基因工程的基本操作程序(修改版)

1、1.2 1.2 基因工程基因工程基因工程又叫做基因工程又叫做基因拼接技術基因拼接技術或或DNADNA重組技術重組技術。通俗地說，就。通俗地說，就是按照人們的意愿，把一種生是按照人們的意愿，把一種生物的某種物的某種基因基因提取出來，加以提取出來，加以修飾改造修飾改造，然后放到另一種生，然后放到另一種生物的細胞里，物的細胞里，定向地定向地改造生物改造生物的遺傳性狀。的遺傳性狀。DNA 重組技術的基本工具重組技術的基本工具 1 DNA1 DNA重組技術的基本工具重組技術的基本工具專題一專題一 基因工程基因工程“分子手術刀分子手術刀” 限制酶限制酶 “分子縫合針分子縫合針” DNA連接酶連接酶 “分子

2、運輸車分子運輸車” 基因進入受體細胞的載體基因進入受體細胞的載體 粘性末端粘性末端平末端平末端 限制酶所識別的序列有什么特點？限制酶所識別的序列有什么特點？ 限制酶所識別的序列，無論是限制酶所識別的序列，無論是6 6個堿基還是個堿基還是4 4個堿個堿基，都可以找到一條中心軸線基，都可以找到一條中心軸線, ,中軸線兩側的雙中軸線兩側的雙鏈鏈DNADNA上的堿基是反向對稱重復排列的。上的堿基是反向對稱重復排列的。圖圖1-1 1-1 限制酶識別序列的中心軸線限制酶識別序列的中心軸線 迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌中提取出來的是從細菌

3、或霉菌中提取出來的. . 細菌中限制酶之所以不切斷自身細菌中限制酶之所以不切斷自身DNADNA，是因為微，是因為微生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，對于外源入侵的機制，對于外源入侵的DNADNA可以降解掉。生物在可以降解掉。生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其其DNADNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者所識別序列被修飾或者所識別序列被修飾。這樣，盡管細菌中含有。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的某種限制酶也不會使自身的DNADNA被

4、切斷，并且可被切斷，并且可以防止外源以防止外源DNADNA的入侵的入侵 1、種類：、種類：2、作用部位：、作用部位：兩類兩類Ecoli DNA連接酶連接酶T4 DNA連接酶連接酶 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 基因工程中作為載體使用的基因工程中作為載體使用的DNADNA分子很多都是質分子很多都是質粒，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件粒，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。（1 1） 載體載體DNADNA必需有一個或多個限制酶的切必需有一個或多個限制酶的切割位點割位點，以便目的基因可以插入到載體上，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點去。這些供目的基因插入的限制酶的

5、切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。的插入而失活。（2 2） 載體載體DNADNA必需具備自我復制的能力必需具備自我復制的能力，或，或整合到受體染色體整合到受體染色體DNADNA上隨染色體上隨染色體DNADNA的復的復制而同步復制。制而同步復制。（3 3） 載體載體DNADNA必需帶有標記基因必需帶有標記基因，以便重組，以便重組后進行重組子的篩選。后進行重組子的篩選。知識點一：知識點一：1.1.原核細胞的基因結構原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編

6、碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子啟動子：啟動子：位于基因首端一段能與位于基因首端一段能與RNARNA聚合酶結合并能聚合酶結合并能起動起動mRNAmRNA合成合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，它能片斷，它能阻礙阻礙RNARNA聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動，并使其從DNADNA模板鏈上脫離下來，模板鏈上脫離下來，使轉錄終止使轉錄終止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能夠能夠識別啟動子上

7、的結合位點并與其結合識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質的一種蛋白質.(.(以模板轉錄然后脫落以模板轉錄然后脫落) )不能轉錄為信使不能轉錄為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質。編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使：能轉錄相應的信使RNARNA，能，能 編碼蛋白質編碼蛋白質 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細胞細胞的的 基因基因結構結構有調控遺傳信息表達的核有調控遺傳信息表達的核 苷酸序列，在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上最重要的是位于編碼區(qū)上 游的游的RNARNA聚合酶結合位點。聚合酶結合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)

8、上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結合位點結合位點內含子內含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質的序列叫做內不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子含子啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內含子：內含子： 外顯子：外顯子： 知識點一：知識點一：2.2.真核細胞的基因結構真核細胞的基因結構真核真核細胞細胞的的 基因基因結構結構編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質的序列外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白

