分子生物學實驗手冊-

1、分子生物學實驗手冊劉惠榮、李國婧編內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院二一年五月30前 言二十一世紀的今天，分子生物學技術(shù)已不再神秘，它的理論和技術(shù)已經(jīng)滲入生物學的各個分支學科及醫(yī)藥農(nóng)林的各個分支領(lǐng)域，并衍生出了許多新興的交叉學科，如分子免疫學、分子微生物學、分子遺傳學、分子藥理學等，對分子生物學實驗技術(shù)的掌握已經(jīng)成為這些學科在新的高度和深度揭示生命奧秘的共同需求。實驗教學是高校教學工作中一個重要的組成部分，是培養(yǎng)學生實踐能力和創(chuàng)新能力的重要環(huán)節(jié)，也是提高學生專業(yè)素養(yǎng)和就業(yè)競爭力的重要途徑。本書是在我們多年用作內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生物工程學院生物科學專業(yè)本科生實驗指導講義的基礎(chǔ)上，經(jīng)修訂和改編而成的，可以作為

2、我校生物和農(nóng)林等專業(yè)的分子生物學實驗指導用書。 本書以基本的分子生物學實驗為主，內(nèi)容包括植物基因組DNA提取及其定性定量分析、PCR擴增目的片段和膠回收、目的片段和載體的連接、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA的提取及酶切鑒定等六個大實驗，每個實驗都介紹了實驗的基本原理、實驗所需儀器試劑、實驗操作步驟、注意事項等，為了大家能更好地掌握和理解實驗原理及關(guān)鍵操作，在每個實驗后面羅列了與本實驗相關(guān)的復(fù)習題。本書的編寫宗旨是簡明、實用，是一本適合任何具有分子生物學基本知識的學校本科生、研究生或單位工作人員使用的教材。本書是我們內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生物工程學院幾位老師從教學和科研中不斷總結(jié)經(jīng)

3、驗而完成的，幾位老師為本書的編寫投入了大量精力，在此表示感謝。由于編寫本教材的時間倉促，編者水平有限，書中難免出現(xiàn)疏漏之處，希望讀者在使用的過程中，對書中的不當之處提出批評指正，不勝感激。編者2007年1月目 錄實驗一 植物基因組DNA的提取及其定性定量分析2實驗二 PCR擴增目的片段和膠回收8實驗三 目的片段和載體的連接14實驗四 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化效率檢測17實驗五 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化19實驗六 菌落的PCR鑒定21實驗七 重組質(zhì)粒DNA的提取及酶切鑒定24實驗一 植物基因組DNA的提取及其定性定量分析【實驗?zāi)康摹?通過本實驗學習利用CTAB法從植物組織中提取DNA 并通過瓊脂糖凝

4、膠電泳及紫外分光光度法對DNA進行定性定量分析。【實驗原理】 通過CTAB法提取植物基因組DNA是由Murray和Thompson (1980) 修改而成的簡便方法。CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)是一種陽離子型去污劑，可溶解細胞膜，在高離子強度下(大于0.7M NaCl)，與蛋白和中性多糖形成復(fù)合物沉淀出來。利用液氮對植物組織進行研磨，從而破碎細胞。然后加入CTAB緩沖液將DNA溶解出來，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后經(jīng)乙醇沉淀得到DNA。瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)(瓊脂糖凝膠)的樣品孔中，并置于靜電場上。DNA分子在

5、高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此，在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子遷移速率快，遷移距離遠，由此得到分離。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價

6、閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA)，開環(huán)質(zhì)粒DNA，即環(huán)狀質(zhì)粒DNA的1條鏈斷裂，(open circular DNA，簡稱ocDNA)，線狀質(zhì)粒DNA，即環(huán)狀質(zhì)粒DNA的2條鏈在同一處發(fā)生斷裂(linear DNA，簡稱L DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260nm波長處有特異的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度

7、提供了基礎(chǔ)。1 OD260相當于dsDNA 50g/mL，ssDNA 33g/mL和ssRNA 40g/mL?？梢源藖碛嬎愫怂針悠返臐舛?。紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值(A260/A280)估計核酸的純度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材離心機、恒溫水浴器、臺式離心機、電子天平、水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、高壓滅菌鍋、紫外線透射儀、微波爐、紫外分光光度儀、微量移液器(10、100、1000L量程各一支)、膠帶、100 mL或250

8、mL錐形瓶、量筒、陶瓷研缽、液氮、研磨棒、點樣板或parafilm、吸頭、1.5 ml EP管、PE手套和乳膠手套。二、藥品三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA )、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、-巰基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化鈉(NaCl)、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA ) 、溴酚藍、蔗糖、瓊脂糖、溴化乙錠、鹽酸。三、試劑1. 2×CTAB buffer 配50mL100mM Tris-Cl pH8.0 5 mL 1M 貯存液 1.4M NaCl 17.5 mL 4M貯存液20 mM EDTA pH8.0 2 mL 0.5M貯存液2% CTAB 需CTA

