色譜分析法液相色譜分離方法PPT課件

1、17.1固定相的作用 在液相色譜中通常都強調(diào)流動相的作用，如流動相的極性、選擇性和優(yōu)化等，這是因為在液相色譜中流動相參與柱色譜過程的分配作用，而且組分的最佳分離在很大程度上取決于流動相的選擇和優(yōu)化，并因此而忽略了柱子在液相色譜分離過程中的作用。其實液相色譜的發(fā)展主要是柱子和固定相的發(fā)展，色譜分離技術的開拓和商業(yè)競爭的焦點往往集中于固定相和柱子。固定相和柱子是兩個相關而又不盡相同的兩個問題，柱子包括固定相，但柱子還有柱型、柱尺寸、柱材料以及像離子色譜中的柱配置等問題。 天然化合物多種多樣，它們可以按分子大小、極性、離解度和空間結構等方法分類，而這些化合物又通常可被某一溶劑溶解，甚至在溶液中解離。

2、而其中固定相在不同類化合物的分離中起著相當重要的作用，它決定了物質(zhì)的分離過程，也決定了流動相的基本性質(zhì)。第1頁/共30頁27.2吸附色譜 吸附色譜（Adsorption Chromatography），文獻中也稱之為液固色譜（Liquid Solid Chromatography）或正相色譜（Normal Phase Chromatography）。吸附一詞可能更準確地反映這類分離過程的本質(zhì)，并與液相色譜的其他技術相區(qū)別。7.2.1分離原理7.2.2固定相 吸附色譜中目前最常用的固定相是硅膠，其次是氧化鋁，為了某些樣品的分離，也使用苯乙烯二乙烯苯等聚合物作為吸附劑。硅膠表面的SiOH是最主要的

3、吸附點，氧化鋁中Al3+是顯著的吸附中心。選擇吸附劑的原則是樣品的性質(zhì)和吸附劑本身具有的品質(zhì)。這些品質(zhì)包括顆粒形狀、顆粒直徑、表面積、孔徑以及吸附劑表面的酸堿性等。附表7.1中列出了部分吸附劑的商品名稱、特點和生產(chǎn)廠家，以硅膠為主。第2頁/共30頁37.2.3流動相 在吸附色譜中，固定相是極性吸附劑，因此流動相多以非極性溶劑為主?？勺鳛榱鲃酉嗟娜軇┖芏?，根據(jù)式（7.5）可以把它們按照0的大小排列成表(見表6.7)，這種排列稱為洗脫系列。這個表所列的數(shù)據(jù)是在氧化鋁柱上測定的，使用硅膠柱時順序不變，0SiO2 的數(shù)值相當于0Al2O3的0.8倍左右。 這些溶劑大致可分為3類：一類是非極性的，如正己

4、烷等烴類；一類是中等極性的，主要是鹵代烷、酯類；一類是極性的，醇和乙腈；等等。水雖然是極性很強的溶劑，但水分子會永久地吸附在吸附劑的表面，導致活性降低而失去分離作用。第3頁/共30頁4圖7.1 二元混合物的溶劑強度（SiO2O2)第4頁/共30頁57.2.4溶質(zhì)的保留功能團的極性越大，吸附作用越強，水的氫鍵作用甚至導致永久性吸附。圖7.2 吸附色譜（硅膠柱）流動相對溶質(zhì)保留的影響第5頁/共30頁6在功能團相同的情況下，分子的體積由于和數(shù)目的不同而不同。同分異構體，主要指幾何異構體，由于空間結構的差別，在吸附劑表面上的吸附強度相差很大。7.3分配色譜 分配色譜（Partition Chromat

