氫化酶結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展_杜明

1、第7卷第4期2009年1 2月生物信息學(xué)china journal of bioinformatics氫化酶結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展杜明l 2，任南琪-*，張璐1 ，許繼飛i，邱頡1(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院,哈爾濱150090 ； 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,哈爾濱150090)摘要:氫化酶是微生物代謝產(chǎn)氫過程中的關(guān)鍵酶，也是目前生物制氫領(lǐng)域的研究熱點。本文綜述了厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫微生物中氫化酶的 分類及特點，以及ni -fe、 fe -fe和fe -s cluster -free三種氫化酶晶體結(jié)構(gòu)和活性中心結(jié)構(gòu);闡述了多種微生物來源的氫 化酶結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展，對兒種典型氮化酶的結(jié)構(gòu)及活性中

2、心進(jìn)行了對比分析，并根據(jù)當(dāng)前研究熱點，對包化酶的研究方向進(jìn)行了展 望。本文闡述的內(nèi)容信息量豐富且具有一定的實用性，對于氫化酶相關(guān)領(lǐng)域研究具有重要的意義。關(guān)鍵詞:氫化酶;晶體結(jié)構(gòu);厭氧菌；進(jìn)展中圖分類號:q55文獻(xiàn)標(biāo)識碼:a文章編號:1672-5565(2009)-04 -323-05review on structure of hydrogenasedu mingh 2 , ren nan-qi1 1 * ,zhang lu1 ,xu ji-fei1 ,qiu jie1(1 school of municipal and environmental engineering , harbin i

3、nstitute of technology , harbin 150090 , china ；2 .college of food science and engineering , harbin institute of technology , harbin 15(x)90 , china)abstract :hydrogenase is lhe key enzyme and plays an important role in the process of biohydrogen production , which is an interesting topic in this re

4、search field .in the paper , the classification of hydrogenase was described.according to lots of research results , the recent reports of crystal structure and active site structure of the three kinds of hydrogenases , ni-fc , fc -fe and fc -s cluster -free , were quoted and contrasted.moreover , s

5、ome new approach and direction for hydrogenases were indicated.this review is informative and useful the over-all presentation is good for the relative studies on hydrogenases key words：hydrogenase ；crystal stmcturc ；anacrobc bactcria；advancc能源對于人類的牛存、繁榮與發(fā)展是至關(guān)重要 的。目前人類主要利用煤和石油等化石燃料作為初級 能源,而這些能源卻給人類帶

6、來全球氣候改變，環(huán)境 污染，生態(tài)變異和健康問題。解決這些問題并實現(xiàn)人 類的可持續(xù)發(fā)展目標(biāo)，必然離不開可替代的清潔能 源，以構(gòu)筑新的能源體系?？稍倥Ｇ鍧嵞茉粗?，氫能 源是極具潛力的未來替代能源z 【2。氫化酶(hydrogenase),也稱為氫酶，是一類存在 于微生物體內(nèi)的生物酶，它能可逆催化氫氣的氧化還 原反應(yīng)。1931年.stephenson等人將微生物體內(nèi)可 以分解甲酸產(chǎn)生氫氣的物質(zhì)稱為氫化酶。40多年以 后，人們才首次從巴氏梭菌中分離得到純化的氫化 酶。此后的很長一段時間內(nèi)，氫酶的研究并未引起人 們的重視，直到能源危機(jī)和環(huán)境污染等問題的出現(xiàn), 清潔型能源的研發(fā)迫在眉睫，氫化酶的潛在重要性

7、才逐漸被人們所認(rèn)識。目前，多種微生物來源的氫酶的分子結(jié)構(gòu)、催 化機(jī)理都在不同程度上得到了闡明。隨著人類對 能源需求急劇增加，利用微生物制取氫氣已成為研 究的熱點問題，而對氫酶結(jié)構(gòu)及活性中心的研究將 為生物制氫技術(shù)提供重要的理論基礎(chǔ)。1氫酶的分類根據(jù)氫酶的催化特性，可將氫酶分為吸氫酶、放 氮酶和雙向氮酶等類型。根據(jù)氮酶所含金屬原子的種 類可將氫酶分刈ni fe氫酶、fe fe氫酶和 fe -s cluster -free氫酶。具體的類型、分類依據(jù) 及各自的特點如表1所示。收稿日期：2()()9 -05 -09 ；修回日期：2009 -06 -09.基金項口:中國博士后科學(xué)基金(200704208