9、B固體粉末1g0.2%巰基乙醇 需巰基乙醇100 L2. 70%乙醇3. RNaseA (10mg/mL)4. 0.5×TBE緩沖液(工作濃度)45mM Tris-硼酸鹽1mM EDTA配5×TBE (貯存液) 1000 mL Tris 54g 硼酸 27.5g0.5 mol/L EDTA 20 mL (pH 8.0)5. 凝膠加樣緩沖液(6×) 溴酚藍 0.25 % 蔗糖 40 % 6. 溴化乙錠 (EB ) 貯存液 10mg/mL7. DNA marker8. 0.1×TE9. 酚/氯仿 (1:1，V/V)?！緦嶒灢襟E】 1. 取約100mg新鮮的擬

10、南芥嫩葉放入1.5mL EP管，在液氮冷凍條件下研磨成粉末狀。2. 加入0.6 mL 2×CTAB提取液(用前加入0.2的巰基乙醇)，混勻，65 水浴30 min，每10 min顛倒混勻一次。3. 取出離心管，冷卻后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混勻。4. 11,500 rpm室溫離心4 min(若沒離好可重復(fù)一次)。5. 將上清液轉(zhuǎn)移到另一1.5mL離心管中。6. 加等體積氯仿混勻，11,500rpm 離心4 min，取上清。7. 加入2倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，-20放置60 min。8. 4，15,800rpm離心20 min。9. 棄上清，1ml 70乙醇洗滌沉淀2次，

11、風干。10. 加入30L無菌水(含25g/mL RNase A)，37溶解DNA 30min。11. 取5L DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測：(1) 制備瓊脂糖凝膠按照被分離DNA 的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚海?%）瓊脂糖凝膠濃度/ 線性DNA 的有效分離范圍kb 0.3 5 - 600.6 1 - 200.7 0.8 - 100.9 0.5 - 71.2 0.4 - 61.5 0.2 - 42.0 0.1 - 3稱取0.3g 瓊脂糖，放入三角瓶中，加入30mL0.5×TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1瓊脂糖凝膠液。瓊脂糖由D-半乳糖

12、和L-半乳糖通過糖苷鍵交替形成線狀聚合物。瓊脂糖溶解后鏈間糖分子上的羥基由于氫鍵的作用相互連接，形成三維空間結(jié)構(gòu)，瓊脂糖濃度越高，形成的孔隙越小，分辨能力也越強。瓊脂糖凝膠的分辨范圍一般在0.2-50kb之間。(2) 膠板的制備 取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏或膠帶將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴，不能留縫隙），形成一個模具。 將有機玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并在固定位置放好樣品梳子。 將冷卻到60 左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內(nèi)槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。 室溫下靜置直至凝膠完全凝固（室溫下30-45 min），垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝

13、膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。 加電泳緩沖液至電泳槽中，使緩沖液沒過膠面約1mm。(3) 加樣在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1×。用10L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，將DNA marker分別加至樣品孔的左側(cè)和右側(cè)孔內(nèi)。每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。上樣緩沖液有三個作用：增加樣品的密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。溴酚藍是帶電荷的小分子化合物，呈藍紫色，是一種凝膠的

14、示蹤染料，遷移速率相當于300bp的線性雙鏈DNA分子，通過觀察溴酚藍的遷移位置，可估計樣品中DNA分子的遷移位置。(4) 電泳 接通電泳槽與電泳儀的電源，DNA片段從負極（黑色插頭）向正極（紅色插頭）移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，但電壓升高使瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低，因此，最高電壓不超過5V/cm。 當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。(5) 染色將電泳后的凝膠浸入含有0.5 g/mL溴化乙錠的電泳緩沖液中，染色（室溫30-45min），清水脫色10min，紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作），采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。溴化乙錠（Ethidium bromi

15、de, EB），是一種扁平的分子，能嵌入核酸分子相鄰的堿基之間，可以和DNA形成絡(luò)合物，并在約300nm波長的紫外光下發(fā)射出桔紅色熒光，使DNA分子在凝膠中便于鑒定。12.紫外分光光度法測定DNA濃度及純度：(1) 用0.1×TE對待測DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。(2) 開機，儀器會自動對光路及分析軟件進行檢測，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時，進入核酸測定窗口。(3) 調(diào)零。先用0.1×TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點擊“set ref”鍵，儀器自動校正零點。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測樣品。(4) 吸70L已稀釋的DNA樣

