東亞鉗蝎昆蟲毒素BmK IT的表達、純化以及性質(zhì)研究

1、東亞鉗蝎昆蟲毒素BmK IT的表達、純化以及性質(zhì)研究【摘要】：蝎是一種以體軟昆蟲為食的動物,在長期的進化過程中為生存或防衛(wèi)的需要在其體內(nèi)產(chǎn)生了一系列毒素蛋白。這些活性多肽可選擇性地特異結(jié)合并調(diào)控可興奮細胞膜上的離子通道。它作為十分有價值的探針被廣泛應用于相關靶離子通道分子調(diào)控機理的研究。同時,蝎毒素是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關系的極好模型。其中,蝎昆蟲神經(jīng)毒素(insect-selectivescorpionneurotoxin)能夠?qū)Ｒ蛔饔糜诶ハx而對哺乳動物無害或毒性很小,因此可利用此類昆蟲特異性的蝎神經(jīng)毒素開發(fā)新型生物殺蟲劑和開展抗蟲害轉(zhuǎn)基因植物的研究。本課題組從主要分布于我國的東亞鉗蝎(Bu

2、thusmartrnsiiKarsch,BmK)中克隆到了一種興奮型昆蟲毒素基因(BmKIT)。該毒素蛋白含有69個氨基酸殘基和4對二硫鍵。本研究將BmKIT進行原核可溶性表達,并通過緩沖液的優(yōu)化、Intein自剪切、蛋白質(zhì)氧化重折疊等一系列方法獲得了大量的重組BmKIT,同時對利用大腸桿菌二硫鍵異構(gòu)酶DsbC催化BmKIT折疊進行了初步研究。通過蟲試實驗、全細胞膜片鉗檢測、圓二色譜和結(jié)晶學等方法對其生理生化學性質(zhì)進行深入研究,獲得以下主要結(jié)果:1、東亞鉗蝎昆蟲神經(jīng)毒素的可溶性表達、純化。將BmKIT的C端融合6個組氨酸殘基,通過pTWIN1表達系統(tǒng)獲得了Intein-BmKIT-his_6融

3、合蛋白,該融合蛋白N端為有助溶作用的Intein,C端為純化標簽His_6。通過在Ni-NTA親和柱上誘導Intein自剪切后洗脫得到相對純的BmKIT,其中含有少量未剪切的融合蛋白。Superdex75凝膠過濾層析時發(fā)現(xiàn),目的蛋白主要以多聚體的形式存在,少量為單體。我們將收集的單體進行BmKIT蟲試實驗,1.0和2.0nmol/gBmKIT-his_6的實驗組的半致死時間LT50分別為67±1h和47±1h,表明其具有良好的生物學活性。2、重組東亞鉗蝎昆蟲毒素的氧化折疊。在DnaB-IT融合蛋白中的InteinDnaB部分是具有生物活性的,它們能夠在pH6.5時有效地進行

4、自剪切,但釋放的BmKIT快速聚合沉淀。對DnaB-IT融合蛋白的游離巰基進行測定,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)二硫鍵是在體外蛋白純化過程中形成的。因此,在E.coli中表達的目的蛋白處于未折疊的狀態(tài),二硫鍵沒有完全形成,形成了“可溶性的包涵體”,它含有正確折疊的融合蛋白DnaB和未折疊或折疊錯誤的目的蛋白IT。隨后,在優(yōu)化的條件下,我們對重組BmKIT蛋白進行氧化重折疊,結(jié)果顯示,目的蛋白在柱上有效地進行重折疊,目的蛋白主要以單體的形式存在。純化的BmKIT具有很高的熱穩(wěn)定性,在100下仍保持可溶。因此,我們設計了一個簡單而有效的BmKIT純化方法。表達的上清液首先進行IMAC(immobilizedmeta

5、lionaffinitychromatograpby),洗滌雜蛋白后對目的蛋白進行氧化折疊,然后柱上誘導Intein自剪切,最后洗脫下的目的蛋白經(jīng)過80水浴20min,離心獲得純的BmKIT。最終250ml培養(yǎng)液中能夠得到1.5mg的目的蛋白。3、二硫鍵異構(gòu)酶DsbC催化下的BmKIT氧化折疊。從大腸桿菌中克隆了二硫鍵異構(gòu)酶DsbC,構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pRSETc-DsbC,獲得了大量可溶的DsbC,實驗結(jié)果顯示,重組蛋白His_6-DsbC以二聚體的形式存在,并且具有氧化還原活性和二硫鍵異構(gòu)酶活性。對DsbC在體外和體內(nèi)催化富含二硫鍵的蝎昆蟲毒素BmKIT的氧化折疊進行了初步研究。結(jié)果表明,

6、rDsbC能夠加快BmKIT的折疊速度,但是需進一步對BmKIT和rDsbC的比例進行優(yōu)化。體內(nèi)將BmKIT與DsbC共表達實驗,目前尚未獲得預期效果,大量rIT仍然被吸附在柱材料中,共表達體系有待進一步改進。4、對棉鈴蟲幼蟲神經(jīng)細胞的急性分離與體外培養(yǎng)條件進行摸索,為下一步利用全細胞膜片鉗技術對重組BmKIT作用于棉鈴蟲幼蟲神經(jīng)細胞的電壓門控鈉離子通道的電生理學活性分析奠定了基礎。5、東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmKIT蛋白的晶體生長條件的初步探索。使用HamptonResearch公司的晶體生長試劑盒(CrystalScreeningKit)中的46個條件進行晶體生長條件的初步篩選,蛋白濃度為5mg

