高密度培養(yǎng) 基因工程菌高密度培養(yǎng)

1、基因工程菌高密度培養(yǎng)基因工程菌高密度培養(yǎng)high cell-density culture浙江工業(yè)大學(xué)浙江工業(yè)大學(xué) 杭州杭州 課前思考：課前思考： 1、為什么涼開水養(yǎng)不活魚？、為什么涼開水養(yǎng)不活魚？ 2、為什么菜市場賣魚的地方需、為什么菜市場賣魚的地方需要一個鼓氣設(shè)備？要一個鼓氣設(shè)備？ 3、什么物質(zhì)在水中的溶解度隨、什么物質(zhì)在水中的溶解度隨著溫度的升高而降低？著溫度的升高而降低？ 4、進(jìn)一步增加魚的密度，而且、進(jìn)一步增加魚的密度，而且要保證魚不死，你能想出其它辦法要保證魚不死，你能想出其它辦法嗎？嗎？ 高密度培養(yǎng)：高密度培養(yǎng)： 單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量高于單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量高于常規(guī)的培養(yǎng)模式。常規(guī)的

2、培養(yǎng)模式。e.coli最高密度理論值：最高密度理論值：400g/l（dcw dry cell weight）國外達(dá)到：國外達(dá)到：200g/l國內(nèi)小于國內(nèi)小于50g/l高密度培養(yǎng)的意義：高密度培養(yǎng)的意義：1、節(jié)約誘導(dǎo)劑的用量：、節(jié)約誘導(dǎo)劑的用量：摩爾濃度摩爾濃度相同，體積越小，誘導(dǎo)劑用量越少。相同，體積越小，誘導(dǎo)劑用量越少。2、節(jié)約勞動強(qiáng)度；、節(jié)約勞動強(qiáng)度；3、強(qiáng)化純化工藝，單位體積細(xì)、強(qiáng)化純化工藝，單位體積細(xì)胞數(shù)量越大，產(chǎn)物的濃度越高，胞數(shù)量越大，產(chǎn)物的濃度越高，純化越方便，收率越高。純化越方便，收率越高。實現(xiàn)高密度培養(yǎng)的技術(shù)關(guān)鍵：實現(xiàn)高密度培養(yǎng)的技術(shù)關(guān)鍵：1、解決氧的供應(yīng)問題、解決氧的供應(yīng)問

3、題 a、溶解氧（、溶解氧（dissolved oxygen) 0.25mm 為飽和濃度為飽和濃度 b、氣液接觸面積越大，供氧越快；、氣液接觸面積越大，供氧越快； c、氧氣的分壓越大，供氧越快、氧氣的分壓越大，供氧越快；2、解決養(yǎng)料的供給問題、解決養(yǎng)料的供給問題 微生物細(xì)胞的生長需要供應(yīng)微生物細(xì)胞的生長需要供應(yīng)足夠的養(yǎng)料，包括：足夠的養(yǎng)料，包括：a、碳源：葡萄糖、甘油、碳源：葡萄糖、甘油b、氮源：氨水、尿素、銨鹽等、氮源：氨水、尿素、銨鹽等c、磷：磷是、磷：磷是dna的組成成分的組成成分 酵母膏、蛋白胨等可以提供全面的營養(yǎng)酵母膏、蛋白胨等可以提供全面的營養(yǎng)3、解決環(huán)境毒性問題、解決環(huán)境毒性問題

4、部分微生物代謝產(chǎn)物對細(xì)胞有部分微生物代謝產(chǎn)物對細(xì)胞有一定的毒性。比如乙酸（酵解產(chǎn)物）一定的毒性。比如乙酸（酵解產(chǎn)物） ph改變改變4、防止質(zhì)粒丟失、防止質(zhì)粒丟失 丟失質(zhì)粒的細(xì)胞具有生長優(yōu)丟失質(zhì)粒的細(xì)胞具有生長優(yōu)勢，但是它不含目的基因，所勢，但是它不含目的基因，所以不能合成產(chǎn)物。以不能合成產(chǎn)物。解決方案解決方案1、關(guān)于供氧：、關(guān)于供氧：a、通入空氣、攪拌、通入空氣、攪拌b、提高攪拌速度、提高攪拌速度c、提高罐壓，增加氧氣的分壓、提高罐壓，增加氧氣的分壓d、通入純氧、通入純氧2、養(yǎng)料供給、養(yǎng)料供給補(bǔ)料：補(bǔ)料：碳源碳源 補(bǔ)加葡萄糖、甘油、甲醇等補(bǔ)加葡萄糖、甘油、甲醇等 氮源氮源 自動補(bǔ)加氨水、同時調(diào)

5、節(jié)自動補(bǔ)加氨水、同時調(diào)節(jié)ph 磷源磷源 kh2po4/k2hpo4 同時緩沖同時緩沖ph3、關(guān)于毒性代謝產(chǎn)物和、關(guān)于毒性代謝產(chǎn)物和ph變化問題變化問題采用流加的方式：采用流加的方式： 細(xì)水長流，防止有毒代謝產(chǎn)物積累，抑細(xì)水長流，防止有毒代謝產(chǎn)物積累，抑制細(xì)胞生長。制細(xì)胞生長。自動維持自動維持ph：補(bǔ)加氨水或磷酸鹽緩沖液補(bǔ)加氨水或磷酸鹽緩沖液關(guān)于質(zhì)粒丟失：關(guān)于質(zhì)粒丟失： 在培養(yǎng)基中添加抗生素，丟失質(zhì)在培養(yǎng)基中添加抗生素，丟失質(zhì)粒的細(xì)胞不能生長或死亡，即給予粒的細(xì)胞不能生長或死亡，即給予適當(dāng)?shù)倪x擇壓力。適當(dāng)?shù)倪x擇壓力。 氨芐青霉素易失活，培養(yǎng)中氨芐青霉素易失活，培養(yǎng)中期補(bǔ)加氨芐青霉素，維持選擇壓期補(bǔ)加氨芐青霉素，維持選擇壓力力誘導(dǎo)時機(jī)的選擇也非常重要誘導(dǎo)時機(jī)的選擇也非常重要 在生長前期，無誘導(dǎo)劑可以使在生長前期，無誘導(dǎo)劑可以使細(xì)胞快速生長，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)目細(xì)胞快速生長，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)目的基因表達(dá)會抑制細(xì)胞的增殖能力。的基因表達(dá)會抑制細(xì)胞的增殖能力。所以，過早誘導(dǎo)會影響細(xì)胞密度。所以，過早誘導(dǎo)會影響細(xì)胞密度。