流式抗體及熒光染料的選擇PPT課件

1、1 抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)12流式抗體的選擇、熒光染料應(yīng)用流式抗體的選擇、熒光染料應(yīng)用第1頁(yè)/共21頁(yè)2抗原抗體反應(yīng) 抗原抗體反應(yīng)的原理 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) 影響抗原抗體反應(yīng)的因素第2頁(yè)/共21頁(yè)3抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異 性結(jié)合反應(yīng)。 抗原與抗體的特異性結(jié)合既會(huì)在體內(nèi)發(fā)生，亦可以在體外進(jìn)行，體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)習(xí)慣上稱(chēng)作血清學(xué)反應(yīng)抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合 抗原抗體之間的結(jié)合力抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體物物質(zhì)質(zhì)基

2、基礎(chǔ)礎(chǔ)第3頁(yè)/共21頁(yè)4 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性特異性可逆性可逆性比例性比例性階段性階段性第4頁(yè)/共21頁(yè)5特異性特異性：抗原與抗體結(jié)：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專(zhuān)一性合反應(yīng)的專(zhuān)一性抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖分子基礎(chǔ)分子基礎(chǔ): :抗原表位與抗體分子抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性第5頁(yè)/共21頁(yè)6可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性下又可解離為游離抗原與抗體的特性 影響因素：影響因素： 抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親

3、合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響pHpH、離子強(qiáng)度、離子強(qiáng)度 第6頁(yè)/共21頁(yè)7前帶前帶(prezone)(prezone)：抗體過(guò)量：抗體過(guò)量后帶后帶(postzone)(postzone)：抗原過(guò)量：抗原過(guò)量等價(jià)帶等價(jià)帶(equivalence zone)(equivalence zone)： 抗原抗體比例合適抗原抗體比例合適 抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖比例性比例性：抗原與抗體發(fā)生：抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系關(guān)系第7頁(yè)/共21頁(yè)8階段性階段性第一階段：特異性結(jié)合階段

4、，反應(yīng)快，不可見(jiàn)第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見(jiàn) 第二階段：反應(yīng)可見(jiàn)階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、第二階段：反應(yīng)可見(jiàn)階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、 沉淀和細(xì)沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象胞溶解等現(xiàn)象第8頁(yè)/共21頁(yè)9 影響抗原抗體反應(yīng)的因素一、反應(yīng)物自身因素一、反應(yīng)物自身因素抗原抗原: :理化性狀、表位種類(lèi)和數(shù)目理化性狀、表位種類(lèi)和數(shù)目抗體抗體: :來(lái)源、特異性、親和性、效價(jià)來(lái)源、特異性、親和性、效價(jià)二、環(huán)境因素二、環(huán)境因素電解質(zhì)電解質(zhì): : 生理鹽水或緩沖液生理鹽水或緩沖液酸堿度酸堿度: pH6: pH6pH9pH9（pH7.2pH7.2pH7.4pH7.4）溫溫 度度: 15: 154040（44 ），

5、），3737最適最適第9頁(yè)/共21頁(yè)10流式抗體的選擇、熒光染料應(yīng)用流式抗體的選擇、熒光染料應(yīng)用第10頁(yè)/共21頁(yè)11RUOASRIVD類(lèi)體外診斷試劑類(lèi)體外診斷試劑分析物特異性試劑分析物特異性試劑僅用于研究?jī)H用于研究第11頁(yè)/共21頁(yè)12v 單克隆抗體單克隆抗體v 混合單克隆抗體混合單克隆抗體v 多克隆抗體多克隆抗體熒光直標(biāo)的抗體熒光直標(biāo)的抗體未標(biāo)記的抗體（需要熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)未標(biāo)記的抗體（需要熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行間接標(biāo)記檢測(cè)）行間接標(biāo)記檢測(cè)）單分子熒光素單分子熒光素復(fù)合分子熒光素復(fù)合分子熒光素第12頁(yè)/共21頁(yè)13信噪比（信噪比（S/NS/N）：）：特異性熒光信號(hào)（特異性熒光信號(hào)（signal

