固定化載體的篩選

1、第二章固定化載體的篩選固定化酶的載體材料是影響固定化酶性能的重要因素之一。酶的固定化載體通常需要具備的性質(zhì)有以下幾點(diǎn)：帶有能與酶發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)；具有大的 比表面積和多孔結(jié)構(gòu)；不溶于水；機(jī)械剛性和穩(wěn)定性都非常好；能防止微 生物的降解作用。此外，還希望載體材料無毒、無污染、成本低廉、來源豐富。目前使用和研究中的固定化酶載體材料種類繁多，按其化學(xué)組成可以分為無機(jī)載 體、天然高分子載體、合成高分子載體等。2.1實(shí)驗(yàn)材料表2-1實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱級(jí)別生產(chǎn)廠家D-葡萄糖AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司酵母膏AR南京寧試化學(xué)試劑有限公司蛋白胨BROXOID瓊脂AR上?；瘜W(xué)試劑廠磷酸二氫鉀AR廣東汕頭市西隴化學(xué)廠

2、磷酸氫二鈉AR廣東汕頭市西隴化學(xué)廠考馬斯亮藍(lán)G-250上海生工生物工程上海有限公司氯化鈉AR上海四赫維化學(xué)公司異丙醇AR天津市福晨化學(xué)試劑廠離子交換樹脂安徽二星樹脂科技有限公司戊二醛ARSiama公司蔗糖AR西隴化工股份有限公司乳糖AR中國(guó)惠興生化試劑有限公司乙醇AR無錫市亞盛化工有限公司氫氧化鈉AR西隴化工有限公司濃鹽酸AR上海中試生化表2-2實(shí)驗(yàn)儀器儀器名稱規(guī)格與型號(hào)生產(chǎn)廠家酶標(biāo)儀Power Wave XS美國(guó)BIO-TECH 公司恒溫培養(yǎng)箱PYX-DHS-40*50-BS上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠超凈工作臺(tái)SW-CJ-1B蘇州凈化設(shè)備廠電子天平BP110SSartorias精密PH計(jì)Cole P

3、armerCole Parmer In strume nt Co.隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱PYX-DHS上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠手提式壓力蒸汽火菌鍋YXQSG41280上海醫(yī)用核子儀器廠電熱恒溫干燥箱HG202-1南京實(shí)驗(yàn)儀器廠752紫外光柵分光光度計(jì)752上海精密科學(xué)儀器有限公司SK-1TGL-16G快速混勻器 高速離心機(jī)2.2 實(shí)驗(yàn)方法3-呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液的制備菌株：節(jié)桿菌 Aspergillusoryzae arilate nsis NJEM01，本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得。工程菌 E.coli BL21（DE3）/pET22b-fru6,本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。培養(yǎng)基：LB氨芐固體培養(yǎng)基（g/l）:酵

4、母粉5,蛋白胨10, NaCl 10,瓊脂粉18,滅菌 冷卻后加入無菌的氨芐青霉素（Amp ），使其終濃度為100ug/ml。LB氨芐液體培養(yǎng)基（g/l）:酵母粉5，蛋白胨10, NaCl 10,瓊脂粉18,滅菌使用時(shí)加 入無菌的氨芐青霉素（Amp ），使其終濃度為100ug/ml。從凍存管中轉(zhuǎn)接重組菌 E.coli BL21（DE3）/pET22b-fru6 于LB氨芐固體培養(yǎng)基上，37 C培養(yǎng)12h后，挑取一環(huán)菌于 LB氨芐液體培養(yǎng)基中 37C, 200r/mim,培養(yǎng)12h。以2% （v/v） 的接種量接入50ml新LB氨芐液體培養(yǎng)基中于 37 C, 200r/mim培養(yǎng)2h后，加入IP

5、TG致終 濃度為1mmol/l , 30 C誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液以5000/mim，離心15min，收集上清即為3呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液，4C保存。3呋喃果糖苷酶Fru6酶活定義及反應(yīng)體系反應(yīng)體系：取離心后上清酶液50卩加入950卩蔗糖底物（1mol/l , PH6.47PBS緩沖）中，置于35C反應(yīng)30min，反應(yīng)后煮沸10min。酶活力單位的定義為：35 C, PH6.47條件下，每分鐘水解蔗糖底物（1mol/L ）產(chǎn)生1 pmol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U即umol/（ml.min）。固定化載體材料的篩選大孔樹脂的預(yù)處理（見圖2-1 ）稱取大孔樹脂1g95%乙