7、/mL,于室溫放置,在6號條件(0.1mol/LTris-HCl,pH8.5,0.2mol/L檸檬酸三鈉,30%v/v聚乙二醇400)中篩選到三角錐形晶體,并確定該條件為穩(wěn)定的、可重復的最佳結(jié)晶條件,為BmKIT結(jié)構(gòu)的解析提供了條件?！娟P鍵詞】：東亞鉗蝎興奮性昆蟲神經(jīng)毒素氧化重折疊性質(zhì)分析【學位授予單位】：山西大學【學位級別】：博士【學位授予年份】：2008【分類號】：Q78【目錄】：中文摘要13-15ABSTRACT15-18第一章文獻綜述18-41§1引言18§2蝎昆蟲神經(jīng)毒素的種類18-202.1蝎神經(jīng)毒素的分類18-192.2蝎昆蟲神經(jīng)毒素的分類192.3已知蝎昆蟲

8、神經(jīng)毒素的種類19-20§3蝎昆蟲毒素基因分子生物學研究20-233.1蝎毒素基因組織結(jié)構(gòu)及其mRNA的加工20-223.2蝎毒素cDNA結(jié)構(gòu)及翻譯后的加工22-23§4蝎昆蟲神經(jīng)毒素的結(jié)構(gòu)研究23-264.1興奮型蝎昆蟲神經(jīng)毒素與哺乳動物毒素結(jié)構(gòu)比較23-244.2興奮型蝎昆蟲神經(jīng)毒素的結(jié)構(gòu)特點24-26§5蝎昆蟲神經(jīng)毒素的生物活性測定26-295.1毒理學方法26-275.2電生理學方法27-295.3競爭結(jié)合試驗29§6國內(nèi)外重組蝎昆蟲神經(jīng)毒素的研究進展29-316.1重組蝎昆蟲毒素在原核細胞中的表達306.2重組蝎毒素在真核細胞中的表達30-31

9、§7蝎昆蟲神經(jīng)毒素在農(nóng)業(yè)害蟲防治中的應用31-337.1重組桿狀病毒31-327.2培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物32-33§8參考文獻33-41第二章東亞鉗蝎昆蟲神經(jīng)毒素的可溶性表達、純化41-64§1引言41-441.1蛋白內(nèi)含肽(intein)411.2蛋白質(zhì)的剪接機制41-421.3蛋白質(zhì)剪接的應用42-44§2材料和方法44-522.1實驗材料44-472.2實驗方法47-52§3實驗結(jié)果52-603.1表達載體的構(gòu)建52-533.2重組蛋白的表達53-543.3Intein自剪切條件的優(yōu)化54-553.4緩沖液的優(yōu)化55-573.5BmKIT重

10、組蛋白的純化57-593.6BmKIT-His_6CD光譜59-603.7BmKIT-His_6活性分析60§4討論60-61§6參考文獻61-64第三章重組東亞鉗蝎昆蟲毒素的氧化折疊64-80§1引言64-66§2材料和方法66-682.1實驗材料66-672.2實驗方法67-68§3結(jié)果68-763.1兩種BmKIT融合蛋白純化行為的比較68-703.2兩種BmKIT融合蛋白穩(wěn)定性比較70-713.3重組蛋白二硫鍵的測定71-723.4重組BmKIT的氧化折疊72-753.5重組BmKIT的熱穩(wěn)定性分析75-76§4討論76-78

11、§5參考文獻78-80第四章二硫鍵異構(gòu)酶DsbC催化下的BmKIT氧化折疊80-98§1引言80-81§2材料和方法81-862.1實驗材料81-822.2實驗方法82-86§3實驗結(jié)果86-953.1DsbC基因的克隆863.2DsbC表達載體的構(gòu)建86-883.3DsbC的誘導表達88-893.4rDsbC的純化89-913.5WesternBlot鑒定913.6rDsbC的氧化還原狀態(tài)分析91-923.7DsbC催化蛋白折疊活性92-933.8rDsbC催化BmKIT氧化折疊初步研究93-943.9BmKIT與DsbC共表達94-95§4

12、討論95§5參考文獻95-98第五章rBmKIT電生理學活性檢測的準備工作棉鈴蟲神經(jīng)細胞的提取98-108§1引言98-1011.1膜片鉗技術98-991.2膜片鉗技術的應用99-1001.3膜片鉗技術應用于殺蟲劑作用機理的研究100-101§2材料與方法101-1022.1實驗材料1012.2實驗方法101-102§3實驗結(jié)果102-1053.1棉鈴蟲腹神經(jīng)索的提取102-1033.2棉鈴蟲神經(jīng)細胞的觀察103-1043.3棉鈴蟲神經(jīng)細胞的分離培養(yǎng)104-105§4討論105-106§5參考文獻106-108第六章東亞鉗蝎神經(jīng)毒素rBmKIT蛋白的晶體生長條件的初步探索108-120§1引言108-1111.1蛋白質(zhì)結(jié)晶的基本過程108-1091.2結(jié)晶方法1091.3蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響因素1