16、品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用57L的石英樣品杯。點擊“enter” 鍵，儀器即進入分析狀態(tài)。窗口同時顯示260和280nm處的光密度（OD值）及A260/A280nm和A280/A260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。(5) 打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用超純水清潔石英樣品杯，風干后，再加入下一個待測樣品。(6) DNA純度：以A260/ A280比值來反映。當A260 /A280比值<1.8時，說明樣品存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)，可采用平衡酚/氯仿/異戊醇再抽提除去蛋白質(zhì)或用氯仿或乙醚抽提去除殘留酚，再用無水乙醇沉淀，TE溶解后再測定。當A260/A

17、280比值>2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去除RNA?！緦嶒灲Y(jié)果】在紫外燈（360 nm, 312 nm 或254 nm ）下觀察染色后的電泳凝膠（圖1-1）。DNA 存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶（在紫外燈下觀察時應(yīng)戴上防護眼鏡，紫外線對眼睛有傷害作用）。圖1-1 擬南芥基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果【實驗安排】本實驗一天內(nèi)可完成：上午提DNA，下午電泳及紫外分光光度法檢測DNA?！咀⒁馐马棥?盡量選幼嫩葉片，如太老，DNA可能已經(jīng)開始降解，有些物種老葉子酚類物質(zhì)較多。2研磨過程中確保樣品不要融化，直至加CTAB3酚-氯仿抽提時動作應(yīng)輕柔，轉(zhuǎn)移用的槍頭最好是剪口的，

18、帶手套操作。4所用試劑需滅菌。5配瓊脂糖時應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。6瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時要輕緩。7電泳時應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。8溴化乙錠具有致癌作用，配制及使用時應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實驗室內(nèi)使用。9紫外線對人體有損傷作用，開燈時間不宜太長，注意防護。10DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。11紫外分光光度法不能區(qū)分DNA分子的構(gòu)型，如質(zhì)粒DNA分子的超螺旋、開環(huán)、線狀三種構(gòu)型，也不能區(qū)分染色體DNA和RNA等。由于測定吸收光度A260時，難以排除苯酚、RNA、染色體DNA、以及DNA解鏈的增色效應(yīng)等因素的影響，因此測得的數(shù)據(jù)往往比實際濃度偏高。

19、12測樣品時使用的石英樣品杯比較貴，操作時要小心，不要摔破；持杯時不要接觸透明的光面以避免干擾測定?！緩?fù)習思考題】1. 提取DNA之前一些耗材和試劑為什么要先進行高壓滅菌？2. 提取DNA的主要步驟有哪些？需要注意哪些問題？3. 如何檢測、評價提取的DNA的質(zhì)量？4. 如何確定提取的DNA的濃度？5. 分離基因組DNA和質(zhì)粒DNA有哪些不同之處？6. CTAB、苯酚、氯仿、乙醇等的作用？7. 電泳時如何確定瓊脂糖濃度？ 8. 如何配制電泳緩沖液TBE？9. 試分析自己實驗得到的電泳結(jié)果？10. EB染色的特點和注意事項是什么？11. 上樣緩沖液在電泳中起什么作用？12. DNA定量時，什么方法

20、比較精確？ 13. 紫外分光光度法測定DNA濃度的原理？14. DNA樣品的A260/A280比值如何反應(yīng)DNA的純度？15. DNA樣品的A260/A280比值大于2.0或小于1.8時應(yīng)該如何處理才能提高DNA純度？實驗二 PCR擴增目的片段和膠回收【實驗?zāi)康摹客ㄟ^本實驗學習PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)及DNA片段的膠回收方法?！緦嶒炘怼烤酆厦告準椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將待擴增的DNA片段與其兩側(cè)互補的兩個寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。該技術(shù)已成為

21、分子生物學中用于DNA克隆及基因分析的必需工具。典型的PCR 反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA 模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、兩個合成的DNA引物、耐熱DNA聚合酶。PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個在模板DNA、一對已知序列的寡核苷酸引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。整個擴增過程分三步： 變性，加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段； 退火，快速降低溫度至50-60后，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，即退火階段； 延伸，溶液反應(yīng)溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應(yīng)混合物中的4 種脫氧核苷三磷酸（dNTP

22、)，按53 方向復(fù)制出互補DNA，即引物的延伸階段。完成以上三步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)過25-30個循環(huán)后，DNA可擴增106-109倍。PCR擴增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。現(xiàn)用圖示說明PCR原理：圖2-1 PCR基本原理示意圖Taq DNA聚合酶就是在PCR中常用的一種耐熱DNA聚合酶，該酶分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75，對95高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在35 外切酶活性，合成的DNA雙鏈3 端常有一個突出的堿基A，便于與3 端有突出T的線性載體（如T-載體）直接進行重組連接，該

