果膠酶應用基理及活性檢測方法

1、果膠酶應用基理及活性檢測方法2013-1-23 16:57:21隨著人們對健康環(huán)保紡織品需求的增加以及各國政府對環(huán)境保護強制力度的加大，在紡織印染行業(yè)中一種新型的紡織助劑生物酶制劑的應用逐漸發(fā)展起來。目前，一種基于果膠酶的新型紡織生物助劑正在應用推廣中，它主要用于棉、麻的前處理工藝。由于紡織企業(yè)多數(shù)對果膠酶的生物特性不甚了解，在工藝應用過程中缺乏相應的檢測手段，使其推廣受到限制。酶活力（活性）是衡量酶生物活性及含量的重要指標，因此，建立適用于紡織行業(yè)的果膠酶酶活檢測方法，是十分迫切和必要的。2果膠酶的酶促作用機理果膠酶是一類復合酶，是指分解果膠質的多種酶的總稱。我們測定的酶活值通常是這一 類復

2、合酶協(xié)同作用的綜合結果。果膠酶可分為兩大類：解聚酶和果膠酯酶。解聚酶主要是通過水解作用和反式消去作用，切斷果膠和果膠酶分子a-1,4糖苷鍵，將果膠分子降解為小分子。果膠酯酶的作用是使果膠分子中的甲酯水解，最后形成果膠酸。果膠質主要是由D -半乳糖醛酸以a1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物。部分D-半乳糖醛酸上的羧基被甲醇酯化、形成甲酯，或被一種或多種堿部分或全部中和。果膠質在植物的細胞組織中起著粘合”作用，在棉纖維的初生胞壁中，果膠質含量約占9%，而麻纖維則更高。通過果膠酶的作用，將果膠質降解為小分子物質，從纖維中游離出來，可使與其粘合在一起的其它雜質（如蠟質、蛋白質、灰份等）與纖維素徹底分開

3、，達到棉精煉或麻脫膠的目的。對于紡織行業(yè)，需要的是將果膠催化水解成可游離出纖維的、小分子物質的果膠酶活性（力），因此，主要測定解聚酶的活力。解聚酶對果膠分子的酶促催化作用表現(xiàn)為，每切斷一個果，即可膠分子的 a-1,4糖苷鍵，就會形成一個還原性醛基。通過測定這些還原性醛基生成的量 判定解聚酶的酶活力。3測定酶活力 （性 ）的基本原理酶作為一種生物催化劑,其酶活力值是與其催化效率及有效（ 即有生物活性 ） 酶的含量相關的。酶活力是酶在單位時間內將底物轉化為反應產物的能力，以U （mol /時間）表示，底物即是酶催化的反應物。通常，酶制劑的活力是以U / g酶制劑（或U/mL酶制劑）表示，把酶制劑的

4、量和活力聯(lián)系在一起，稱為“比活力”。在特定條件下 ，通過測定單位量的某種酶制劑在單位時間內催化足夠量底物生成反應產物的量 ，即可測出此酶制劑的比活力。根據酶促反應動力學的米氏學說 ，從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā) ，按照“穩(wěn)態(tài)平衡 ”假說的設 想， 可推導出如下公式 :產物生成速率=k 3總酶底物/（底物+ km ）（1）式中:總酶酶的總濃度 （mol /mL ）;底物底物濃度 （mol /mL）;k 3 在酶促反應的第二步 ，形成最終產物的速率常數(shù) ;km米氏常數(shù)（mol / mL ）,其值是當酶反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度。要估計總酶,首先要固定所有可控制的獨立變量，如pH值、溫度等

