結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測PPT課件

1、 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測是檢測結(jié)核分枝桿菌特異的核酸序列； 陽性結(jié)果提示該檢測結(jié)核分枝桿菌核酸的存在，在排除核酸污染的情況下，可確定該檢測標(biāo)本中存在結(jié)核分枝桿菌。 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測較常采用的目的片段有16SrRNA、IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等第1頁/共25頁結(jié)核分枝桿菌核酸檢測增加分子生物學(xué)陽性可以作為確診標(biāo)準(zhǔn)，及強調(diào)病原學(xué)檢查的重要性。3.4.2 分子生物學(xué)檢查 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性。4 診斷原則 肺結(jié)核的診斷是以病原學(xué)（包括細菌學(xué)、分子生物學(xué)）檢查為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、相關(guān)的輔助檢查及鑒別診斷等，進行綜合分析做出診斷。以病原學(xué)、病理學(xué)結(jié)果作為確

2、診依據(jù)。5.3 確診病例結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性，及胸部影像學(xué)檢查支持即可確診。第2頁/共25頁常用技術(shù) 傳統(tǒng)實時熒光定量PCR檢測 半巢式全自動實時熒光定量PCR檢測 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測 實時熒光核酸恒溫擴增檢測 交叉引物恒溫擴增檢測 基因探針檢測第3頁/共25頁抗酸染色抗酸染色每張檢查每張檢查3-5min3-5min或更長時間或更長時間陽性率低陽性率低因素之一因素之一熒光染色熒光染色1.1.陽性率陽性率30%30%2.2.無法區(qū)分無法區(qū)分TBTB or or NTBNTB1.1.假陽性率高假陽性率高2.2.結(jié)合抗酸染色結(jié)合抗酸染色第4頁/共25頁結(jié)核菌需要先培養(yǎng)出來（2-6周）再加入不同濃

3、度抗菌藥物的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-8周報告藥敏結(jié)果第5頁/共25頁n肺結(jié)核所有患者，包括兒童，當(dāng)疑似肺結(jié)核并可咳痰時，應(yīng)送2份痰做涂片鏡檢 或 1份痰做Xpert MTB/RIF檢測對于涂陰疑似肺結(jié)核患者，應(yīng)當(dāng)使用Xpert MTB/RIF 或培養(yǎng) 進行診斷n耐藥結(jié)核當(dāng)患者具有耐藥結(jié)核的風(fēng)險，或者合并HIV感染，或者病情嚴重時，應(yīng)使用Xpert MTB/RIF做初始診斷；n肺外結(jié)核所有患者，包括兒童，懷疑有肺外結(jié)核時，應(yīng)當(dāng)采集相應(yīng)的樣本進行微生物學(xué)和組織學(xué)檢查；優(yōu)先推薦使用Xpert MTB/RIF 做初始診斷第6頁/共25頁GeneXpertXpert MTB/RIF一種半巢式實時熒光PCR體

4、外診斷技術(shù)，可以檢測結(jié)核分枝桿菌以及利福平耐藥性； 針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計引物、探針。5個探針結(jié)合到野生型，而不是突變體目標(biāo)。每個探針用不同的熒光染料標(biāo)記，允許同時檢測。第7頁/共25頁痰標(biāo)本與處理液1：2混合吸取2ml處理樣品到反應(yīng)盒將反應(yīng)盒放入檢測模塊（手工操作完成）標(biāo)本自動清洗過濾超聲裂解DNA提純DNA和PCR反應(yīng)試劑混合半巢式實時熒光定量核酸擴增檢測打印檢測報告獲得檢測結(jié)果時間：1小時50分鐘系統(tǒng)內(nèi)自動完成第8頁/共25頁 INH單耐藥的患者通常不會考慮立即改變治療方案，與此相反，對RIF單耐藥的患者，無論INH是否耐藥，都會采取與耐多藥患者相同的

5、治療方案1。 約90%利福平耐藥的結(jié)核患者同時異煙肼耐藥，也就是耐多藥結(jié)核患者2。1.Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831.2. Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the

