǎn) 1、光源 用激光做光源,從理論上消除了色差。因?yàn)榧す獾膯紊詮?qiáng)、光源波束集中、波長(zhǎng)相同。2、采用了共扼聚焦技術(shù) 在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)小孔,將焦平面以外的雜散光擋住,消除了球差。第21頁(yè)/共42頁(yè)3、點(diǎn)與面掃描技術(shù)

12、共聚焦顯微鏡:將樣品分解成二維或三維空間上的無數(shù)點(diǎn),用十分細(xì)小的激光束(點(diǎn)光源)逐點(diǎn)逐行掃瞄、成像,通過計(jì)算機(jī)軟件組合,最后得到一個(gè)整體平面的或立體的像。4、圖像信號(hào)及處理: 光電倍增管放大信號(hào),計(jì)算機(jī)采集和處理光信號(hào)。儀器特點(diǎn)第22頁(yè)/共42頁(yè)更靈敏: 共聚焦顯微鏡采用了光電倍增技術(shù),可將很微弱的熒光信號(hào)放大。只要有信號(hào)就能被檢測(cè)到。定位更精確: 不僅可以定位到細(xì)胞水平,還可以定位到亞細(xì)胞水平、和分子水平。這也是熒光標(biāo)記的抗體被稱為分子探針的原因。光漂白和熒光淬滅作用?。?由于利用光源光束點(diǎn)掃描,檢測(cè)過程快,時(shí)間短,計(jì)算機(jī)精確控制激發(fā)光強(qiáng)度,光漂白和熒光淬滅作用很小。激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)激

13、光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)第23頁(yè)/共42頁(yè) 石蠟切片,冰凍切片,涂片,印片、鋪片,培養(yǎng)的粘附細(xì)胞,懸浮細(xì)胞,各種染色,非染色熒光標(biāo)記的組織(包括活組織) 激光共聚焦顯微鏡的樣本激光共聚焦顯微鏡的樣本第24頁(yè)/共42頁(yè)共聚焦顯微鏡的應(yīng)用共聚焦顯微鏡的應(yīng)用1)高清晰成像2)半定量熒光強(qiáng)度分析3)熒光探針表達(dá)量測(cè)定4)分層掃描5)多種熒光標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)第25頁(yè)/共42頁(yè) 1 1、高清晰成像 激光共聚焦顯微鏡因使用共扼光路使非焦平面的光線被抑制,減少了成像的干擾,以及使用光色較純的激光,所以成像分辨率可達(dá)普通光學(xué)顯微鏡的1.4倍。 可以清晰的表現(xiàn)某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。第26頁(yè)/共42頁(yè)鼠成纖維細(xì)胞單克隆anti-t

14、ubulin標(biāo)記 第27頁(yè)/共42頁(yè)渦蟲綱扁蟲肌動(dòng)蛋白絲鬼筆環(huán)肽第28頁(yè)/共42頁(yè)培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞吖叮橙染色第29頁(yè)/共42頁(yè) 2 2、半定量熒光強(qiáng)度分析 熒光信號(hào)通過光電倍增管轉(zhuǎn)化為電信號(hào),經(jīng)過電腦分析可對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。隨機(jī)圈取細(xì)胞隨機(jī)圈取細(xì)胞可得到所圈細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度值可得到所圈細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度值第30頁(yè)/共42頁(yè)利用熒光與透射光同時(shí)掃描,觀測(cè)相等面積內(nèi)不同組間熒光標(biāo)記蛋白表達(dá)的差異。3 3、熒光標(biāo)記表達(dá)量測(cè)定第31頁(yè)/共42頁(yè) 4 4、分層掃描(切片掃描) 按共扼聚焦的原理,通過調(diào)節(jié)針孔的大小,可控制樣品掃描層面的厚度。即樣品中相當(dāng)薄的一層被探測(cè)到,而其他層面不影響成像。

15、 當(dāng)觀測(cè)較厚樣品時(shí),普通透射光不能透過樣品,則可以通過切片掃描檢測(cè)熒光的方法來觀測(cè)。第32頁(yè)/共42頁(yè) 較厚層面 較薄層面 人血管內(nèi)皮細(xì)胞PI標(biāo)記觀測(cè)損傷。標(biāo)記細(xì)胞為損傷細(xì)胞。 4 4、分層掃描(切片掃描)第33頁(yè)/共42頁(yè) 連續(xù)分層掃描,可得到CT片類似的效果,對(duì)樣品Z軸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)重組,可觀測(cè)空間結(jié)構(gòu),空間定位,三維重組。 4 4、分層掃描(切片掃描)第34頁(yè)/共42頁(yè) 5 5、多色熒光標(biāo)記檢測(cè)普通熒光顯微鏡每次只能觀測(cè)一種熒光,要觀測(cè)多種熒光標(biāo)記的樣品需要多次觀測(cè),對(duì)樣品損傷大。激光共聚焦顯微鏡可以多激光多通道同時(shí)掃描,多通道同時(shí)探測(cè)。綠色:SYBR 14染色,活精子紅色

16、:PI染色,死精子肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞藍(lán)色:Hoechst 33342 ,染DNA紅色:PI,染核仁RNA綠色:Alexa Fluor 488染肌絲蛋白第35頁(yè)/共42頁(yè)常用熒光探針介紹1.細(xì)胞活性探針2.細(xì)胞器探針3.細(xì)胞骨架探針4.核酸探針5.細(xì)胞內(nèi)離子探針第36頁(yè)/共42頁(yè)細(xì)胞活性探針 活細(xì)胞探針:吖叮橙(AO)是一種離子泵活性指示劑,弱堿性,在動(dòng)物細(xì)胞溶酶體、植物液泡和含胰島素的分泌小粒等酸性細(xì)胞器中濃集。 死細(xì)胞探針:碘化丙錠(PI)膜不透性DNA探針,細(xì)胞膜破損后與DNA結(jié)合第37頁(yè)/共42頁(yè)核酸探針Hoechst 與DNA結(jié)合,分辨率高 Hoechst 33258 Hoechst 33342 毒性低 先進(jìn)行免疫染色再進(jìn)行Hoechst染色DAPI 與雙鏈DNA結(jié)合熒光增強(qiáng)20倍,與單鏈DNA結(jié)合無熒光增強(qiáng)。熒光強(qiáng)度比H

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