5、。當?shù)孜?gt;> Km時，底物對反應速率的影響可忽略（酶飽和），酶促反應達到最大反應速率Vmax，其結果是：產物生成速率=k 3總酶=Vmax = UU就成為總酶量的一種測量。因此，可以通過測定U來反映酶制劑中有效酶蛋白的含量。4果膠酶酶活的測定方法概述和比較測定果膠酶酶活的方法有很多,但基本上都是利用酶促分解果膠產生的粘度下降或生成的還原性醛基來測定果膠酶酶活。 這些方法概括起來主要有粘度降低法、 滴定法和分光光度 法3種。本文分別選取一種較典型的測定方法加以介紹。4.1 粘度降低法4.1.1 原理果膠溶于水后形成粘稠狀溶液,其粘度和溶解度與其聚合和酯化程度有關?？梢岳霉z的這種性

6、質 , 測其酶活力。即在一定溫度、酶濃度下和一定反應時間內 , 測定標準果膠溶液 粘度的降低率。4.1.2 操作方法浴中保溫10 min后，加入1mL酶液，繼續(xù)保溫,在不同時間分別測定反應混合液流出粘 度計小球的時間。對照實驗采用經熱處理已失活的酶液。4.1.3 計算粘度下降百分數(shù)可用下式表示 :粘度下降()=100( To - T )/( To -T "(2)式中：T、To和T a分別為反應混合液、對照混合液和緩沖液的流出時間(s )。酶溶液要預先稀釋，使粘度降低范圍在20%80%。在此范圍內，酶濃度對數(shù)與粘度降低 率成正比。以酶作用時間為橫坐標、粘度下降百分數(shù)為縱坐標做標準曲線，

7、在圖中查出粘度下降50%時對應酶的作用時間(T 1/2)。在上述條件下，引起粘度下降50%的酶量為10個果膠 酶活力單位 ，即酶活單位 =10/( T 1/2/3600) 。4.2滴定法4.2.1 原理果膠酶徹底水解果膠 ,生成半乳糖醛酸 ;半乳糖醛酸可與碘 (過量 )反應。反應后剩余的碘 可用硫代硫酸鈉溶液滴定 ,據此可得出酶解反應產生的半乳糖醛酸的量。以生成半乳糖醛酸 的量衡量果膠酶的活力。4.2.2 測定方法取1%果膠溶液10 mL，加入到5 mL酶液和5 mL水，調pH至3.5,在50 C水浴中保持2 h ,取出加熱煮沸。冷卻后，取5mL反應液移入碘量瓶中，加1 M碳酸鈉溶液1 mL

8、,0.1 N碘液5 mL ,搖勻，加塞,于室溫下放置20 min，加2N硫酸2 mL，用0.05 N硫代硫酸鈉滴定至淡黃 色，加0.5%淀粉指示劑1 mL ,繼續(xù)滴定至藍色消失為止。記錄所消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)A?？瞻自囼炗?0 mL果膠溶液、10 mL水，不加酶液，不經保溫，直接取此混合物5 mL于100 m L三角瓶中用于滴定，記錄消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)E。4.2.3計算在上述條件下,1 h酶促轉化果膠、生成1 mg當量游離半乳糖醛酸所需的酶量定為一個酶活單位。每毫升酶液的活力單位 =(B - A )N >0.51 >20.(5 X2 0)(3)式中 :N 硫代硫酸鈉的當量濃度

9、 ;0.511 mg當量硫代硫酸鈉相當于0.51 mg當量的半乳糖醛酸；20 分解果膠反應液的總體積數(shù);5、 2、 5 分別表示反應中加入酶液的毫升數(shù)、反應時間、滴定時所取反應液的毫 升數(shù)。4. 3分光光度法4.3.1 原理果膠酶分解果膠 ,產生帶有還原性醛基的還原糖（以半乳糖醛酸計 ）,一些顯色劑可與其發(fā)生顯色反應。根據顏色深淺的不同,可以通過分光光度計測定果膠酶酶活值的大小。本文以最常用的DNS比色法介紹此檢測方法，其顯色劑為3,5-二硝基水楊酸。4.3.2 操作方法取0.5%果膠溶液0.5 mL加入到0.5 mL酶液中，搖勻。在50 C水浴中準確反應0.5 h ,取 出后，迅速在沸水浴中

