紫花苜蓿耐逆性狀遺傳及分子生物學(xué)探究進(jìn)展

1、紫花苜蓿耐逆性狀遺傳及分子生物學(xué)探究進(jìn)展摘要有關(guān)苜蓿的耐逆性研究一直是牧草學(xué)研究的熱點之 一，研究領(lǐng)域也逐漸從形態(tài)水平發(fā)展到生理、生化及分子生 物學(xué)等更深入的領(lǐng)域，并取得了很多有價值的研究成果。簡 述了紫花苜蓿耐逆性狀遺傳、耐逆性狀分子標(biāo)記、耐逆基因 克隆的研究，綜述了利用生物技術(shù)和誘變技術(shù)相結(jié)合的方法 改良紫花苜蓿耐逆性的研究進(jìn)展，旨在為紫花苜蓿耐逆育種 提供參考。關(guān)鍵詞紫花苜蓿；耐逆；性狀遺傳；分子生物學(xué)中圖分類號s551+. 7文獻(xiàn)標(biāo)識碼a文章編號 1007-5739 (2012) 20-0304-02苜蓿(medicago sativa)是世界上重要的豆科牧草， 現(xiàn)已成為僅次于小麥、玉

2、米、大豆之后的第四大作物，其粗 蛋白含量達(dá)18%以上，干草產(chǎn)量可達(dá)18 t/hm2,種植一次可 利用45年。正是因為苜蓿營養(yǎng)高、產(chǎn)量高、利用年限長 的特點，因此被譽為"牧草之王”。近年來，我國苜蓿種植 面積和種植區(qū)域不斷擴(kuò)大，西北、華北、東北各省有大量栽 培，南方各地也開始栽種。對苜蓿的遺傳改良一直是苜蓿遺 傳與育種工作者的目標(biāo)。但由于栽培苜蓿的四倍體特性，且 具有蟲媒傳粉、自交衰退的特點，使得苜蓿的遺傳改良較其 他作物進(jìn)展緩慢。受氣候和土壤的影響，紫花苜蓿在我國南 方推廣受到制約，對南方草食畜禽的發(fā)展產(chǎn)生了極大阻礙。 隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步，各種誘變技術(shù)和生物技術(shù) 在遺傳和育

3、種方面的運用逐漸發(fā)展和提高。因此，為了推動 苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，利用這些技術(shù)手段研究紫花苜蓿的耐逆性 狀，從而豐富我國苜蓿種質(zhì)資源，并為其耐逆育種提供一定 的參考。1耐逆遺傳基礎(chǔ)研究1. 1耐逆遺傳國內(nèi)有關(guān)紫花苜蓿耐逆性狀遺傳的研究不多見，因為紫 花苜蓿遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，其是異花授粉植物，為同源四倍體， 國外報道也不全面。很多植物能夠在一定干旱脅迫閾值內(nèi)表 達(dá)相關(guān)抗旱基因，體現(xiàn)抗旱性1。湛虎2利用reverse northern技術(shù)和ddrt-pcr技術(shù)，篩選了干旱脅迫表現(xiàn)的基 因片段，研究表明該片段可能為干旱誘導(dǎo)表達(dá)的新基因。目 前的研究表明，基因組成決定了紫花苜蓿的抗寒性，其受到 多重環(huán)境因素影響

4、，如土壤、光照、溫度等，還與秋眠性密 切相關(guān)。cunningham et al 3以非秋眠性、不抗寒品種 cuf101為親本，在選擇髙秋眠性植株的同時，也提高了入選 植株的抗寒性。cunningham et al 4研究表明，根系和根 莖中g(shù)as基因的表達(dá)和隨后的脯氨酸聚積與苜蓿越冬存活率 緊密相關(guān)。楊青川等5對紫花苜蓿耐鹽性的基因效應(yīng)和遺 傳力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)個體間耐鹽性差異大于品種間差異， 主要表現(xiàn)為加性效應(yīng)。a1-khatib et al6揭示了不同紫花 苜蓿品種群體具有不同的耐鹽基礎(chǔ)，用ncii雜交法研究了經(jīng) 耐鹽選擇后的遺傳方差和非遺傳方差。johnson et al7認(rèn) 為，紫花苜