23、特點在DNA重組中使用非常方便。分離和純化PCR產(chǎn)物及DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在電泳過程中不同大小的片段分離后位于凝膠的不同位置，切下目的片段并采用低熔點瓊脂糖回收法即可獲得目的片段。有許多型號的低熔點瓊脂糖可在65時熔化成液體，在30時凝固成凝膠。由于雙鏈DNA的解鏈溫度高于65，所以可以熔化凝膠而DNA并不變性，在凝膠成液態(tài)時回收DNA片段。該法的優(yōu)點是可直接在熔化的凝膠中進行各種酶反應(yīng)，如合成同位素探針、進行限制酶切割和連接反應(yīng)等。【儀器、材料與試劑】 一、儀器及耗材PCR熱循環(huán)儀、臺式離心機、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器（0.1-2.5L）、200L PCR管、吸頭、離心

24、管、手套、制冰機、微量移液器（10、100、1000L量程各一支）、膠帶、100 mL或250 mL錐形瓶、量筒、點樣板或parafilm、吸頭、PE手套和乳膠手套。二、試劑1. 10 × 緩沖液500 mmol/L KCl 100 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3，室溫）15 mmol/L MgCl2 2. DNA 模板 1 ng/L (以實驗一提取的擬南芥基因組DNA為模板)3. dNTP Mix2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L dCTP 2.5mmol/L dGTP 2.5 mmol/L dTTP 4引物 引物1 5-ACT CTA GAC G

25、TT CGT CGT GAG GTA GC-3引物2 5-ATG GAT CCC GCT CCG TGT AAT GTC CT-3引物溶液濃度：20M 5. Taq 酶 5 U/L6. 低熔點瓊脂糖7. 凝膠回收試劑盒8. 去離子水或TE（pH7.6）【實驗步驟】 1在200L PCR 管內(nèi)配制20L 反應(yīng)體系：反應(yīng)物 體積 /LddH2O 14.9 10×PCR 緩沖液 2.0dNTP 1.6（終濃度20200M） 引物 0.2 （引物終濃度0.2M）引物2 0.2 （引物終濃度0.2M）模板DNA 1.0Tag 酶 0.1 Total 20 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

26、2. 將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，6000 rpm離心15 sec使反應(yīng)成分集于管底。3. PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置： 94 預(yù)變性 3 min; 94 變性 30s; 62 退火 30s; 30 cycles 72 延伸 45s; 72 延伸 10 min; 4 pause反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，置4保存?zhèn)溆谩?. 配制1的瓊脂糖凝膠。5. 取5L PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。6. 如果PCR產(chǎn)物非常特異，可以直接用于與載體的重組連接。7. 或?qū)⑹Ｓ鄻悠冯娪竞笤谧贤鉄粝虑泻蠨NA的低熔點膠，置1.5 mL離心管中，于50-55熱水中熔化。按凝膠回收試劑盒說明書操作。8. 取

27、適量純化好的目的DNA于分光光度計中檢測純度和濃度，其余樣品于-20保存。【實驗結(jié)果】 本實驗擴增片段長165 bp?！緦嶒灠才拧勘緦嶒瀕天內(nèi)可完成，上午做PCR反應(yīng)，下午做電泳檢測及膠回收?！咀⒁馐马棥?. PCR體系所加成分的實際用量應(yīng)根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進行核算。2. 加樣時要認真，吸頭垂直進入試劑管，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。3. Taq聚合酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深，酶量不能過多。4. 膠回收時，配凝膠的三角瓶、電泳槽和配膠板要先沖洗干凈，電泳時用新配制的電

28、泳緩沖液。【影響PCR的主要因素】1. 模板DNA單鏈、雙鏈DNA均可作為PCR的模板，DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。模板用量依具體實驗而定，一般為100L反應(yīng)液有105-106個目標分子。PCR反應(yīng)時模板變性要充分。2. PCR引物PCR引物設(shè)計是否成功是能否獲得高質(zhì)量PCR產(chǎn)物最關(guān)鍵的因素之一。在設(shè)計和應(yīng)用時，需注意以下重要環(huán)節(jié)：(1) PCR引物的長度約為1830個核苷酸，并且成對引物間的GC含量應(yīng)相似。以使它們在相近的溫度下與其互補序列結(jié)合。G+C含量應(yīng)為45%55%之間。堿基分布是隨機的，應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基，尤其是不應(yīng)在其3端出現(xiàn)3個連續(xù)G或C，

