微生物飼料添加劑

1、微生物飼料添加劑 乳酸菌的微生物學(xué)檢驗(yàn) www.飼料檢測網(wǎng).中國www. 飼料檢測網(wǎng).cn一、概述乳酸細(xì)菌是一類能利用發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。乳酸細(xì)菌主要包括23個(gè)屬，通常在飼料中用作有益微生物的菌種有干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、糞腸球菌(Enterococcus faecium)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、屎腸球菌（Enterococ

2、cus faecium）、乳酸乳桿菌(Lactococcus Lactis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等。乳桿菌常用MRS瓊脂作半選擇培養(yǎng)基。APT培養(yǎng)基通常用于分離綠色乳桿菌和其他乳桿菌及肉食桿菌。當(dāng)乳桿菌僅是復(fù)雜區(qū)系中的部分菌類時(shí)，SL培養(yǎng)基常用作為選擇性培養(yǎng)基。對于芽孢乳桿菌常用GYP培養(yǎng)基，鏈球菌有TYC培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基，還有利用磺胺二甲惡唑、制大腸菌素和結(jié)晶紫等作為選擇因子。M17培養(yǎng)基被用作乳球菌的分離培養(yǎng)基。此外還有如溴甲酚紫培養(yǎng)基、CHALMERS培養(yǎng)基等也常用于乳酸菌的分離。以下舉幾個(gè)例子來說明乳酸菌的作用及特性。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬（

3、Lactobacillus）的一個(gè)種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運(yùn)動，無鞭毛，接觸酶陰性，和苦杏仁苷、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、水楊苷、蔗糖反應(yīng)為陰性，阿拉伯糖、葡糖酸鹽、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、木糖反應(yīng)為陰性。由于嗜酸乳桿菌在生長中可以產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)，如有機(jī)酸、細(xì)菌素及類細(xì)菌素，可以抑制腸道中有害微生物生長繁殖，起到平衡腸道菌群的作用。并能產(chǎn)生B族維生素，包括各種葉酸、生物素、維生素B6和維生素K等，分泌各種有益物質(zhì)，如乳酸、乙酸等，降低腸道pH值。糞腸球菌主要存在于人類或動物腸道，是人類和動物腸道的正常菌群等。糞腸球菌為革蘭氏陽性，圓形或

4、橢圓形，能在膽汁七葉苷瓊脂上生長，不產(chǎn)生色素。乳酸片球菌細(xì)胞呈球狀，直徑0.61.0m，在直角兩個(gè)平面交替形成四聯(lián)狀，一般細(xì)胞成對生，單生者罕見，不成鏈狀排列。革蘭氏陽性，不運(yùn)動，兼性厭氧。在MRS培養(yǎng)基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長物呈絲狀，接觸酶陰性，不產(chǎn)細(xì)胞色素，在不加啤酒花的麥芽汁中生長，能利用半乳糖、阿拉伯糖、木糖和海藻糖產(chǎn)酸，不分解蛋白質(zhì)，不產(chǎn)吲哚，不水解馬尿酸鹽。某些菌株能利用蔗糖和乳糖產(chǎn)微量的酸。不能利用麥芽糖、甘露醇、糊精等產(chǎn)酸，能產(chǎn)丁二酮。二、檢測方法1 范圍本方法規(guī)定了微生物飼料中各乳酸菌(包括干酪乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳桿菌、戊糖

5、片球菌)及其總數(shù)的測定及鑒定方法。本方法適用于微生物飼料中乳酸菌的檢測。2 術(shù)語：乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖產(chǎn)生乳酸，需氧和兼性厭氧，多數(shù)無動力，過氧化氫酶陰性，革蘭氏陽性的無芽胞桿菌和球菌。乳酸菌菌數(shù)總數(shù)：試料在一定條件下培養(yǎng)后，所得1 mL試料中所含乳酸菌菌落的總數(shù)。3 設(shè)備和材料3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36±1。3.2 冰箱：04。3.3 恒溫水?。?6±13.4 電爐：可調(diào)式。3.5 吸管：容量為1、10、25 mL。3.6 廣口瓶或三角瓶：容量為500 mL。3.7 平皿：直徑為9 cm。3.8 試管：18×180 mm。3.9 顯微鏡。3.10高壓滅菌

6、鍋。3.11烘箱。4 培養(yǎng)基和試劑4.1 改良TJA培養(yǎng)基（改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基）。4.2 改良MC培養(yǎng)基（Modified Chalmers培養(yǎng)基）。4.3 0.1%美蘭牛乳培養(yǎng)基。4.4 6.5%氯化鈉肉湯。4.5 pH9.6葡萄糖肉湯。4.6 40%膽汁肉湯。4.7 淀粉水解培養(yǎng)基。4.8 精氨酸水解培養(yǎng)基。4.9 乳酸桿菌糖發(fā)酵管。4.10 七葉苷培養(yǎng)基。4.11 革蘭氏染色液。4.12 3%過氧化氫溶液。4.13 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑。4.14 明膠培養(yǎng)基。4.15 硝酸鹽培養(yǎng)基、硝酸鹽試劑。4.16 生理鹽水：將蒸餾水加入8.5 g的食鹽中做成1000 mL的溶液。在121下滅菌1