5、ography）以溶質(zhì)在流動和固定兩相中的分配為基礎。在現(xiàn)代液相色譜中分配色譜大致分為兩類：一類類似氣液色譜，把固定液涂布于惰性擔體上，為液液分配色譜。但在液相色譜中流動相是液體，由于固定液在流動相中的溶解而不能穩(wěn)定地保持在擔體上而給操作帶來麻煩；另一類使用鍵合固定相，即把有機化合物的一部分通過化學反應鍵合在擔體的表面上，而克服了固定液的流失現(xiàn)象，因此，使用這類固定相的色譜過程也稱為鍵合相色譜（Bonded Phase Chromatography）。第6頁/共30頁77.3.1分離原理 在分配色譜中流動相和固定相是互不相溶的兩種液體，溶質(zhì)既溶解于固定相，也溶于流動相中，并根據(jù)在兩相中的溶解度

6、不同而分布于兩相中，類似液液萃取過程。7.3.2固定相）載體圖7.3 硅膠表面化學第7頁/共30頁8）鍵合反應）固定相的性質(zhì)7.3.3流動相圖7.4反相HPLC主要溶劑與水混合時溶劑強度的比較，ACN乙腈，MeOH甲醇，THF四氫呋喃第8頁/共30頁92)正相色譜）反相色譜圖7.5 反相HPLC中流動相pH值對組分分離的影響第9頁/共30頁10圖7.6離子強度對PTH（乙內(nèi)酰苯硫脲）組氨酸（H）和精氨酸（R）衍生物保留的影響第10頁/共30頁117.3.4溶質(zhì)的保留 以鍵合固定相為基礎的分配色譜，特別是反相色譜，由于流動相選擇的隨意性，可分析的樣品范圍非常廣。7.4離子對色譜 離子對色譜（Io

7、nPair Chromatography）源于液液萃取過程，是經(jīng)典的離子型化合物的分離方法。7.4.1分離原理 7.4.2離子對試劑7.4.3固定相 在反相離子對色譜中主要使用鍵合相。鍵合固定相對分離的影響主要是表面覆蓋程度和鍵合相的種類。比較差的固定相難以得到重復性的結果，也難以對分離作出預測。常使用的固定相是C18或C8鍵合相，短鏈的穩(wěn)定性比較差。第11頁/共30頁127.4.4流動相(1)介質(zhì) (2)對離子的濃度(3)有機改性劑圖7.7 固定相中配對離子濃度（mol/g)對K(對數(shù)值）的影響第12頁/共30頁137.4.5應用 離子對色譜主要用于離子型或可離子化的化合物，這些化合物多數(shù)與

8、生命科學有關系，如天然化合物、合成藥物、生物體液等。這些化合物如果不經(jīng)過處理采用常規(guī)正、反相色譜方法是難以分析的。因此，在這些領域的研究中，離子對色譜具有廣泛的用途。7.5離子交換與離子色譜 離子交換現(xiàn)象作為一種色譜技術始于20世紀50年代氨基酸的分析，并成為現(xiàn)代液相色譜技術發(fā)展的開端。雖然其他色譜技術也可以分離離子型化合物，但相比之下離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography）和以離子交換為基礎的離子色譜（Ion Chromatography）在離子型化合物的分析中，特別是環(huán)境、食品及金屬化合物等樣品的分析中仍具有廣泛的用途。7.5.1離子交換原理7.5.2固定相第

9、13頁/共30頁14）聚合物交換劑（）化學性質(zhì)（）物理結構圖7.8 離子交換劑的類型第14頁/共30頁15）硅膠鍵合相7.5.3流動相圖7.9 硅膠鍵合離子交換劑的化學結構第15頁/共30頁16圖7.9 硅膠鍵合離子交換劑的化學結構第16頁/共30頁177.5.4離子色譜 圖7.11雙柱離子色譜工作原理示意圖第17頁/共30頁18圖7.12 離子色譜抑制膜工作原理第18頁/共30頁197.5.5離子色譜流動相 離子色譜流動相雖然總的趨勢是降低離子強度，但雙柱和單柱仍有不同。除離子分離的共同目的外，雙柱要考慮離子抑制形式，單柱只考慮與檢測方法的匹配。 ）雙柱（）陰離子（）陽離子）單柱第19頁/共