29、否則會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。引物3端堿基最好選用A、G、C，盡可能地避免選用T，尤其應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)2個以上T。(2) 一般來說，PCR產(chǎn)物500bp時，引物長度選擇16-18bp；PCR產(chǎn)物5kb時，引物長度選擇24bp左右為宜。(3) 要避免引物分子自身序列互補，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。兩個PCR引物相互之間的3末端序列不能有明顯的互補性，以免形成引物二聚體。(4) 引物的熔解溫度（Tm值）要適當。Tm值與引物的堿基組成和長度有關(guān)；PCR引物的GC/AT應(yīng)與要擴增的模板DNA相當或略高些。一般熔解溫度以大于55為宜。(5) 引物的3 末端必須與模板嚴格互補，而5 末端的要求可靈

30、活些。(6) 目前在引物選擇中已廣泛應(yīng)用計算機軟件，從EMBL或Genebank中查找有關(guān)基因序列，并對設(shè)計的引物在引物二聚體形成、自身互補性及特異性等方面進行分析評價。(7) 用于亞克隆的引物，常在引物的5 端加上限制性內(nèi)切酶位點。為了保證內(nèi)切酶有效酶切擴增產(chǎn)物，一般在酶切位點的5端再加上幾個額外的保護堿基。(8) 引物的濃度，在終濃度為0.21.0mol/L的范圍內(nèi)產(chǎn)量基本相同，低于0.2 mol/L時會影響產(chǎn)量。但過高時一則不經(jīng)濟，二則會出現(xiàn)非特異擴增及增加引物二聚體的產(chǎn)生。3. 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）一般用量為2.5 U/100L反應(yīng)體積。酶量過多易導致非特異性產(chǎn)

31、物的產(chǎn)生。該類酶的最適溫度為75，在低溫下仍保留相當高的活性，易引起不完全配對的引物-模板的非特異延伸及引物二聚體的擴增延伸，所以應(yīng)注意防止非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。4. dNTPsPCR常用的dNTP濃度在50-200mol/L。四種dNTPs應(yīng)等濃度。濃度低則反應(yīng)速度下降，過高則特異性下降，可根據(jù)具體實驗來確定最適的dNTP濃度。5. PCR緩沖液因PCR反應(yīng)中的dNTP能與Mg2+結(jié)合，影響反應(yīng)液中游離Mg2+的濃度，所以應(yīng)按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標準的PCR反應(yīng)中（dNTP濃度200mol/L），Mg2+濃度約為1.5mmol/L。Mg2+離子濃度可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)

32、物特異性。濃度高則出現(xiàn)非特異擴增，過低則酶活性顯著下降。應(yīng)用無核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%0.1%)及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對酶有一定的保護作用。6. PCR循環(huán)的溫度預(yù)變性：起始變性的時間應(yīng)該長些，以使變性充分。一般為94 3-5min。變性不完全時，DNA雙鏈會很快復(fù)性，影響PCR反應(yīng)，但若變性溫度太高（不宜超過95），會影響Taq酶的活性。變性：一般為94 30s或95 20s。引物退火：應(yīng)根據(jù)具體反應(yīng)中引物與模板的堿基配對情況及實驗的目的確定。一般為50-72。退火溫度增高會增強對不正確退火引物的識別，還能降低引物3端不正確核苷酸的錯誤延伸。延伸：一般為72

33、60-90s。最后一個循環(huán)后應(yīng)在72保留5min，以保證PCR產(chǎn)物合成的完整性。7. 平臺效應(yīng)和PCR循環(huán)的次數(shù)在PCR基因擴增的后期，由于產(chǎn)物的堆積，將使原來產(chǎn)物以指數(shù)增加的速度變?yōu)槠教骨€，即所謂“平臺效應(yīng)”。它的出現(xiàn)是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩(wěn)定性的降低、終產(chǎn)物的阻滯效應(yīng)及非特異性產(chǎn)物等多種因素造成的，所以選擇合理的循環(huán)次數(shù)，既能得到足夠量的PCR產(chǎn)物，又避免無意義地增加循環(huán)次數(shù)。8. 操作環(huán)境避免環(huán)境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標DNA的污染等?！緩?fù)習思考題】1. 怎樣保證PCR擴增的特異性和產(chǎn)率？2. 如何設(shè)計PCR引物？3. 在PCR引物中引入酶切位點時應(yīng)注意什么？4

34、. PCR擴增體系中為什么要有鎂離子？5. PCR擴增的的基本條件及如何優(yōu)化PCR擴增的條件？6. PCR每一循環(huán)有哪幾個步驟組成？7. 影響PCR擴增的因素有哪些？8. 優(yōu)化哪些條件可以最大限度的減少非特異性擴增？9. DNA純化回收時為什么要用低熔點瓊脂糖凝膠？10. 通過瓊脂糖凝膠電泳分離純化DNA有什么優(yōu)點？11. 為什么在DNA的瓊脂糖凝膠電泳分離純化中，特別強調(diào)配凝膠的三角瓶、電泳槽和配膠板要先沖洗干凈，電泳時用新配制的電泳緩沖液？實驗三 目的片段和載體的連接【實驗?zāi)康摹?通過本實驗掌握DNA重組連接方法?！緦嶒炘怼?外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA

