福林酚測(cè)蛋白質(zhì) (1)

1、 學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法原理和方法 熟練熟練分光光度計(jì)，微量移液器分光光度計(jì)，微量移液器的操作以及的操作以及標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)曲線的制作的制作 第一步第一步雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)（蛋白質(zhì)與堿性銅試劑反應(yīng)）（蛋白質(zhì)與堿性銅試劑反應(yīng)） 在堿性條件下蛋白質(zhì)的肽鍵與在堿性條件下蛋白質(zhì)的肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)螯合，形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物銅復(fù)合物 第二步第二步與福林與福林- -酚試劑反應(yīng)酚試劑反應(yīng)在堿性條件下在堿性條件下 ，這種被作用的蛋白質(zhì)上的酚類基團(tuán)極不穩(wěn)定，這種被作用的蛋白質(zhì)上的酚類基團(tuán)極不穩(wěn)定，很容易還原福林酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸，生成鎢藍(lán)和鉬藍(lán)很容易還原福林酚試劑中的

2、磷鎢酸和磷鉬酸，生成鎢藍(lán)和鉬藍(lán)的混合物，呈藍(lán)色。的混合物，呈藍(lán)色?？衫梅止夤舛扔?jì)測(cè)得可利用分光光度計(jì)測(cè)得650nm650nm的的ODOD值，濃度大小跟值，濃度大小跟ODOD值成值成正比正比y=y=kx+bkx+b ODOD值是值是optical densityoptical density（光密度）：（光密度）： 入射光強(qiáng)度與透射光強(qiáng)度之比值的常用對(duì)數(shù)值入射光強(qiáng)度與透射光強(qiáng)度之比值的常用對(duì)數(shù)值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：(1）選擇標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(牛血清白蛋白），配制一定濃度母液(2) 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度，測(cè)定對(duì)應(yīng)的OD值 (3）根據(jù)濃度和OD值得回歸方程即標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用excele軟件 如何

3、制作？ 如何評(píng)估？x1y1x2y2x3y3.Xnyny=y=kx+bkx+b 0123456789101112250 g 250 g /ml/ml牛血牛血清白蛋清白蛋白（白（mlml） 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.0待測(cè)待測(cè)樣品樣品 1.0待測(cè)待測(cè)樣品樣品 水（水（mlml） 1.00.80.80.60.60.40.40.20.20000堿性銅堿性銅（mlml） 5555555555555搖勻，放置10minFolin試劑(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5迅速搖勻，室溫放置迅速搖勻，室溫放置2020分鐘，

4、測(cè)分鐘，測(cè)650nm OD650nm OD值值 以以0 0號(hào)管為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上以波長(zhǎng)號(hào)管為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上以波長(zhǎng)650nm650nm比色，讀取光密比色，讀取光密度度 值（值（ODOD值），標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量值），標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量g g （或者標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度）作為橫坐標(biāo)，（或者標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度）作為橫坐標(biāo)，ODOD 值作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線寫出回歸方程，根據(jù)待測(cè)樣品值作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線寫出回歸方程，根據(jù)待測(cè)樣品ODOD值計(jì)算蛋值計(jì)算蛋 白質(zhì)含量。白質(zhì)含量。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 及時(shí)做好標(biāo)記及時(shí)做好標(biāo)記 加入試劑后應(yīng)立即混勻加入試劑后應(yīng)立即混勻 測(cè)定所加入的蛋白質(zhì)量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)

5、測(cè)定所加入的蛋白質(zhì)量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)分光光度計(jì)的使用方法分光光度計(jì)的使用方法 設(shè)置波長(zhǎng)設(shè)置波長(zhǎng) 設(shè)置樣品池個(gè)數(shù)設(shè)置樣品池個(gè)數(shù) 調(diào)零調(diào)零 測(cè)定測(cè)定開啟機(jī)器，調(diào)節(jié)所需的波長(zhǎng)，設(shè)置樣品池個(gè)數(shù)開啟機(jī)器，調(diào)節(jié)所需的波長(zhǎng)，設(shè)置樣品池個(gè)數(shù)空白對(duì)照管調(diào)零（一定放在離自己最近的那個(gè)樣品池）空白對(duì)照管調(diào)零（一定放在離自己最近的那個(gè)樣品池）將待測(cè)樣品液放入比色皿（將待測(cè)樣品液放入比色皿（2/32/3高度），并將比色皿放入樣品池內(nèi)，蓋好蓋高度），并將比色皿放入樣品池內(nèi)，蓋好蓋子，測(cè)光密度值（子，測(cè)光密度值（ODOD值），按上下鍵翻看其他樣品池的數(shù)據(jù)值），按上下鍵翻看其他樣品池的數(shù)據(jù)測(cè)量完畢，一定把比色杯用自來(lái)水和

6、蒸餾水重新洗凈，倒置于濾紙上晾干測(cè)量完畢，一定把比色杯用自來(lái)水和蒸餾水重新洗凈，倒置于濾紙上晾干比色皿有光面和毛面，勿用手觸摸光面，使用時(shí)光面對(duì)準(zhǔn)光路。裝液體時(shí)，需達(dá)到比色皿2/3左右；若液體不慎溢出，需用紙巾吸干，儀器如果沾有液體，請(qǐng)迅速擦干。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)微量移液器的使用微量移液器的使用 原理 微量移液器是根據(jù)“虎克定律”設(shè)計(jì)的，“在一定限度內(nèi)彈簧伸展的長(zhǎng)度與彈力成正比”：也就是微量加樣器吸入液體的容量與加樣器內(nèi)的彈簧拉伸長(zhǎng)度成正比。 常見種類 0.510l 550l 10100l 20200l (讀數(shù)窗顯示20200, 每轉(zhuǎn)1檔1l) 1001000l(讀數(shù)窗顯示1001000, 每轉(zhuǎn)

7、1檔為 5l)1：選擇量程 根據(jù)轉(zhuǎn)移液體的量，選擇正確量程的微量移液器2：調(diào)節(jié)吸量體積： 將微量移液器調(diào)至所需體積，千萬(wàn)不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出最大值和最小值；操作步驟操作步驟 3 3：吸量：吸量用移液器的吸桿插上合適的吸頭，旋緊。握緊微量移液器，用大拇指按至第一檔，將吸頭插入溶液中。然后松開大拇指，慢慢釋放按鈕以吸取液體（否則液體進(jìn)入吸嘴太快，導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部）；然后將微量移液器移出液面。釋放液體時(shí)，槍頭接觸在容器壁上，先慢慢按至第一檔，停留12秒后，再按至第二檔以排出所有液體。操作步驟操作步驟4. 更換吸頭： 吸取不同的液體，一定要更換槍頭，防止試劑交叉污染，更換槍頭時(shí)，對(duì)著廢棄桶，輕輕按下卸載吸頭的彈射器，吸頭自然脫落在廢棄桶內(nèi)。5. 微量移液器的放置： 實(shí)驗(yàn)完畢后，將移液器調(diào)回到接近最大量程，使彈簧處于松弛狀態(tài)，放到或者懸掛在架子上。操作步驟操作步驟1. 吸取不同的液體時(shí)，切記要更換吸頭，2. 調(diào)節(jié)移液器時(shí)，動(dòng)作要輕緩，千萬(wàn)不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出最大值和最小值，否則會(huì)造成損壞。3. 吸取液體時(shí)，動(dòng)作要輕緩，防止液體隨著氣流進(jìn)入移液器的上部；4. 帶有殘余液體吸嘴的移液器不能平放。5. 每次實(shí)驗(yàn)完畢后將微量移液器調(diào)