8、61)和黑龍江省博士后基金(lbh -z07115)。作者簡介:杜明,(1977)，副教授.壞境科學(xué)與丁程專業(yè)棘士后(在站)，主要從事于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。水通迅作者:任南琪，教授，主耍從事于環(huán)境科學(xué)與工程研究。71994-2015 china academic journal electronic publishing house all rights reserved. hllp/ki.ncl2氫化酶的分了結(jié)構(gòu)與活性中心自1931年氫酶被發(fā)現(xiàn)以來,科學(xué)家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許 多微生物含氫酶【51 o 1974年chen等【61首先從巴 氏梭菌中分離純化了可溶性氮酶，隨后有多種氮酶從 不同的微生物

9、中得到純化。日前己有數(shù)i種微生物氫 酶被分離純化，如 dseulfovibrio gigas .megaspha- era elsdenii , rhizobium japonicuin .chromatium vinosum , rhodospirillum rubrum , thiocapsa rosepersicina ,dseulfo vibrio vulgaris等。nife氮化酶是在細(xì)菌和弧菌 中發(fā)現(xiàn)的,由大小不同的兩個亞基組成°活性中心在大亞 基上，具有連接到鐵原子上的兩個cn分子和一個 co分子，小亞基上具有fcs簇【。7 fefc氫 化酶是在細(xì)菌和真核牛物中發(fā)現(xiàn)的，

10、它的活性中心是兩 個fe原子組成的雙金屬屮心，每個鐵原子上連有三個 co分子和兩個cn分子，活性中心是通過fe上的一個 硫代半胱氨酸與近端的4fe4s簇相連而連接在酶分 子上的【81 o 2006年pilak等【91人 報道了 fe -s cluster -free氫化酶的晶體結(jié)構(gòu)。 2.1 ni -fe氫酶的晶體結(jié)構(gòu)與活性中心近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，氫化酶結(jié)構(gòu) 和功能的研究也取得了巨大進(jìn)展。1995年,fontecil-la -camps在nalure上發(fā)表了 ni -fe氫化酶的晶體結(jié) 構(gòu)【7。迄今為止已有多種細(xì)菌的ni -fc氫 酚的品體結(jié)構(gòu)彼闡明，包括desulfovibrio

11、 gigas、desul- fovibrio fructosovorans、desulfovibriovulgaris、desulfovibrio dcsulfuricans 和 dcsulfomicrobium baculatum 等。通過對比分 析可知，已閘明的氫酶分子的折疊具有很高的相似性，不同的唯鐵氛化酶的品體結(jié)構(gòu)。研究表明在催化位點中包含五 個i囤協(xié)替善粧悠擔(dān)絕晶衞flcctronic publishing表1氫化酶的分類table 1 classification of hydrogenase分類依據(jù)類型特點備注根據(jù)氮酶的催(1)吸氫酶特定催化吸氮反應(yīng)在細(xì)胞外幾乎所冇的氮酶都具冇雙

12、化特性的不同(2)放氫酶特定催化放氮反應(yīng)向催化特性，在細(xì)胞內(nèi)氮酶主要具劃分(3)雙向氫酶根據(jù)細(xì)胞內(nèi)生理條件的不同而化不同的反應(yīng)有單向催化特性i 31 0分子中結(jié)介ni和fe兩種金屬原子(nife),右的還含(l) ni -fe氫酶根據(jù)氫酶活性冇 sc 原子(ni -fc-sc)o分子中結(jié)介fe種金屬原子(fe -fe), fe訊酶般具絕大多數(shù)氫胸含冇金屬原子;冃前中心所含金屬(2) fe-fe氫酶有較為的催化產(chǎn)氫活性。研尤的氮悔影數(shù)屬于fc氮悔和原子的種類不nife氫酶。同劃分(3) metal -free或fe這種氮悔分子中含冇菲催化活性的功能性鐵原子°-s cluster-fre

13、e氫.酶1998 年，peters 等引 人在 science .上發(fā)農(nóng)了巴 氏梭菌是這些氮酶活性中心ni、fe二原子上非蛋白配體的結(jié)構(gòu)上存在差異【,2.2唯鐵氫化酶的結(jié)構(gòu) 簇屮含有兩個明顯的有機(jī)金屬fe原子，通過兩個 配體co和cn實現(xiàn)金屬和碳的結(jié)合。1999 年,fonte-cilia -camps等【舊人得到了分辨率為1 .6a的脫硫弧菌唯鐵氫化酶的晶體結(jié)構(gòu)。cohen等【,3)人在研究唯鐵氫化酶中氫氣擴(kuò)散通 道時，于2005年在structure上報道的巴氏梭菌唯 鐵氫化酶的晶體結(jié)構(gòu)。巴氏梭菌唯鐵氫化酶空間結(jié) 構(gòu)中具有包裹在內(nèi)部的h簇和fe -s簇，而且 有一些連接到兩個主要氣體通道的

