蛋白質(zhì)一級結構的測定

1、 蛋白質(zhì)一級結構的測定蛋白質(zhì)一級結構的測定魏濤 蛋白質(zhì)的一級結構指：蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸蛋白質(zhì)的一級結構指：蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置。組成一個蛋的排列順序，包括二硫鍵的位置。組成一個蛋白質(zhì)分子的多肽鏈的數(shù)目和多肽鏈中氨基酸的白質(zhì)分子的多肽鏈的數(shù)目和多肽鏈中氨基酸的精確序列是蛋白質(zhì)一級結構的兩個重要方面。精確序列是蛋白質(zhì)一級結構的兩個重要方面。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎。白質(zhì)生物功能的基礎。一級結構一級結構 ( Primary Structure )包括以下幾方面內(nèi)容：包括以下幾方面內(nèi)容：多肽鏈的數(shù)

2、目；多肽鏈的數(shù)目；每條多肽鏈中氨基酸的種類、殘每條多肽鏈中氨基酸的種類、殘 基數(shù)目和基數(shù)目和排列次序排列次序；鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的位置和數(shù)目。鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的位置和數(shù)目。 從蛋白質(zhì)開始的蛋白質(zhì)序列分析 從DNA開始推蛋白質(zhì)氨基酸序列 質(zhì)譜法測定蛋白質(zhì)的一級結構測定的基本戰(zhàn)略測定的基本戰(zhàn)略測定一級結構的準備工作測定一級結構的準備工作測定一級結構的基本步驟測定一級結構的基本步驟p用兩種裂解肽鏈的方法用兩種裂解肽鏈的方法, ,分別得到裂解肽分別得到裂解肽段；段；p 分離提純肽段分離提純肽段, ,測出各個肽段的氨基酸測出各個肽段的氨基酸序列；序列；p 對兩套肽段序列比較對兩套肽段序列比較, ,找出重疊

3、肽找出重疊肽, ,確定確定各肽段位置各肽段位置, ,拼湊整個肽鏈的氨基酸排序。拼湊整個肽鏈的氨基酸排序。p對樣品純度的要求對樣品純度的要求 97%97%p 對蛋白質(zhì)分子量的測定對蛋白質(zhì)分子量的測定 誤差誤差10%10%p 測定分子中多肽鏈的數(shù)目與種類測定分子中多肽鏈的數(shù)目與種類p 蛋白質(zhì)的氨基酸組成蛋白質(zhì)的氨基酸組成p 蛋白質(zhì)的配基蛋白質(zhì)的配基p 蛋白質(zhì)的端基分析蛋白質(zhì)的端基分析 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈 測定多肽鏈的氨基酸組成測定多肽鏈的氨基酸組成 分析多肽鏈的分析多肽鏈的N N末端和末端和C C末端末端 斷裂

4、多肽鏈內(nèi)的二硫鍵斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵 多肽鏈斷裂成肽段多肽鏈斷裂成肽段 測定各個多肽段的氨基酸順序測定各個多肽段的氨基酸順序 確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置確定原多肽鏈中二硫鍵的位置 測得相對分子質(zhì)量測得相對分子質(zhì)量Mr 很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對分子量，如：滲透很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對分子量，如：滲透壓、擴散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過濾、凝膠電泳等，壓、擴散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過濾、凝膠電泳等， 測定末端氨基酸測定末端氨基酸數(shù)數(shù)x X (m /Mr ) = n (蛋白質(zhì)分子中肽鏈蛋白質(zhì)分子中肽鏈數(shù)目數(shù)目)（m為樣品質(zhì)量）為樣品質(zhì)量） 變性：變性