7、5min。5 乳酸菌菌落總數(shù)的測定5.1 檢驗(yàn)程序乳酸菌菌落總數(shù)檢驗(yàn)程序如下：試料作成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇23個(gè)適當(dāng)稀釋度，各以1 mL之量加入滅菌平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入適量改良TJA或改良MC培養(yǎng)基72±136±1菌落計(jì)數(shù)報(bào)告圖：乳酸菌檢測程序圖5.2 操作步驟5.2.1 以無菌操作將經(jīng)過充分搖勻的試料25 mL（或25 g）放入含有225 mL滅菌生理鹽水的滅菌廣口瓶內(nèi)作成1:10的均勻稀釋液。5.2.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液）。5.2.3 另取1 mL滅菌吸管，按上述操

8、作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用1支1 mL滅菌吸管。5.2.4 選擇23個(gè)以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1 mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。5.2.5 稀釋液移入平皿后，應(yīng)即時(shí)將冷至50的乳酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（改良TJA或改良MC）注入平皿約15 mL，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。同時(shí)將乳酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基傾入加有1 mL稀釋液試料用的滅菌生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作空白對照，以上整個(gè)操作自培養(yǎng)物加入培養(yǎng)皿開始至接種結(jié)束須在20 min內(nèi)完成。5.2.6 待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72±1 h取出

9、，觀察乳酸菌菌落特征（見表1），選取菌落數(shù)在30300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。5.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培養(yǎng)基上菌落生長形態(tài)特征見表1。表1 乳酸菌菌落特征改良TJA改良MC桿菌平皿底為黃色，菌落中等大小，微白色，濕潤，邊緣不整齊，直徑3±1mm，如棉絮團(tuán)狀菌落。平皿底為粉紅色，菌落較小，圓形，紅色，邊緣似星狀，直徑2±1mm，可有淡淡的暈。球菌平皿底為黃色，菌落光滑，濕潤，微白色，邊緣整齊。平板底為粉紅色，菌落較小，圓形，紅色，邊緣整齊，可有淡淡的暈。注：干酪乳桿菌在改良TJA培養(yǎng)基上為圓形光滑，邊緣整齊，側(cè)面呈菱形狀，6 乳酸菌的鑒定進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡檢查，并

10、做過氧化氫酶試驗(yàn)。革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌。對上述分離到的乳酸菌需進(jìn)行菌種鑒定，則作以下試驗(yàn)。6.1 菌種制備：自平板上挑取菌落，接種于改良TJA或改良MC瓊脂斜面，于36±1，2448 h培養(yǎng)，刮取菌苔，分別進(jìn)行下列試驗(yàn)。6.2 乳酸桿菌鑒定試驗(yàn)：極少見還原硝酸鹽，不液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫。6.3幾種乳桿菌屬內(nèi)種的碳水化合物反應(yīng)，見表2。6.4腸球菌的鑒別試驗(yàn)，見表3。6.5 腸球菌屬與片球菌屬容易混淆，其鑒別可見表4。表2 常見乳桿菌屬內(nèi)種的碳水化合物反應(yīng)七葉苷纖維二糖麥芽糖甘露醇水楊苷山梨醇棉籽糖蔗糖干酪乳桿菌+d+-d嗜酸乳桿菌+-+-d+植物乳桿菌+注：d有些菌株陽性，有些菌株陰性；#弱、慢或陰性。表3 腸球菌的鑒別表名稱-半乳糖苷酶L-阿拉伯糖甘露醇蜜二糖山梨醇丙酮酸發(fā)酵糞腸球菌-+-D+屎腸球菌VVVVD-注：D+，通常陽性；D-，通常陰性；V，不同或可變。表4 鏈球?qū)倥c片球菌屬的鑒別特征鏈球菌屬片球菌屬細(xì)胞形態(tài)球或卵圓形球形排列成對，鏈四聯(lián)，成對接觸酶-d厭氧條件下生長良好+從葡萄糖產(chǎn)氣-抗萬古霉素-+注：d有些菌株陽性，有些菌株陰性。7 結(jié)果計(jì)算及表述7.1 乳酸菌總數(shù)菌落計(jì)數(shù)后，隨機(jī)挑取5個(gè)菌落進(jìn)行鑒定。根據(jù)證實(shí)為乳酸菌菌落計(jì)算出該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，然后乘其