6、醇在30C, 200rpm搖床中浸泡 2h加入5ml PH7的磷酸緩沖混合，在 30C, 200r/mim搖床中放置12小時(shí)取出烘干，預(yù)處理完成圖2-1大孔樹脂初步篩選大孔樹脂樹脂類型功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)D301弱堿性陰離子交換樹脂-N+(CH 3)2苯乙烯-二乙烯苯D201強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂-N+(CH3)3苯乙烯-二乙烯苯D101大孔吸附樹脂非極性交聯(lián)聚苯乙烯AB-8大孔吸附樹脂弱極性交聯(lián)聚苯乙烯1BS-65大孔吸附樹脂非極性交聯(lián)聚苯乙烯DM301大孔吸附樹脂中極性交聯(lián)聚苯乙烯表2-3 大孔樹脂稱取D301、D201、D101、AB-8、BS-65、DM301六種樹脂（見表 2-3）各1g,經(jīng)過

7、預(yù)處 理后與酶、戊二醛混合，放在200rpm、35 C 搖床固定4h,測(cè)量酶活，選擇合適的樹脂類 型。弱堿性大孔樹脂的篩選大孔樹脂樹脂類型功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)D301弱堿性陰離子交換樹脂-N + (CH 3)2苯乙烯-二乙烯苯D311弱堿性陰離子交換樹脂-NH2丙烯酸甲脂、D318弱堿性陰離子交換樹脂-NH2丙烯酸甲脂D330弱堿性陰離子交換樹脂-NH 2、=NH、=N、=N-環(huán)氧系D345弱堿性陰離子交換樹脂-NH 2、=NH、三 N酚醛系表2-4弱堿性離子交換樹脂稱取D301、D311、D318 D330和D345五種弱堿性大孔樹脂（見表 2-4）各1g經(jīng)過預(yù) 處理后與酶、戊二醛混合，放在200r

8、pm、35 C 搖床里反應(yīng)4h,固定完成，測(cè)量酶活選擇 合適的樹脂基團(tuán)類型。將301、D311、D318三種樹脂的固定化酶循環(huán)反應(yīng)5次，觀察重復(fù)利用性。選出其中最好的載體。2.3結(jié)果和討論大孔樹脂初步篩選圖 2-2 : D301、D201、D101、AB-8、BS-65、DM301 固定化效果從圖2-2中可以看出，D301大孔弱堿性離子交換樹脂固定化效果最好。D101等非極性樹脂與酶進(jìn)行吸附交聯(lián)時(shí)，戊二醛不能與樹脂交聯(lián)，因此酶與載體的固定化方式僅僅是吸附，而我們的固定化體系是水相，酶的表面是親水性氨基酸，吸附的酶在水相中容易從載體中脫離，固定化效果不理想。D201是屬于強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，而

9、酶在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中容易失活，所以固定化效果不及D301弱堿性樹脂。所以弱堿性離子交換樹脂可能適合于酶的固定化，我們選擇其他 4種弱堿性陰離子交換樹脂，從中選擇出最好的樹脂。弱堿性大孔樹脂的篩選圖 2-3 : D301、D311、D318 D330 和 D345 固定化效果從圖2-3可以看出，D301、D311和D318三種大孔樹脂固定化效果要比D330和D345好。D301、D311和D318三種載體的表面都是伯胺基，而D330和D345兩種載體上表面基團(tuán)有伯胺、仲胺和叔胺，可能仲胺與叔胺不能與戊二醛發(fā)生交聯(lián)，這兩種載體的伯胺基少于其他三種，所以固定化效率不及帶有伯胺基的樹脂。因此我們實(shí)驗(yàn)選擇帶有伯胺基的大孔樹脂作為固定化材料。接下來對(duì)第三種帶有氨基的樹脂進(jìn)行重復(fù)批次實(shí)驗(yàn)，選擇重復(fù)利用性好的樹脂。圖2-4 D301大孔樹脂重復(fù)利用性實(shí)驗(yàn)圖2-5 D311大孔樹脂重復(fù)利用性實(shí)驗(yàn)圖2-6 D318大孔樹脂重復(fù)利用性實(shí)驗(yàn)圖2-7三種大孔樹脂重復(fù)利用性（5批）從圖2-4到圖2-7四幅圖中可以看出，在前五批批次上，三種樹