5、：8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/LHCI6mol/LHCI，或高，或高濃度鹽溶液濃度鹽溶液 如有如有二硫鍵交聯(lián)二硫鍵交聯(lián)：巰基乙醇，或過氧乙：巰基乙醇，或過氧乙酸處理酸處理 凝膠過濾或電泳分離不同肽鏈凝膠過濾或電泳分離不同肽鏈酸水解：酸水解：堿水解：堿水解：甲基磺酸水解：甲基磺酸水解： 優(yōu)點：優(yōu)點： 不破壞色氨酸，不破壞色氨酸， 經(jīng)堿中和后可直接上機自動分析經(jīng)堿中和后可直接上機自動分析 缺點：缺點：不能有碳水化合物存在不能有碳水化合物存在 中和點不易掌握中和點不易掌握計算出各種氨基酸分子比計算出各種氨基酸分子比多肽鏈分子量多肽鏈分子量確定氨基酸組成確定氨基酸組成 N末端氨基酸分

6、析末端氨基酸分析丹黃酰氯法丹黃酰氯法(DNS)： 優(yōu)點：可直接層析或電泳分離，熒光檢測定性優(yōu)點：可直接層析或電泳分離，熒光檢測定性 定量；靈敏度高定量；靈敏度高(較較二硝基氟苯二硝基氟苯 法法高高100倍倍) 二硝基氟苯二硝基氟苯 (DNFB or FDNB)法法 ； 氨肽酶法；氨肽酶法；多肽多肽 OCCHNH2 +R+ HCI弱堿性弱堿性+ DNS-氨基酸氨基酸酸水解酸水解游離氨基酸游離氨基酸有機溶劑萃取有機溶劑萃取溶于水溶于水定量定量 + 定性定性確定確定N末端氨基酸末端氨基酸確定肽鏈數(shù)目確定肽鏈數(shù)目多肽多肽 OCCHNHRDNS-氨基酸氨基酸 要求：斷裂點較少，專一性較強、產(chǎn)率高要求：斷

7、裂點較少，專一性較強、產(chǎn)率高酶裂解法：酶裂解法：常用的酶：常用的酶： 胰蛋白酶：僅斷裂胰蛋白酶：僅斷裂Lys、Arg羧基形成的肽鍵羧基形成的肽鍵（但）（但） 糜蛋白酶：糜蛋白酶：位點：位點：Tyr、Phe、Trp羧基肽鍵羧基肽鍵 胃蛋白酶：位點：兩種疏水性氨基酸形成的胃蛋白酶：位點：兩種疏水性氨基酸形成的肽鍵肽鍵 嗜熱菌蛋白酶：專一性較差嗜熱菌蛋白酶：專一性較差 金黃色葡萄球菌蛋白酶（金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：蛋白酶）： 梭狀芽孢桿菌蛋白酶（梭狀芽孢桿菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：蛋白酶）：化學裂解法：化學裂解法：溴化氰法：溴化氰法：專一性斷裂蛋氨酸羧基形成的肽鍵專一性斷裂蛋氨酸羧基形

8、成的肽鍵Edman降解法降解法：一次可連續(xù)測定：一次可連續(xù)測定6070個氨個氨基酸；程序復雜，工作量大；基酸；程序復雜，工作量大；酶降解法：酶降解法：質(zhì)譜法質(zhì)譜法：Edman reagentPTC-多肽多肽少一個少一個N-末端末端氨基酸的肽鏈氨基酸的肽鏈層析色譜鑒定層析色譜鑒定重復重復與與DNS法聯(lián)合法聯(lián)合 多肽鏈氨基酸系列的直接測定：最初于多肽鏈氨基酸系列的直接測定：最初于1954年由英國劍橋大學的年由英國劍橋大學的Sanger實驗室建立；現(xiàn)實驗室建立；現(xiàn)主要由編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序推導主要由編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序推導. 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 美國生物醫(yī)學基金會的美國生物醫(yī)學基金會的PIR (Protein Information Resource or Protein Identification Resource); 美國政府的美國政府的Gen Bank (Gene Sequence Data Bank) 歐洲的歐洲的EMBL (European Molecular