不同劑量甜菜堿對小鼠腹腔酸性磷酸酶活性的影響

1、不同劑量甜菜堿對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的影響摘要 甜菜堿不僅可以同時降低血清乳酸脫氫酶、醛縮酶活力，抑制荷瘤小鼠的糖代謝過程來達到抗腫瘤的目的，也可以通過劑量性地降低血清總膽固醇、三酰甘油來降低血脂。通過查閱大量文獻資料，現(xiàn)已判定甜菜堿對于提高機體免疫力有提升的作用。為此，本次實驗通過每天對昆明小鼠喂以不同劑量的甜菜堿來探究其對昆明小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞中酸性磷酸酶活性的影響來間接揭示其在免疫作用方面的影響。1 材料和方法1.1動物 昆明小鼠，體重（20±2g）全部雄性，出生4周齡。1.2主要器材和試劑 1.2.1器材：眼科剪、眼科鑷、10ml一次性注射器、10-1000ml移液槍、

2、報紙、玻片架。1.2.2試劑：不同梯度濃度甜菜堿、6%淀粉肉湯、生理鹽水、75%酒精溶液、3%甘油磷酸鈉、10%中性福爾馬林、酸性磷酸酶作用液、1%硫化銨溶液。1.2.3試劑配方：醋酸緩沖液：貯備液A：0.2mol/L醋酸（冰醋酸11.55ml稀釋至1000ml）。 貯備液B：0.2mol/L醋酸鈉（無水醋酸鈉16.4g配成1000ml）。PH4.6：25.5mlA+24.5mlB稀釋成100ml。10%中性福爾馬林（PH6.8-7.1）：甲醛10ml+蒸餾水90ml+醋酸鈉2g酸性磷酸酶作用液:蒸餾水90ml+0.2mol/L醋酸鈉緩沖液（PH：4.6）12ml+5%硝酸鉛（捕獲劑）2ml+

3、3.2%甘油磷酸鈉（底物）4ml。先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合，隨后分成大致相等的兩份，一份中加硝酸鉛溶液，另一份加甘油磷酸鈉溶液，然后再將兩者緩慢混合，變混邊攪勻后若PH不夠5.0，可加入少量醋酸調(diào)整。此作用液最好在臨用前配制，不能貯存。配好后的作用液應(yīng)透明無絮狀懸浮物和沉淀，否則將嚴(yán)重影響實驗結(jié)果。1%硫化銨溶液：硫化銨1ml+99ml蒸餾水6%淀粉肉湯（滅菌）：肉湯3g+6g淀粉+100蒸餾水1.3小鼠的飼養(yǎng) 實驗前二周將40只小鼠隨機等分為5組，每組8只，其中陰性對照1組，每天用注射器灌胃0.2ml蒸餾水;實驗組3組，每天分別用注射器灌胃100mg/ml、150mg/ml、200mg/m

4、l的甜菜堿0.2ml;陽性對照1組，每天用注射器灌胃0.2ml葉酸。所有小鼠均在同一時間進行灌胃。1.4腹腔灌洗液的提取 參考文獻并加以改進。實驗前3天每天向消毒的小鼠腹中線左右0.5cm內(nèi)的腹腔中注射已滅菌的6%淀粉肉湯1ml。實驗當(dāng)天將小鼠在報紙上脫頸處死，用75%酒精溶液浸泡3min，后用注射針頭將小鼠的四肢固定在無菌板上。用眼科剪先將腹中線左側(cè)或者右側(cè)鼠毛的剪掉，裸露出皮后剪一小開口，后用酒精擦拭的移液槍緩慢地注入（30s）1ml生理鹽水，小心地輕柔小鼠腹部30s后再緩慢地回抽。2 實驗步驟2.1 酸性磷酸酶活力的測定2.1.1取細(xì)胞懸液在預(yù)冷的載波片上1-2滴，將玻片迅速放到冰箱內(nèi)（

5、4°C），讓細(xì)胞自行鋪展30min。后將玻片轉(zhuǎn)入10%中性福爾馬林，冰箱內(nèi)4°C固定30min。自來水漂洗5min，把水甩干。滴加酸性磷酸酶作用液中，37°C處理30min。自來水漂洗片刻后，1%硫化銨處理5min。自來水沖洗，甩干。用磷酸鹽緩沖液臨時封片，鏡檢。2.1.2鏡檢時取多處不同的視野拍出照片，后做灰度對比。3 實驗結(jié)果3.1 灰度測量結(jié)果 表格1 Image測量小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的灰度 組觀測數(shù)劑量單位像素下的灰度值水6.000 0.000g/ml213.055±0.448 甜菜堿6.000 0.100g/ml223.610

6、7;4.4336.000 0.150g/ml235.504±2.4736.000 0.200g/ml210.998±5.828 與陰性對照組相比*P0.01表1所示用劑量為0.100g/ml以及0.150g/ml濃度的甜菜堿處理過的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的灰度值較陰性對照組呈極顯著性差異。3.2 灰度趨勢圖 圖1不同劑量甜菜堿下小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的灰度趨勢圖圖1所示所測小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶灰度值先隨甜菜堿的劑量增加而增加，后隨其劑量的增加而降低。3.3 含陽性對照組的柱形圖結(jié)果 圖2不同劑量甜菜堿及一定劑量葉酸下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶灰度柱形圖 圖

7、2所示一定劑量下的甜菜堿的確與陽性對照組一樣起到了相同的作用。4 討論本次實驗通過表1可初步確定甜菜堿對小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞的酸性磷酸酶活性產(chǎn)生了極顯著的影響，但是0.100g/ml、0.150g/ml和0.200g/ml劑量的甜菜堿其標(biāo)準(zhǔn)差較陰性對照組波動較大，相對不穩(wěn)定。圖1所示隨著甜菜堿劑量從0增至其最適濃度，灰度的值也隨之增加；超過最適濃度后灰度值開始隨甜菜堿劑量的增加而降低。即小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞的酸性磷酸酶活性先隨甜菜堿的劑量增加而升高，到達最適濃度后（0.150g/ml左右）又隨著甜菜堿的劑量增加而降低。當(dāng)所用劑量達到0.200g/ml時其灰度值比陰性對照組還要低，說明此時的甜菜堿可

8、能抑制了酸性磷酸酶的活性。但僅從趨勢圖我們還無法給出甜菜堿與酸性磷酸酶的活性之間是否線性，以及過多劑量的甜菜堿是否對酸性磷酸酶的活性起到了抑制作用等結(jié)論，為此，有待做進一步研究。圖2結(jié)果表示在一定劑量下的甜菜堿確和陽性對照組一樣對酸性磷酸酶的活性起到了促進的作用。但僅憑本次實驗結(jié)果尚不能給出甜菜堿與葉酸相比哪一個對小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞的酸性磷酸酶活性影響更大。綜上所述當(dāng)甜菜堿的劑量在0.200g/ml之前均可以增加小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的活性，雖然其作用的機制還不太清楚，但其確實在免疫學(xué)方面起到了增強的作用。1張宇金,季宇彬,何立巍.甜菜堿的抗腫瘤作用及對S180荷瘤小鼠機體糖代謝過程的影響.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心, 2006年9月,第 37卷,第9