6、 peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.“結(jié)核+利福平耐藥”對多耐結(jié)核控制產(chǎn)生的效果最為顯著。即便補充異煙肼耐藥，能提升的效果有限。第9頁/共25頁環(huán)介導(dǎo)等溫擴增儀（TB-LAMP）體外定性檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群； 在恒溫條件下進行基因擴增反應(yīng)；4種引物識別6個區(qū)域，特異性高；擴增反應(yīng)效率高，67，40min。主要優(yōu)點在于對實驗室儀器的依賴程度較小，而且試劑成本較低。第10頁/共25頁傳統(tǒng)實時熒光定量PCR檢測 目的：定量檢測人標(biāo)本中

7、的結(jié)核分枝桿菌核酸 原理：PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累計實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的辦法。第11頁/共25頁Xpert MTB/RIFTB-LAMP結(jié)核桿菌DNA目的基因片段rpoBgryB及IS6110IS6110方法半巢式實時熒光PCR環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增實時熒光定量PCR時間2小時1小時2.5小時檢測敏感度131菌條/ml100菌條/ml100010000菌條/ml優(yōu)點全自動、同時檢測利福平耐藥基因、特異性高，生物安全性高67恒溫擴增，擴增時間短，特異性高，生物安全性高適合大批量篩查，低費用缺點最多一次同時檢測八個樣本標(biāo)本用量較少，除痰標(biāo)本以

8、外的標(biāo)本需進一步認證假陽性，易污染，需專業(yè)人員操作第12頁/共25頁樣本類型（一） 抗酸桿菌涂片鏡檢： 痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本 分枝桿菌分離培養(yǎng)： 痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本、血液 結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測： 痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本、血液（GeneXpert除外）、病理切片第13頁/共25頁樣本類型（二） 分枝桿菌菌種鑒定

9、 臨床分枝桿菌分離培養(yǎng)物 結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗： 臨床分離結(jié)核桿菌純培養(yǎng)物 結(jié)核抗體的檢測： 血清 IFN-釋放試驗（T-SPOT.TB）： 肝素鋰或肝素鈉抗凝血第14頁/共25頁標(biāo)本留取標(biāo)準(zhǔn) 1.痰標(biāo)本： （1）可疑肺結(jié)核患者：初診病人應(yīng)收集3份標(biāo)本（當(dāng)日即時、夜間和次日晨痰），治療中或隨訪病人應(yīng)按期留取2份痰標(biāo)本（晨痰、夜間痰），體積35ml，盛于廣口和具有螺旋蓋子的痰瓶中。（2）即時痰采集后立即送檢，夜間痰和晨痰采集后常溫保存不應(yīng)超過12小時，對當(dāng)日不能進行涂片檢查的標(biāo)本，須置于4冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。（3）對無法咳痰的患者：可使用高滲鹽水（3% NaCl）誘導(dǎo)痰或收集

10、清晨胃液標(biāo)本，或使用支氣管鏡采集支氣管灌洗液標(biāo)本。第15頁/共25頁 2支氣管抽吸物、支氣管肺泡灌洗標(biāo)本、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本 （1）對于不能留取痰標(biāo)本的患者：推薦使用侵入性采集技術(shù)獲取標(biāo)本，比如纖維支氣管鏡檢查、細針肺穿刺、肺活組織檢查。 （2）嚴格器械清潔和消毒，避免引起交叉污染和感染。 （3）支氣管鏡不能接觸自來水，通免污染環(huán)境分枝桿菌。 （4）對難以診斷的病例推薦使用其他侵入性技術(shù)采集標(biāo)本，比如細針穿刺、開放肺活組織檢查，無菌條件下采集的經(jīng)支氣管活檢和其他活檢標(biāo)本，運輸過程中，應(yīng)加入0.51ml無菌的生理鹽水。 （5）支氣管分泌物至少25ml；支氣管肺泡灌洗液至少20-50ml。第16