35、叫做重組子。DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術(shù)之一，其本質(zhì)是一個酶促反應(yīng)過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段的5 端磷酸和3 端羥基之間相互作用，形成磷酸二酯鍵的過程。常用的DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對底物的要求低，能更有效地連接DNA的平末端，應(yīng)用更廣泛。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分3步：首先，ATP與T4噬菌體DNA連接酶通過ATP的磷酸與連接酶的賴氨酸的氨基形成酶-AMP復(fù)合物。被激活的AMP隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5端的磷酸基團上，形成磷酸磷酸鍵。DNA鏈3端的

36、羥基取代AMP后與DNA5端的磷酸根形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP，完成DNA之間的連接。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和ATP作為輔助因子，在一定的溫度和pH條件下進行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)的溫度在37 時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16 ，連接12-l6h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。本實驗將Taq DNA聚合酶的PCR擴增產(chǎn)物（3端有突出A）與3端有突出T的線性載體（pCF-T載體）直接進行重組連接?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材移液器、吸頭、恒溫水浴鍋、EP管、微

37、量移液器（10、100、1000L量程各一支）、吸頭、1.5 ml EP管、PE手套和乳膠手套、制冰機。二、藥品及試劑1. pMD-19 T 連接試劑盒（含pMD-19 T載體、連接試劑）2. PCR擴增回收片段?！緦嶒灢襟E】 1. 在滅菌的Eppendorf 管中，加入：pMD-19 T載體 0.5L目的PCR片段 4.5LSolution 5L共10L體系，混勻，16連接過夜（1216h）或室溫（20-25）連接10min。DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3-10倍。2. 蓋好蓋子，用手指輕彈EP管數(shù)次，并于臺式離心機離心2 sec以集中溶液。3. 將反應(yīng)管放入16連接過夜（1

38、216h）。4. 取出約25ng的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定連接結(jié)果，以未經(jīng)連接的質(zhì)粒DNA片段和PCR片段為對照進行電泳檢測?！緦嶒灠才拧勘緦嶒灱s需要一天?！咀⒁馐马棥?1. 連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后應(yīng)迅速做轉(zhuǎn)化實驗。2. 根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)酶的用量。平端連接或接頭連接都比黏端連接慢得多，而且酶的用量也增大。3. 單價陽離子或低濃度的聚乙二醇可提高平端連接的效率。4. 正確調(diào)整載體DNA和外源DNA之間的比例有助于獲得高產(chǎn)量的重組產(chǎn)物?！具B接反應(yīng)的影響因素】 1. 連接溫度與時間的影響因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37。為了解決這

39、一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16，時間為4-16h?，F(xiàn)經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，對于一般的黏性末端來說，20 30min就足以取得相當好的連接效果，當然如果時間充裕的話，20 60min能使連接反應(yīng)進行得更完全一些。對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。2. 酶濃度的影響根據(jù)New England Biolabs公司對T4 DNA連接酶的定義，1U的酶可在16 30min內(nèi)連接20L體系中Hind 酶切片段（黏性末端為0.12mol/L 5末端，此時DNA質(zhì)量濃度約為300ng/L）的50%。連接平末端時酶用量要比連接黏端大10-100倍，廠商為了滿足這

40、一要求，又往往提供高濃度的酶（幾百個單位/L），所以進行黏末端連接時需先行稀釋。除了立即用于反應(yīng)的部分可用酶反應(yīng)緩沖液稀釋外，其余都應(yīng)使用廠商提供的稀釋液。稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便于隨時取用?！緩?fù)習思考題】1. 什么是DNA重組？它包括哪些因素？2. 如何提高DNA的重組效率？3. 連接反應(yīng)的溫度選擇的依據(jù)是什么？4. 通過什么手段可以降低質(zhì)粒自身環(huán)化的數(shù)量？5. DNA連接酶的種類有哪幾種？實驗四 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化效率檢測【實驗?zāi)康摹?通過本實驗掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法。【實驗原理】 體外連接的重組DNA分子導入合適的宿

41、主細胞中才能大量的進行復(fù)制、增殖和表達。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細胞會使細胞易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導細胞進入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCl2法。CaCl2法是目前實驗室常用的制備感受態(tài)細胞的方法，其原理是使細菌處于0°C 、CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細胞膜表面，經(jīng)42°C短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復(fù)合物。本實驗以E.coli DH5菌株為受體細胞，用CaCl2處理受體菌使其處于感受態(tài)，之后通過轉(zhuǎn)化實驗