6、signal）與非特異性熒）與非特異性熒光信號(hào)的比值光信號(hào)的比值PEAPCPE-Cy5PerCP-Cy5.5FITCPerCPPEAPCPE-Cy5PerCP-Cy5.5FITCPerCPS/NS/N越大，表越大，表明陽(yáng)性與對(duì)明陽(yáng)性與對(duì)照細(xì)胞的熒照細(xì)胞的熒光峰分離越光峰分離越好，當(dāng)好，當(dāng)S/NS/N大大于于3 3時(shí)屬于可時(shí)屬于可接受范圍接受范圍第13頁(yè)/共21頁(yè)14綜合因素：綜合因素：v熒光標(biāo)記效率：抗體上標(biāo)記熒光素的數(shù)量（熒光標(biāo)記效率：抗體上標(biāo)記熒光素的數(shù)量（E/PE/P比值）也會(huì)影比值）也會(huì)影響相對(duì)熒光強(qiáng)度。響相對(duì)熒光強(qiáng)度。 v抗體檢測(cè)的抗原密度：高密度的抗原幾乎可以用任何熒光素抗體檢測(cè)的

7、抗原密度：高密度的抗原幾乎可以用任何熒光素標(biāo)記的抗體檢測(cè)，而較低表達(dá)的抗原則需要用較高標(biāo)記的抗體檢測(cè)，而較低表達(dá)的抗原則需要用較高S/NS/N比值的熒比值的熒光素（如光素（如PEPE和和APCAPC）標(biāo)記的抗體檢測(cè)，從而達(dá)到有效區(qū)分陽(yáng)性細(xì)）標(biāo)記的抗體檢測(cè)，從而達(dá)到有效區(qū)分陽(yáng)性細(xì)胞群和何陰性細(xì)胞群的目的。胞群和何陰性細(xì)胞群的目的。v細(xì)胞自發(fā)熒光：檢測(cè)自發(fā)熒光水平高的細(xì)胞時(shí)，使用發(fā)射光細(xì)胞自發(fā)熒光：檢測(cè)自發(fā)熒光水平高的細(xì)胞時(shí)，使用發(fā)射光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光染料（如波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光染料（如APCAPC）可以得到較好的）可以得到較好的S/NS/N比值。比值。第14頁(yè)/共21頁(yè)15理想熒光素 具有高的光子產(chǎn)量，

8、信號(hào)強(qiáng)度高 對(duì)激發(fā)光有較強(qiáng)的吸收，降低背景信號(hào) 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間距離較大，減少背景信號(hào)的干擾 易與被標(biāo)記的抗原、抗體或其他生物物質(zhì)結(jié)合而不影響被標(biāo)記物得特異性 穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標(biāo)本抗凝劑和固定劑的影響第15頁(yè)/共21頁(yè)16第16頁(yè)/共21頁(yè)17第17頁(yè)/共21頁(yè)18v根據(jù)儀器選用熒光素：根據(jù)儀器選用熒光素：1.1.每個(gè)通道只能選擇每個(gè)通道只能選擇1 1種熒光素種熒光素 2.2.各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配v搭配的熒光素之間發(fā)射光譜重疊盡量小搭配的熒光素之間發(fā)射光譜重疊盡量小第18頁(yè)/共21頁(yè)19注意：注意：1.1.不要為了節(jié)省熒光抗體，未經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)就按抗體說(shuō)不要為了節(jié)省熒光抗體，未經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)就按抗體說(shuō)明書(shū)減半量甚至更多進(jìn)行標(biāo)記。明書(shū)減半量甚至更多進(jìn)行標(biāo)記。2.2.不能完全憑感覺(jué)進(jìn)行標(biāo)記，需進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。不能完全憑感覺(jué)進(jìn)行標(biāo)記，需進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。3.3.應(yīng)用應(yīng)用FITCFITC標(biāo)記抗體時(shí)，避免使用酸性緩沖溶液，因標(biāo)記抗體時(shí)，避免使用酸性緩沖溶液，因?yàn)闉镕ITCFITC的熒光特性是的熒光特性是pHpH依賴(lài)的。依賴(lài)的。4.4.熒光抗體、熒光