9、質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，：有調控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結合位點等。聚合酶結合位點等。非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內含子包括非編碼區(qū)和內含子原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質的都由能夠編碼蛋白質的_和具和具有調控作用的有調控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考思考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核

10、細胞基因結構一樣長嗎？細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構建、基因表達載體的構建3 3、將目的基因導入受體細胞、將目的基因導入受體細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定知識點二知識點二. .基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟有了目的基因，我們才有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用遺傳、表達和發(fā)揮作用 載

11、體進入受體細胞穩(wěn)定載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現一種生表達，才能實現一種生物的基因在另一種生物物的基因在另一種生物中的轉化。中的轉化。 才能確定目的基因是否才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。遺傳和正確表達。一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_編碼蛋白質的結構基因編碼蛋白質的結構基因請舉出三個以上的例子請舉出三個以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、從基因文庫中獲取、從基因文庫中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術擴增技術擴增3 3、利用化學

12、方法人工合成、利用化學方法人工合成請閱讀請閱讀P9P9第一和二兩段第一和二兩段一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取1.1.基因文庫：基因文庫：概念見概念見P9P92.2.基因文庫的分類基因文庫的分類: :按外源按外源DNADNA片段的來源分類片段的來源分類種種類類基因組基因組DNADNA文庫：文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNAcDNA文庫文庫3.3.基因文庫的目的基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便為了在不知目的基

13、因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。于獲得所需的目的基因。4.4.獲取目的基因的根據：獲取目的基因的根據： 見課本見課本P9提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當的限制酶切用適當的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫5.5.基因文庫的構建方法之一基因文庫的構建方法之一（1 1）直接分離法）直接分離法( (鳥槍法鳥槍法) )某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA單鏈互補單鏈互補DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存與載體連接與

14、載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉錄酶反（逆）轉錄酶DNADNA聚合酶聚合酶反轉錄法：反轉錄法：cDNAcDNA的合成流程圖解的合成流程圖解5.5.基因文庫的構建方法之基因文庫的構建方法之 概念概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段原理：原理：DNADNA復制復制2 2、利用、利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸( (dNTPdNTP) ) 一對一對引物：引物：熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶）

15、酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) MgMg2+2+( (激活劑激活劑) )緩沖溶液緩沖溶液一對寡核苷酸序列：與目的基因一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補的起始段互補一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物根據這一序列合成引物 過程過程高溫變性（高溫變性（90-9590-95 解旋解旋）低溫退火（低溫退火（55-6055-60 引物與單鏈結合引物與單鏈結合）適溫延伸（適溫延伸（70-7570-75 在在TaqTaq酶的作酶的作 用下合成與模板互補用下合成與模板互補 的的DNADNA雙鏈雙鏈）重復循環(huán)重復循環(huán)

16、PCR(多聚酶鏈式反應) 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 條件：條件：_、 _、_ _ 、 _ ._ .等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增為擴增循循 環(huán)的次數）環(huán)的次數）結果：結果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復制復制四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶指數指數2 2n n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（

17、前提條件）要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因基因較小，核苷酸序列已知，可以利用基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNADNA合合成儀人工合成成儀人工合成二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建 基因工程的核心基因工程的核心1 1、目的、目的：使目的基因在受體細胞中使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在，并且可以并且可以遺傳遺傳給下一代，同時使目的給下一代，同時使目的基因能夠基因能夠表達表達和和發(fā)揮作用發(fā)揮作用。2 2、基因表達載體的組成：、基因表達載體的組成：復制原點復制原點+ +目的基因目的基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+

18、 +標記基因標記基因它們各自的作它們各自的作用是什么用是什么?啟動子：啟動子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結合的部聚合酶識別和結合的部位，有了它才能位，有了它才能驅動基因轉驅動基因轉錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質，最終獲得蛋白質終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉錄的轉錄標記基因標記基因的作用是為了鑒別的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基受體細胞中是否含有目的基因因，從而將有目的基因的，從而將有目的基因的細細胞胞篩

19、選出來篩選出來載體載體與與基因表達載體基因表達載體的區(qū)別：二者都有標記的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分基因和復制原點兩部分DNADNA片段。表達載體在片段。表達載體在載體基礎上增加了載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子目的基因、啟動子、終止子三部分結構三部分結構用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又既用到限制酶切割載體，又用到用到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，目的

