內(nèi)標法與外標法

1、內(nèi)標法與外標法、內(nèi)標法什么叫內(nèi)標法？怎樣選擇內(nèi)標物？內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加 入一種內(nèi)標物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高 分析結(jié)果的準確度。內(nèi)標法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標法時，在樣品中 加入一定量的標準物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾， 只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應(yīng)值，即可求出待測組分在樣品中的百 分含量。采用內(nèi)標法定量時，內(nèi)標物的選擇是一項十分重要的工作。理想地說，內(nèi) 標物應(yīng)當是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準確、已知的量加到樣品中 去，它應(yīng)當和被分析的

2、樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理 化學(xué)性質(zhì)（如化學(xué) 結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等）、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分 析物質(zhì)的一個同系物。當然，在色譜分析條什下，內(nèi)標物必須能與樣品中各組分充分 分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較安心化臺物在一個復(fù)雜過 程中所得到的回收率，此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺 物作內(nèi)標，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。在使用內(nèi)標法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標和被測組分的峰高或峰面積的 比值？影響內(nèi)標和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面 的和儀器方面的三類。由化學(xué)方面

3、的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時出現(xiàn)?；瘜W(xué)方 面的因素包括：1 、內(nèi)標物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標物純度可變等。對于一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色 譜上常見的一些問題（如滲漏）對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小 一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有 某個重要的色譜問題存在，比如進樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標濃度之間有 很大的差別，檢測器非線性等。進樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢 測器和積分裝置飽和。如果認為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著 重

4、檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是： 面積比可變，而峰高比保持相對恒定，在制作內(nèi)標標準曲線時應(yīng)注意什么？在用內(nèi)標法做色話定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標 準曲線。在實際樣品分析時所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標準曲線時所用的條件 一致，因此，在制作標準曲線時，不僅要注明色譜條件（如固定相、柱溫、載氣流速 等），還應(yīng)注明進樣體積和內(nèi)標物濃度。在制作內(nèi)標標準曲線時，各點并不完全落 在直線上，此時應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏差，在使用過程中 應(yīng)定期進行單點校正，

5、若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在較短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜 使用內(nèi)標法定量。用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比 較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。工作曲線法 是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜 率、截距。在完全 相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從 標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。 通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標 一點法（直接比較法）定

6、量。外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對 照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣 品中i組分的量：WA （W） / （A）式中W與A分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。 （W）及（A）分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標法 方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。 但此法的準確性受進樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標一點法 的實驗誤差，應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。外標法external standa

7、rd method色譜分析中的一種定量方法，它不是把標準物質(zhì)加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的 色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。外標物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度， 分析時外標物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準確性。三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標法或外標法（來源:藥物分析網(wǎng)）選 一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標物（當然是樣品中沒有的組分），然 后配制欲測組分和內(nèi)標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內(nèi)標物加入 欲測組分的樣品中，進樣后測得欲測組分和內(nèi)標物的定量參數(shù)。用內(nèi)標法公式計算 即可。內(nèi)標法

8、是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物，加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被測試樣和 內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。選擇內(nèi)標物有 4個要求：1.內(nèi)標物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與 試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標物的量應(yīng)接近于被測組分；4.色譜峰 的位置應(yīng)與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分 色譜峰中間。內(nèi)標法 的優(yōu)點是測定的結(jié)果較為準確，由于通過測量內(nèi)標物及被測組分的峰面積的相對值來 進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標法的 缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內(nèi)標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合

9、適的 內(nèi)標物也有困難。外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同 的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結(jié)果。內(nèi)標與外標都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不 同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡單而有 效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。1、以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進 樣器，用外標法定量，確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì) 疑。其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析，首先我們的實驗 室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，

10、比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的 位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否 對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用 什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些 因素都考慮了，按照GM方法驗證對于精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和 配制6個樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個方法用外標法就 是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個方法是否 適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥公 司提供的比較完善而驗證過的方法，內(nèi)標

11、與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密 度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內(nèi)標外標，都是可行的，當然有一個分 析成本和分析時間的問題，內(nèi)標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當然要比外標 要高和麻煩一些了。而有些時候，可能受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達 不到一定的要求，而還必須進行定量分析，有時外標的結(jié)果可能就要差一些，這時， 你可能就要考慮用內(nèi)標法了，可以排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些 未知因素平行誤差的影響，這時內(nèi)標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。2、上面已經(jīng)提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候

12、，RSD都滿足1.5%的要求時，也分為兩種情況，小于1%和 大于1%、于1.5%。如果RSD勺結(jié)果小于1 %那這個方法就沒有什么可以懷疑的了 ； 如果RSD的結(jié)果大于1%M在1.5%略低一些的范圍活動時，這個方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗證，你就要考慮上面1所提到的影響因素 的 影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSC還是在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標了，如果 內(nèi)標結(jié)果的RSD很好，就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大，只能用內(nèi)標了，或者干脆將原方法做大的變動，再嘗試用外標法測試。3、而對于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限 量標準要求對于精密度的要求也比常

13、量分析的要求要寬松的多，RSD有時可以允 許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應(yīng)用空間。4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個人認為還是內(nèi)標優(yōu)于外 標。曾經(jīng)做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標， RTX-5 amine （堿改性）15m0.32mm*1 .0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內(nèi)標物）自動進樣器進6針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標物（二乙醇胺） 峰面積比率的RSD為0.18%，而只對這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積 求 RSD結(jié)果為0.71 %,通過這一實例的結(jié)果大家就會發(fā)現(xiàn)到底哪個方法精密度更好了，當 然是內(nèi)標更好了。當然這個化合