10、加熱5 min ,冷卻。取0.5 mL反應液移入加有 0.5 mLDNS試劑的試 管,加4mL蒸餾水，搖勻，在沸水浴中加熱5min ,迅速冷卻。用分光光度計在540 nm處測其 吸光度值。參比液配制：加熱滅活5 min的0.5 mL的稀釋酶液與0.5 mL 0.5%果膠溶液充分 混合。4.3.3計算采用標準曲線法，配制一系列已知濃度的標準葡萄糖溶液，在540 nm處測定吸光度（A ）,以葡萄糖濃度（C ）為橫坐標、吸光度（A ）為縱光標作A . C標準曲線（參見5.2節(jié)圖2）。由標準 曲線可得公式 ：A =斜率XC （mg葡萄糖/ mL ）（4）未知試液測定吸光度值A后，可通過上式求得C （m

11、g葡萄糖/mL ）。在上述條件下，每小時內每毫升果膠酶酶促轉化果膠生成1mg當量還原糖（以半乳糖醛酸計 ）所需的酶量定義為一個酶活單位。即：果膠酶活（m g半乳糖醛酸/ m L h ）=酶液稀釋倍數(shù)XC （ m g葡萄糖/ m L） X2 X194/180（5）式中：194/180 葡萄糖換算成半乳糖醛酸的量 ;2測定中稀酶液被 0.5% 果膠溶液稀釋的倍數(shù)。4.43 種方法的比較將粘度降低法用來測定果膠酶的復合酶活力比較準確,但操作過程也相對復雜 ,且測定靈敏度不高。滴定法設備使用簡單,測試重現(xiàn)行好 ,準確度高 ,但測定時間長 ,過程較繁瑣 ,試劑用量較大。 而分光光度法測定的靈敏度、 準確

12、度均高 ,重現(xiàn)性好 ,試劑用量少 ,尤其是操作省時、 簡便。對于上述 3 種測定方法 ,根據紡織行業(yè)的特點 ,筆者認為分光光度法更適于紡織工作者 應用。下面重點探討DNS比色法在實際應用中的一些具體問題。5應用DNS比色法測定果膠酶酶活5.1果膠溶液的配制以及酶液的稀釋 果膠溶液的配制濃度以及酶液的稀釋倍數(shù)是相互聯(lián)系的兩個數(shù)據,它們的確定對酶活測定結果的正確性起著關鍵作用。通過完成以下試驗,可以確定有關參數(shù)條件。5.1.1 材料與方法5.1.1.1 儀器與試劑UV 9200分光光度計；果膠（Sigma卜果膠酶制劑（NOVO卜3,5-二硝基水楊酸、 巴比妥酸、巴比妥鈉。5.1.1.2 溶液配制D

13、NS 試劑：將 6.3 g 3,5-二硝基水楊酸、 262 mL 2 mol / LNaO H加到 500 mL含182 g酒石酸鈉的熱水溶液中,再加5 g苯酚及5 g亞硫酸鈉，待溶解、冷卻后，加蒸餾水定容至 1000 mL ,貯于棕色瓶中 ,一周后即可使用。5.1.1.3配制巴比妥緩沖液（pH =8.6）稱取1.84 g巴比妥酸 置于5660 C水中溶化 撚后加入10.3 g巴比妥鈉，加蒸餾水定容至 1000 mLo5.1.1.4配制0.5%果膠溶液準確稱取0.5 g果膠于燒杯中，用巴比妥緩沖液（pH =8.6）溶解、稀釋定容至100 mLo5.1.2制作果膠酶稀釋倍數(shù)與吸光度關系曲線分別按