20、基因不能單獨進入受體細胞，必需以表必需以表達載體的方式攜帶進去。達載體的方式攜帶進去。注意注意1 1、將目的基因導入植物細胞的方法：、將目的基因導入植物細胞的方法：（1 1）農桿菌轉化法農桿菌轉化法 農桿菌特點：農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力數單子葉植物沒有感染能力原理：原理：TiTi質粒上的質粒上的T-DNAT-DNA可以轉可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的色體的DNADNA上。上。過程過程：優(yōu)點：經濟、有效。目前約優(yōu)點：經濟、有效。目前約80%80%的轉基的轉基因植物采用此方

21、法獲得。因植物采用此方法獲得。（2 2）基因槍法基因槍法（3 3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、將目的基因導入動物細胞、將目的基因導入動物細胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物3 3、將目的基因導入微生物細胞、將目的基因導入微生物細胞原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少質少方法：方法： 用用CaCa2+2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸

22、收DNADNA分子分子三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞（一）轉化：（一）轉化： （二）方法（二）方法將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞將目的基因導入將目的基因導入動物細胞動物細胞將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞微生物細胞農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞目的基因進入目的基因進入_內，并且在內，并且在 受體細胞內維持受體細胞內維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定 目的基因導入受體細胞目的基因導入受體細胞后后，是否可以穩(wěn)定維持

23、和表達其遺傳是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測和鑒定才能特性，只有通過檢測和鑒定才能知道。知道。（一）、檢測（一）、檢測1 1、檢測轉基因生物染色體的、檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (關鍵步驟關鍵步驟) ).首先取出轉基因生物的基因組首先取出轉基因生物的基因組DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作標記等作標記,以此做探針以此做探針.使探針和轉基因生物的基因組雜交使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯若顯示出示出雜交帶雜交帶,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNA中中（1）方法方法

24、: :DNADNA分子雜交分子雜交（2）過程）過程:歸納步驟（二）、鑒定（個體生物學水平）（二）、鑒定（個體生物學水平）2 2、檢測目的基因是否轉錄出了、檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA3 3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法: :分分 子子 雜雜 交交方法方法: :抗原抗原-抗體雜交抗體雜交過程過程: : 用上述探針和轉基因生物的用上述探針和轉基因生物的mRNAmRNA雜交雜交, ,若若出現雜交帶出現雜交帶, ,表明目的基因轉錄出了表明目的基因轉錄出了mRNAmRNA練習練習1 1：(200

25、8(2008理綜山東卷理綜山東卷) )為擴大可耕地面積，為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。了耐鹽水稻新品系。（1 1）獲得耐鹽基因后，構建重組）獲得耐鹽基因后，構建重組DNADNA分子所用分子所用的限制性內切酶作用于圖中的的限制性內切酶作用于圖中的 處，處，DNADNA連接酶作用于連接酶作用于 處。（填處。（填“a”a”或或“b”b”）aa練習練習1 1：(2008(2008理綜山東卷理綜山東卷) )為擴大可耕地面積，增為擴大可耕地面

26、積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。水稻新品系。（2 2）將重組）將重組DNADNA分子導入水稻受體細胞的常用方分子導入水稻受體細胞的常用方法有農桿菌轉化法和法有農桿菌轉化法和 法。（法。（3 3）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用需要利用 技術，該技技術，該技術的核心是術的核心是 和和 。（4 4）為了確定耐鹽轉基因水稻是否培育成功，既）為了確定耐鹽轉基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的要用

27、放射性同位素標記的 作探針進行分子雜交檢測，又要用作探針進行分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。基因槍法（花粉管通道法）基因槍法（花粉管通道法）植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)脫分化和再分化脫分化和再分化耐鹽基因耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌一定濃度鹽水澆灌1 1 ） 有 關 基 因 工 程 的 敘 述 正 確 的 是） 有 關 基 因 工 程 的 敘 述 正 確 的 是 （ ） A A、限制酶只在獲得目的基因時才用、限制酶只在獲得目的基因時才用 B B、重組質粒的形成在細胞內完成、重組質粒的形成在細胞內完成 C C、質粒都可作為運載體、質粒都可作為運載體 D D、蛋白質的結構可為合成目的基因提供、蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料資料2 2）基因工程是在）基因工程是在DNADNA分子水平上進行設計施分子水平上進行設計施工的。在基因操作的基本步驟中，一定不進工的。在基因操作的基本步驟中，一定不進行堿基互補配對的步驟是行堿基互補配對的步驟是 （ ） A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因與運載體結合、目的基因與運載體結合 C C、將目的基因導入受體細胞、將目的基因導