42、檢測感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化的原理及操作步驟參考實驗五?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材臺式離心機、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、低溫離心機、恒溫搖床、恒溫箱、-70冰箱、4/-20 冰箱、制冰機、50 mL 離心管、小指管、試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶等、玻璃涂棒、鑷子、牙簽、酒精燈、微量移液器（10、100、1000L量程各一支）、吸頭、1.5 ml EP管、PE手套和乳膠手套。二、藥品胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉（NaCl ) 、氯化鈣（CaCl2 ) 。三、試劑1. 1 mol / L CaCl2 溶液2. 1 mol / L MgCl2 溶液3. 75% 甘油4. LB 液體培

43、養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950 mL 去離子水中加入胰蛋白陳（bacto-typtone ) 10g 酵母提取物（bacto-yeast extract ) 5g NaCl 10g 搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0 （每升加1 mol / L NaOH 475 L ）加入去離子水至總體積為1 L , 121 濕熱滅菌20 min ?！緦嶒灢襟E】 1. 從大腸桿菌DH5 平板上挑取一個單菌落接于2 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 210rpm 振蕩培養(yǎng)過夜。2. 次日，按1:100(V/V)，即取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到一個含有100 mL LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37 振

44、蕩培養(yǎng)2-3 h。（此時，OD600 0.3-0.5，此為實驗成功的關(guān)鍵）。3. 將菌液轉(zhuǎn)移到50 mL冰浴好的離心管中，冰上放置10 min。4. 4 3500 rpm/min，離心10 min，回收細胞。5. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置，以便培養(yǎng)液流盡。6. 將菌體重懸于1/10體積的終濃度為20mM CaCl2 和 80 mM MgCl2的混合溶液中。（務(wù)必放冰上）。7. 4 3500 rpm/min，離心10 min，回收細胞。8. 將菌體重懸于1/50體積冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液中。（務(wù)必放冰上）。此細胞為感受態(tài)細胞。于4冰箱中保存，一周內(nèi)使用或?qū)⒕w懸浮于1/50體積冰冷

45、的含有15%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液中，分裝，每100L一份，液氮速凍，置于80?！緦嶒灠才拧勘緦嶒灱s需要兩天?！咀⒁馐马棥?1. 實驗中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源DNA的污染。2. 實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應(yīng)在無菌超凈工作臺上進行。3. 整個實驗過程均需置于冰上。4. 選用對數(shù)生長期細胞，OD600不應(yīng)高于0.6?！緩?fù)習思考題】1. 感受態(tài)細胞有何特點？如何保證它的質(zhì)量？2. 影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些？3. 制備感受態(tài)細胞的過程中需要注意的問題？4. 制備感受態(tài)細胞的原理是什么？5. 制備感受態(tài)細胞時細菌的最佳的生長狀態(tài)？實驗五 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化【

46、實驗?zāi)康摹?通過本實驗，掌握重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法和原理?！緦嶒炘怼?經(jīng)CaCl2法制備的感受態(tài)細胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細胞膜表面，經(jīng)42°C短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA復(fù)合物。本實驗采用E.coli DH5菌株感受態(tài)細胞，與以上實驗所得重組連接的質(zhì)粒載體共保溫實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞后，需對轉(zhuǎn)化菌落進行篩選鑒定。本實驗利用互補現(xiàn)象進行篩選（即藍白斑篩選）。藍白斑篩選是最常用的一種鑒定方法。-肽是大腸桿菌lacZ基因編碼的-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段。-半乳糖苷酶只有在4聚體的狀態(tài)下才有酶活性，缺失-肽則不能形成4聚體。但剩余的-半乳糖苷酶C端的大部分在

47、遇到-肽后仍然能形成4聚體而恢復(fù)酶活性，這種現(xiàn)象稱為互補。 -半乳糖苷酶的酶活性能把無色的化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）分解成半乳糖和一個深藍色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍，因此，該反應(yīng)可作為一個選擇標記。該篩選系統(tǒng)的載體（如pCF-T載體）上有-肽基因lacZ，要求其宿主菌缺失lacZ，保留C端酶活性區(qū)域。人們已經(jīng)制作了lacZ缺失（lacZ）的大腸桿菌菌株作為基因克隆的受體菌，常用的有DH5 、JM101、JM103、JM105、JM109、NM522等。載體lacZ基因的編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入-肽的氨基端而不