14、表1的稀釋倍數(shù)用蒸餾水稀釋果膠酶，將稀釋酶液按432測定吸光度值，以果膠酶稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標，吸光度（A ）為縱坐標作關系曲線（見圖1） o果.阪曲的干同得稈帶數(shù)於相應般此康帖図抵什利毓厲厲甜尺"Ml j佛潔為啦朮庫粧用MO miLW01帕tiSJD5(10.415wa想札汗4WKI0.1戲2(11 網Ur i7O.IDO -11110巒40礎加圖1果膠薊稀釋倍數(shù)與吸光虞A的關系劇線5.1.3結果與討論由公式（4）、（5）可得出，在酶活相同的情況下，吸光度與酶液稀釋倍數(shù)的倒數(shù)應呈正比例關系o圖1為試驗測得的果膠酶稀釋倍數(shù)的倒數(shù)與其酶活力吸光度值關系曲線，從中可看出果膠酶的稀釋倍數(shù)

15、過低或過高都會偏離正比的線性關系，尤其在稀釋倍數(shù)過低的情況下。原因可能有以下兩點：根據米氏學說，底物濃度應保持足夠大到使酶飽和，達到最大反應速率，酶,而不能滿足這種正比活值與酶濃度才能成正比。過高的酶液濃度可能使底物濃度相對不足關系。根據朗伯-比耳定律，吸光度與濃度間只在一定范圍內有較好的正比關系，酶促反應產生的高濃度產物與DNS的絡合物顏色過深，會超過這一范圍產生較大誤差。稀釋倍數(shù)過高時吸光度值也偏離朗伯 -比耳定律 ，但仍滿足底物使酶飽和的條件，因此產生的偏差相對小得多。果膠溶液的配制一定要有足夠大的量，但過大的果膠濃度又會使溶液粘度加大，增加操作的誤差。經過反復試驗,在反應30 min條

16、件下確定0.5%的果膠濃度,效果最好。將表1的最 高稀釋倍數(shù)和最低稀釋倍數(shù)的吸光度值刪除 ，對其它數(shù)據進行回歸分析，得到曲線的回歸方程為：A =820.72 C(R 2=0.9943)。表明其線性相關度很好，說明當酶制劑稀釋液的吸光度值在0.20.4范圍內時，其酶活值有很高的準確度。用自產的粗酶液進行了同樣的試驗，也得到相同結果 ( 見表 2) 。因此，可以確定果膠溶液濃度為 0.5%， 控制酶液稀釋倍數(shù)使吸光度值在 0.2 0.4范圍內。5.2葡萄糖標準曲線的繪制繪制葡萄糖標準曲線的目的 ，也是找到葡萄糖溶液濃度與吸光度最佳線性關系的范圍。繪制的參考數(shù)據及結果見表 3、圖2。由圖 2可見，在

17、此范圍內 ，曲線有較好的線性關系。S3埠制X1菊粹炸淮茅進散嫌慚戢度口詔.LJ1(Fn1(1a. L%20(I. 2料百Sa. wt6a.75 if鬲麗iKltt標準工柞曲繡:咄陀網 |門力押 A-«I «L4in El -Q. ma本測定方法采用葡萄糖繪制標準曲線，因為葡萄糖易得，且價錢便宜。用還原糖作為標準 曲線,是為了標定果膠分解產生的還原性醛基的量。在公式（5）的求酶活公式中，有一項葡萄糖與半乳糖醛酸的轉換系數(shù)，可換算為以半乳糖醛酸計。因此，無論用哪種還原糖作標準曲線結果都是相同的。5.3試驗溫度和pH范圍酶促反應都有最佳反應溫度和pH范圍。在最佳酶反應范圍內，酶作用的活力最高。最佳酶反應pH值和溫度的范圍是由酶的自身性質、特點所決定的，過多偏離此范圍會使酶的活性降低甚至失去活性。因此在測定果膠酶活性時，作用溫度和pH值要與其最佳反應條件范圍相一致。最佳酶反應條件一般會由酶制劑廠家提供。在紡織領域應用的果膠酶，一般以堿性果膠酶為主。本試驗應用的就是堿性果膠酶，其最佳反應條件是溫度 4555 C，pH范圍89。配制果膠酶溶液用巴比妥緩沖液（pH =8.6），在50 C水浴中進行酶促反應可獲得最佳試驗結果。5