5、蓿各生育階段的耐鹽機(jī)制可能不同。campbell et al 8研究表明通過表型輪回選擇可提高紫花苜蓿對鋁耐受 性。1.2耐逆性狀的分子標(biāo)記在抗寒和抗旱性方面，國內(nèi)外許多學(xué)者對紫花苜蓿進(jìn)行 了分子標(biāo)記方面的研究，如分子標(biāo)記圖譜構(gòu)建9、rapd技 術(shù)引物篩選10、品種耐寒性檢測11等。在耐鋁毒方面， sledge et al 12采用rflp技術(shù)對二倍體紫花苜蓿耐鋁性 進(jìn)行qtl位點識別的研究，發(fā)現(xiàn)了 2個與耐鋁毒相關(guān)的基因, 并定位在苜蓿rflp圖譜。在耐鹽性方面，楊青川等13研 究獲得1個與苜蓿耐鹽基因相連鎖的rapd標(biāo)記，并推斷該 標(biāo)記與苜蓿耐鹽主效qtl緊密連鎖。劉志鵬等14用ssr標(biāo)

6、記對耐鹽和敏鹽苜蓿種質(zhì)群體內(nèi)和群體間的遺傳變異進(jìn)行 了研究分析。在抗病性方面，王瑜等15采用issr分子標(biāo)記技術(shù)結(jié) 合集群分離分析法對褐斑病抗性基因進(jìn)行分子標(biāo)記研究，初 步確定了幾個與褐斑病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記，為建立苜 蓿褐斑病的分子標(biāo)記輔助選擇（mas）育種技術(shù)體系、抗病 基因的定位克隆以及深入研究奠定了基礎(chǔ)，為紫花苜?？购?斑病的鑒定和分子標(biāo)記輔助抗病育種提供了重要依據(jù)。劉曙娜等17以篩選出的高抗寒黃花苜蓿與高產(chǎn)紫花 苜蓿雜交產(chǎn)生f1代個體，并且由f1代個體自交構(gòu)建f2群 體。利用隨機(jī)擴(kuò)增dna多態(tài)性分子遺傳標(biāo)記(rapd)對f2 群體進(jìn)行分析。應(yīng)用mapmaker/exp (3. 0

7、)與jionmap4. 0并 結(jié)合mapdrawv2. 1軟件構(gòu)建四倍體苜蓿遺傳連鎖圖譜。從192 個隨機(jī)引物中篩選出72個引物，對94個f2個體及f1雙親 dna樣本進(jìn)行rapd擴(kuò)增，獲得51個rapd標(biāo)記，構(gòu)建了四倍 體苜蓿分子遺傳連鎖框架圖，其中包含8個連鎖群，標(biāo)記覆 蓋的基因組總長度約為1261. 5 cm,標(biāo)記間平均距離為24. 73 cm。該圖譜為構(gòu)建飽和的苜蓿遺傳連鎖圖譜提供了框架結(jié) 構(gòu)，并為開展苜蓿分子育種研究奠定基礎(chǔ)。1.3耐逆基因克隆紫花苜蓿耐鹽堿/抗旱、抗寒能力強(qiáng)，目前已從紫花苜 蓿中分離、克隆了多個與耐逆境相關(guān)的基因。在耐鹽堿性方 面，ginzberg et al 18

8、從鹽脅迫紫花苜蓿的根cdna文庫 中成功克隆2個編碼pro的關(guān)鍵合成酶基因cdna克隆。龍 瑞才等19根據(jù)已知的與鹽脅迫相關(guān)的est序列，采用smart race方法克隆了紫花苜蓿果糖一1, 6 一二磷酸醛縮酶(ald) 全長cdna,命名為msaldo結(jié)果表明，cdna全長1 487 bp, 包含一個1 194 bp的最大開放閱讀框，編碼398個氨基酸。經(jīng)同源比對和進(jìn)化樹分析，msald基因編碼的氨基酸與馬鈴 薯、煙草、紅三葉草等的果糖一1, 6二磷酸醛縮酶（ald） 氨基酸序列一致性達(dá)90%以上，確定其屬第1類果糖一1,6 二磷酸醛縮酶。半定量rt-pcr分析表明，msald基因可能與 紫