14、氨基酸殘基在外 部溶液(底物)和分子內(nèi)部包裹的h簇的聯(lián)系上起到 了重要作用。michael等【141人以巴氏梭菌為研究 對象，闡述了糖氧化產(chǎn)氫的電子傳遞過程。丙酮酸氧 化后電子通過鐵氧還蛋白(fd)傳遞給氫化酶，到達(dá) h簇至少要經(jīng)過七個fcs簇151 o2 .3 fe -s cluster free氫化酶的晶體結(jié)構(gòu)與活性中心fe -s cluster -free氫化酶(hmd)是一個同型 二聚體，分子尺寸約為90 x50 x40，分子結(jié)構(gòu)中 間具有一個球狀單元，兩邊線形地連接在兩個外 周單元上，每個外周單元由a或0結(jié)構(gòu)組成并 屬于rossmann折疊蛋白家族。2006年pilak等刃人報道的

15、fe -s cluster -free氫化酶(hmd , ec 1 .12 .98 .2)的晶體結(jié)構(gòu)。hmd由三個球狀的單元組成:兩個 同樣的由類似于亞基n 末端的rossmann折疊 組成的外周單元;一個由上述兩個亞基的c 末端 纏繞組成的中心單元。hmd氫化酶的活性位點裂隙位于hmd分子 中心球形單元和外周單元之間。有的hmd氫化 酶的活性位點裂隙是開放的如m .jannaschii hmd裂隙結(jié)構(gòu)，有的是閉合的如m .kandleri hmd裂隙結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)測定過程屮開放式結(jié)構(gòu) 可以檢測到一個 u 型電子密度，而在 m .jannaschii hmd的閉合結(jié)構(gòu)屮則是被完全包 埋的。hou

16、se. all rights reserved. httpi/avw 5 toshihiko akiba. kazuhiko higuchi, eiichi mizuki» et al .nontoxica1470and its selective cytotoxic activity against various mammalian celllines j j agric .food chem , 2005, 53 ：6313 -6318.71994-2015 china academic journal electronic publishing3研究展望氫氣是理想的清潔能源，

17、所以氫能的研究開 發(fā)已成為諸多科學(xué)家關(guān)注的焦點之一，而氫化酶又 是微生物代謝產(chǎn)氫過程中極為重要的一種酶。因 此，從那些方面開展對氫化酶的研究才能對生物 制氫產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生最有力的推動，這是科研工作者們需 要思考的問題°微生都具有不同程度的產(chǎn)氫能力，因此利用發(fā)酵 產(chǎn)氫微牛物，將葡萄糖等牛物質(zhì)轉(zhuǎn)化為氫氣在技術(shù)上 本身沒有問題。而一直困擾其應(yīng)用過程的是經(jīng)濟(jì)性的 問題，即如何降低發(fā)酵制氫的成本，使之可以和石化能 源催化制氫的經(jīng)濟(jì)性相比擬，或者可以打其他生物能 源過程相競爭。核心問題是如何提高糖 的轉(zhuǎn)化率，如何降低底物成本，如何在生物反應(yīng)器 水平上實現(xiàn)高效產(chǎn)氫i 161。目前報道的發(fā)酵產(chǎn)氫微生物主要

18、是梭菌屬細(xì)菌 和腸桿菌屬細(xì)菌，產(chǎn)氮能力通常叮以達(dá)到30 mmol h2g-drycell-h 171。據(jù)報導(dǎo)，從厭氧產(chǎn)甲烷污泥中 分離到口絮凝產(chǎn)氣腸桿菌(enierobacter aerogenes)hu -101和突變體ay -2，產(chǎn)氫速率為58 mmol h2 l - culture h 和 101 .5mmol h2 l -culture-h ,是目前報導(dǎo)的 最高產(chǎn)氫速率值。hu -101和ay -2是最先被發(fā)現(xiàn) 具有凝集現(xiàn)象的發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌，它們的分泌物能讓菌 體絮凝。本課題組分離得到了產(chǎn)乙醇桿菌 (ethanoligenens)yuan -3t ,其最大產(chǎn)氫能力達(dá)到 27 .6mmol