48、影響功能。載體在這些菌株中復(fù)制，當培養(yǎng)基中加入誘導物（乳糖或IPTG），就會發(fā)生-互補作用，從而把培養(yǎng)基中的X-gal分解為藍色，菌落為藍色。當載體的MCS中插入外源DNA時，-肽被破壞，不能發(fā)生-互補，培養(yǎng)基中的X-gal仍然是完整的無色物質(zhì)，菌落為白色。因此，按照菌落的顏色就可以確定載體上是否插入了外源基因?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材超凈工作臺、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴器、吸頭、EP管、培養(yǎng)皿、玻璃涂棒、鑷子、牙簽、酒精燈、制冰機。二、藥品胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉（NaCl)、氨芐青霉素、二甲基甲酰胺、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）、IPTG（異丙基

49、-D-硫代半乳糖苷）。三、試劑1. 氨芐青霉素（Amp ) ，用無菌水配制成50 mg / mL 溶液，置-20冰箱保存。2. LB 固體培養(yǎng)基：每升LB 培養(yǎng)基中加15g 瓊脂。3. X-gal貯存液 ：將X-gal 溶于二甲基甲酰胺，配成20 mg / mL 溶液，不需過濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存于 -20 。4. IPTG貯存液：取0.2g IPTG 溶于3 mL 雙蒸水中，再用雙蒸水定容4 mL ，配成50 mg / mL，用0.22 m 濾膜過濾除菌，每份500L ，貯存于-20 ?！緦嶒灢襟E】1. 取100 L 新鮮配制的感受態(tài)細胞，加入實驗三所得重組質(zhì)粒DNA10 L ( 50

50、 ng ）混勻，冰上放置30 min。2. 將管放到42 水浴鍋中，熱激90sec。3. 冰浴2 min 。4. 每管加500L 室溫LB 液體培養(yǎng)基（輕輕混勻），37 溫育45 min ，130rpm慢搖。5. 在預(yù)制的LB 瓊脂平板上，加40L 20 mg / mL的 Xgal 和16L 50 mg / mL的 IPTG 溶液，并用滅菌玻璃棒（酒精燈上燒后冷卻）均勻涂布于瓊脂凝膠表面，37 溫箱中放置30 min。6. 將適當體積（100L）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞均勻涂在含有氨芐青霉素（50gmL ）的平板上，晾至液體被吸收。7. 倒置平皿37 培養(yǎng)12-16h ，出現(xiàn)菌落。培養(yǎng)皿上的會長出藍

51、色和白色菌落，其中白色菌落為含有重組DNA 質(zhì)粒的菌落?！緦嶒灲Y(jié)果】 經(jīng)12 -16h 培養(yǎng)后，培養(yǎng)皿上生長著很多白色菌落和藍色菌落，白色菌落為DNA 重組子（圖5- l ），而轉(zhuǎn)化普通連接產(chǎn)物的培養(yǎng)皿上則只長出白色菌落。實驗 5-1【實驗安排】本實驗約需要一天。鋪瓊脂板，細胞轉(zhuǎn)化，倒置平皿37 培養(yǎng)過夜（12-16h ）?！咀⒁馐马棥?1. 實驗中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源DNA的污染。2. 實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應(yīng)在無菌超凈工作臺上進行。3. 整個實驗過程均需置于冰上。【復(fù)習思考題】1. 什么是轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化中要注意哪些問題？2. 影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些？3.

52、 藍白斑篩選的原理是什么？4. X-gal和IPTG在藍白斑篩選中的作用？實驗六 菌落的PCR鑒定【實驗?zāi)康摹客ㄟ^本實驗學習菌落PCR的基本原理與實驗技術(shù)。【實驗原理】重組子經(jīng)過藍白斑篩選后（具有假陽性），接下來可通過菌落PCR方法對重組子進一步進行快速鑒定。用滅菌后的牙簽輕輕粘取白色菌落的部分菌體，在準備好的雙蒸水中洗涮一下，充分混勻，取一定量加入PCR反應(yīng)體系，在PCR反應(yīng)循環(huán)中，95度加熱可以使細菌破裂，釋放出重組質(zhì)粒作為PCR擴增模板。采用外源基因特異性引物進行擴增，如果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細胞，則可以擴增得到預(yù)期大小的目的片段。采用菌落PCR的方法，將樣品跳過DNA提取這一步，而直接以

53、菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，不僅節(jié)約了時間，增加了設(shè)備利用率，同時也降低了實驗成本?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材PCR熱循環(huán)儀、臺式離心機、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器（0.1-2.5L）、200L PCR管、吸頭、離心管、手套、制冰機、微量移液器（10、100、1000L量程各一支）、膠帶、100 mL或250 mL錐形瓶、量筒、點樣板或parafilm、吸頭、PE手套和乳膠手套。二、試劑1. 10 × 緩沖液500 mmol/L KCl 100 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3，室溫）15 mmol/L MgCl2 2. DNA 模板 (以菌體熱解后暴露的DNA為模板)3. dNTP Mix2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L d