9、花苜?？果}性相關(guān)。在抗旱性方面，bartels20發(fā)現(xiàn)， 干旱脅迫誘導(dǎo)的乙醛糖還原酶在苜蓿中已被克隆，此種酶可 減輕乙醛活化，為苜?？购涤N提供了思路。在抗寒性方面, mohapatra et al 21-22分別從紫花苜蓿apica品種中分離 出1個受干旱、寒冷、aba脅迫誘導(dǎo)的cdna和3個冷馴化 特異性cdnao castonguay et al 23從冷馴化的苜蓿根頸中 分離了 1個冷調(diào)節(jié)基因msacico laberge et al 24分離了 編碼富甘氨酸的msaciao2誘變耐逆性在逆境條件下，各物質(zhì)的相互關(guān)系是相當(dāng)復(fù)雜的。近年 來植物耐逆性大多局限于逆境下生理機(jī)制的變化，缺乏各

10、生 理機(jī)制之間相關(guān)性的研究，目前引起這些作用的分子機(jī)制尚 未完全研究清楚。因此，就簡單的說某種物質(zhì)在逆境條件下 的升降，只能作為受到脅迫的參考依據(jù)。2. 1物理誘變李波等24采用紫外線對苜蓿的愈傷組織進(jìn)行誘變處 理，并用peg模擬干旱脅迫，然后對抗旱性生理指標(biāo)進(jìn)行測 定。結(jié)果表明，脯氨酸含量、可溶性蛋白、過氧化物酶（pod） 等生理指標(biāo)均高于對照，趨于一致。王瑛等25利用經(jīng)衛(wèi) 星搭載的苜蓿種子誘導(dǎo)愈傷組織，并篩選抗務(wù)脯氨酸變異 體，獲得變異細(xì)胞系，其游離脯氨酸含量高于對照2倍以上, 同時對peg和nacl還具有交叉抗性。在抗鹽性方面，李紅等26對苜蓿莖段進(jìn)行愈傷組織 誘導(dǎo)，并進(jìn)行nan3和紫外

11、線誘變處理。脯氨酸篩選后，作 na2c03和nahc03堿性脅迫，鑒定各項抗堿性生理指標(biāo)，如 脯氨酸含量、可溶性糖、pod等。研究結(jié)果表明，在提高苜 蓿的抗堿性作用方面，2種方法均可提高苜?？箟A性，其中 紫外線誘變效果優(yōu)于nan3化學(xué)誘變。2.2化學(xué)誘變在抗旱性方面，張志勝等27通過3種途徑利用peg分 別獲得抗20%peg帶芽愈傷組織、抗20%peg愈傷組織、抗旱 性穩(wěn)定的愈傷組織。在抗寒性方面，李波等28利用疊氮 化鈉誘變3個紫花苜蓿品種幼莖誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織，經(jīng) -低溫篩選，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘變的愈傷組織抗寒性顯著提高，之 后李 波等29用硫酸二乙酯(des)誘變紫花苜蓿愈傷組織, 也發(fā)現(xiàn)經(jīng)des

12、處理后的愈傷組織抗寒力增強(qiáng)。繼紅等30 以ems為誘變劑，對紫花苜蓿葉片誘導(dǎo)愈傷組織作低溫篩選, 獲得了耐寒突變體。誘變育種是植物耐逆育種的重要手段，誘變育種在組織 培養(yǎng)中也得到了廣泛的應(yīng)用，應(yīng)注重誘變技術(shù)與生物技術(shù)、 航天育種技術(shù)相結(jié)合，加強(qiáng)多學(xué)科的滲透，以獲得更多新成 果。在分子水平上，已經(jīng)實現(xiàn)了將一些與逆境相關(guān)的基因?qū)?入到植株體內(nèi)，從而提升植株的耐逆性能。植物的耐逆性受 多基因控制，存在多種調(diào)控途徑并可能發(fā)生交叉，運用傳統(tǒng) 育種技術(shù)與現(xiàn)代分子育種技術(shù)相結(jié)合是現(xiàn)階段植物抗逆育 種的一個新方向。3參考文獻(xiàn)1 馬巧利，孫彥，楊青川苜蓿干旱脅迫的生理響應(yīng) 及其分子水平的研究進(jìn)展j北方園藝，20

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