19、 h： g -drycell-h , yuan -3 具有十分良好 的菌體細(xì)胞自凝集特性181 ,這對于減少菌株的流 失和降低生物制氫成本等方面具有重要意義。有關(guān) 自凝集產(chǎn)氫細(xì)菌的報道目前世界上還很少見，具有 自凝集特性的產(chǎn)氫細(xì)菌將為生物制氫領(lǐng)域開辟出一 個重要的研究方向。因此深入開展yuan -3和 hu101等高效優(yōu)質(zhì)菌株中的氫化酶的結(jié)構(gòu)與功 能的研究具有重要意義。參考文獻(xiàn)(references):i zhu h , suzuki t ,tsygankov aa , et al hydrogen production from tofu wastewater by rhcxlobactcr

20、 sphacroidcs immobilized in agar gels j(上接第322頁)3 mizuki e , ohba m , akao t , et al unique activity associated with noninsecticidal bacillus thuringicnsis parasporal inclusions :in vitro cell killing action on human cancer cells jjournal of applied microbiology .1999 . 86 :477 -486.4 s .okumura, h

21、.saitoh , t.ishikawa, n .wasano , s .yamashita, k .ku-sumoto ,t .akao r e .mizuki , m .ohba , k .inouye , identiwcation of a novel cytotoxic protein , cry45aa , from bacillus thuringicnsisint j .hydrogen energy, 1999, 24 ：3o5 -31()2 lay j j modeling and optimization of anaerobic digested sludge conv

22、e rting starch to hydrogen j .biotechnol .bioeng 20(x), 68 (3):269 -278 3 vignais p m f billoud b meyer j .classification and phylogeny of hydrogenases j .fems microbiol .rev .2001 , 25 ：455 -501 .4 lyon ej , shiina s , buurman g et al uv a blue light inactivation of the metal free hydrogenase (hmd)

23、from methanogenic archaea j eurj biochem , 2004,271 ： 195-204 5 stephenson m , stickland l h hydrogenase :a bacterial enzyme acti vating molecular hydrogen 1 .the properties of hydrogenase j jbio- chem, 1931,25 ：205 2146 chen j s , mortenson l e purification and properties of hydrogenase from clostr

24、idium pasteurianum w5 jbiochim biophys acta , 1974, 371 :283 29x7 volbeda a , charon m h f piras c , et al .crystal structure of the nickel -iron hydrogenase from desulfbvibrio gigas jnature 1995,373 : 580 -587 8 peters j w , lanailotta w n , lemon b j t et al .x -ray crystal structure of the fe -on

25、ly hydrogenase (cpl)from clostridium pas- teurianum to 1 .sangstrom resolution j .science , 1998,282 ：i853 1858 9 pilak o , mamat b , vogt s , et al .the crystal structure of the apoenzyme of the iron -sulphur cluster -free hydrogenase jj.mol biol .,2(x)6,358 ：798 -809 10 marr a c f spencer d j e ,

26、schuroder m .structural mimics for the active site of nife hydrogenase j .coord.chem.rev.,2001,219 -221 ： 1055-1074 11 volbeda a , montet y , vernede xet al .high -resolution crystallographic analysis of desulfovibrio fructosovorans nife hydrogenase j .int j hydrogen energy , 2002,27:1449 -1461 .12

27、volbeda a , fontecilla camps jc .structure -function relationships of nickel -iron sites in hydrogenase and a comparison with the active sites of other nickel -iron enzymes jcoordination chemistry reviews ,2005.249(15):1609-1619 .13 cohen j , kim k , king p, et al .finding gas diffusion pathways in

28、proteins :application to o 2 and h? transport in cpi fefe hydo genase and the role of packing defects j .structure, 2005 ,13(9)： 1321-132914 邢徳峰.產(chǎn)氫一產(chǎn)乙醇細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能研究d 哈爾 濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué).2006:8-13 15 michael aww , stiefel el.biological hydrogen production :not so elementary! j .science, 1998 t 282 :1842-1843 .16 adams mww , mortenson le, chen js .hydrogenase j .biochim biophys acta , 1981,594:105-176 17 xing d , ren n , li q , ct al .ethanoligencns harbincnsc gen .nov., sp .nov .isolated from molasse