11、頁/共25頁 3. 胃灌洗液（1）嬰幼兒、兒童和遲鈍者診斷肺結(jié)核時，鑒于無法采集標(biāo)本或支氣管灌洗液，推薦采集胃液標(biāo)本，通過胃灌洗咽下去的痰液。（2）標(biāo)本應(yīng)在采集4小時內(nèi)送到實驗室，否則應(yīng)置于一次性內(nèi)含100ml碳酸鈉酸他的無菌容器中。（3)胃灌洗液需連續(xù)采集3天，體積510ml，調(diào)節(jié)pH至中性。 4.尿液（1）采集標(biāo)本前，應(yīng)清洗外生殖器，推薦連續(xù)采集3天清晨中段尿于無菌容器中，用于培養(yǎng)的尿液標(biāo)本至少需要40ml（2）只有在不能獲得中段尿時，可以使用導(dǎo)尿術(shù)采集標(biāo)本。（3）標(biāo)本運送不及時，應(yīng)冷藏保存。第17頁/共25頁 5. 無菌采集的體液（腦脊液、胸水、腹水、心包積液、關(guān)節(jié)液、骨髓）（1）臨床醫(yī)

12、生采用抽吸技術(shù)或外科操作無菌收集體液標(biāo)本于無菌容器。l 結(jié)核桿菌DNA及Xpert標(biāo)本：為防止標(biāo)本凝固，需加入EDTA抗凝處理（可注入于長紫管中顛倒混勻抗凝處理）。lIFN-釋放試驗（T-SPOT.TB）標(biāo)本：分離淋巴細胞需加入肝素抗凝，抗凝比例為100ml胸腹水加入0.8ml肝素，顛倒混勻。（2）標(biāo)本盡可能快的運送到實驗室（3）應(yīng)提交足夠量的樣本，腦脊液5ml，胸水和腹水510ml。第18頁/共25頁 6無菌采集的組織（淋巴結(jié)、皮膚和其他活檢標(biāo)本） （1）采集標(biāo)本盡可能無菌操作，放置到無固定劑或防腐劑的無菌容器中，不能浸泡在鹽水或其他液體或用紗布包裹，重量不少于1g。應(yīng)迅速運送到實驗室，對于

13、長時間的運輸，為防止脫水可加入無菌鹽水，保持溫度在415 （2）針對皮膚潰瘍，宜從病變組織周邊采集活檢標(biāo)本。 （3）福爾馬林溶液浸泡過的標(biāo)本不能用于培養(yǎng)檢查。 （4）極少量的活檢標(biāo)本可以浸泡在少量無菌鹽溶液中。第19頁/共25頁 7.血液（1）如果血液標(biāo)本接種培養(yǎng)基之前需要運輸，肝素成檸檬酸鹽可以用于抗凝。EDTA抗凝和凝固的血不能做培養(yǎng)。（2）血液和腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)推使且MYCOFLYTIC瓶（BD）血培養(yǎng)瓶。（暫時不做） 8.大便標(biāo)本 大便標(biāo)本涂片的敏感性只有3234，不能根據(jù)涂片的結(jié)果決定是否進行培養(yǎng)。第20頁/共25頁 9、病理組織切片（核酸檢測） 在一只干凈的離心管中加入6-12片5-

14、10m厚的FFPE，勿切白片。 病理組織切片已固定，結(jié)核分枝桿菌已無活性，無法做培養(yǎng)。第21頁/共25頁DNA擴增技術(shù)檢測有哪些不足 相比DNA檢測技術(shù)，RNA檢測更適合判斷病原體轉(zhuǎn)錄活性，DNA檢測技術(shù)不能判斷病原體轉(zhuǎn)錄活性，不能區(qū)分潛伏感染和活動性感染（活動性感染：指示RNA轉(zhuǎn)錄活躍，潛伏感染：指示RNA不轉(zhuǎn)錄） 交叉污染問題 變溫檢測，對儀器要求高 抑制反應(yīng)（Taq酶）第22頁/共25頁免疫斑點干擾素釋放試驗 結(jié)核菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)主要是細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)； T-SPOT.TB定量檢測人外周抗凝全血中受結(jié)核桿菌特異混合多肽抗原（ESAT-6和CFP-10）刺激分泌細胞因子干擾素的效應(yīng)T淋巴細胞數(shù)量。 結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白； 所以的卡介苗菌株均丟失該基因序列 絕大多數(shù)環(huán)境分枝