10、30頁20（）陰離子（）陽離子）假峰7.6體積排阻色譜 溶質(zhì)分子在多孔填料表面上受到的排斥作用稱為排阻（exclusion）。產(chǎn)生排阻現(xiàn)象的原因很多，如帶電粒子的電荷，溶質(zhì)分子的大小和空間結構，等等。根據(jù)這種現(xiàn)象，將溶質(zhì)分離的色譜過程稱為排阻色譜。7.6.1分離原理 固體填料表面有不同尺寸的孔，它們按一定規(guī)律分布，并在制造過程中加以控制。試樣中溶質(zhì)的體積，即分子量，也不同，對于齊聚物，分子大小的分布也有一定規(guī)律?，F(xiàn)在用一個孔來說明溶質(zhì)的分離過程。第20頁/共30頁21圖7.14 體積阻組色譜的校正曲線第21頁/共30頁227.6.2固定相圖7.15 孔徑與分離范圍之間的關系7.6.3流動相 7

11、.7.1基本原理7.7.2配體 配體應具有下列性質(zhì)：與反配體物生成可逆復合物；生成的復合物具有選擇性，并在一定條件下要有足夠的穩(wěn)定性；具有可固定在載體上的功能團，且反應具有專一性，避免非特異吸附及其他反應。第22頁/共30頁23）特異性配體）非特異性或組特異性配體7.7.3載體(1)有機或生物聚合物，如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等軟性載體。(2)合成聚合物，如高交聯(lián)度苯乙烯二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酰胺、N丙烯?；鶈徇cN,N亞甲基一二酰胺共聚、羥基甲基丙烯酸、乙酯與二甲基丙烯酸乙烯酯共聚以及三丙烯?；酆衔锏取?3)無機物，如多孔玻璃、硅膠和氧化鋁等。7.7.4載體活化 載體活化很重要。在溴化氰活

12、化法（Axen.R.1967）引入之前，活化一直是影響親和色譜發(fā)展的障礙之一。配體固定在載體上稱為固定化。配體要固定在載體上它們之間必須有相互作用的極性基團，才能形成穩(wěn)定的固定相。第23頁/共30頁247.7.5固定化 圖7.16 間隔臂對配體效率的影響7.7.6洗脫 ）吸附）洗脫7.8手性色譜 飽和碳原子可以結合四個原子或基團形成以碳原子為中心的四面體結構。當與碳聯(lián)結的四個原子或基團完全不同時，可能出現(xiàn)兩個分子不能重疊的現(xiàn)象。第24頁/共30頁257.8.1分離原理（1）固定相（液體或固體）是手性的，流動相是非手性的。（2）固定相是非手性的，流動相是手性的，即在流動相中添加手性試劑。圖7.1

13、7 三點作用模型第25頁/共30頁267.8.2固定相7.8.2固定相圖7.18 纖維素和支鏈淀粉的化學結構第26頁/共30頁272)環(huán)糊精（Cyclo dextrins，CD）圖7.19 環(huán)糊精的化學結構和它在水相中的假想構型第27頁/共30頁28）蛋白質(zhì)鍵合相）合成聚合物）選擇基鍵合相）配體交換固定相7.8.3流動相（）纖維素及其衍生物（）環(huán)糊精（）蛋白質(zhì)鍵合相（）合成聚合物（）鍵合相7.8.4手性流動相 普通硅膠鍵合相具有很好的色譜性能，但它不能直接用于旋光異構體的分離。如果把選擇基添加到流動相中，則可以使用這些鍵合相，并且有較寬的選擇性。第28頁/共30頁297.9高效液相色譜的應用 高效液相色譜的出現(xiàn)與發(fā)展，使色譜的應用領域驟然擴大。就其分析的樣品而言幾乎無所不包，如：烴與芳烴，含氧、氮、