肺出血模型研究進(jìn)展

1、肺出血動物模型的研究進(jìn)展 專業(yè) 姓名 學(xué)號摘要：肺出血，又稱肺出血-腎炎綜合征（Goodpastures syndrome，GPS）可能系病毒感染和/或吸入某些化學(xué)性物質(zhì)引起原發(fā)性肺損害。由于肺泡壁毛細(xì)血管基膜和腎小球基底膜存在交叉反應(yīng)抗原，故可以引起繼發(fā)性腎損傷。明確的病因尚未證實(shí)，但多推測和感染特別是病毒感染有關(guān)。其主要特征為咯血肺部浸潤、腎小球腎炎、血和累及的組織中有抗基底膜抗體。本病雖然臨床少見，但死亡率高，多發(fā)于2030歲的男性青年。本文將介紹幾種構(gòu)建肺出血實(shí)驗(yàn)動物模型的方法。關(guān)鍵詞：肺出血， 肺出血-腎炎綜合征， 實(shí)驗(yàn)動物模型The research progress about

2、animal models of Goodpastures syndromeAbstract：Goodpastures syndrome may be caused by viral infection and inhalation of certain chemical substances. It can cause secondary renal injury due to the cross-reactive antigens between alveolar wall capillary basement membrane and glomerular basement membra

3、ne. The explicitly nosogenesis hasnt been proved，but we conjecture that it is related to infect especially virus infected. Its main features are hemoptysis, lung infiltration, glomerular nephritis, blood and the organization involving in anti-basement membrane antibodies. Though it is uncommon in th

4、e clinical, its mortality rate is high. It mostly occurs in twenty to thirty male young people.This paper summarizes the current several animal models of Goodpastures syndrome.Key words: Goodpastures syndrome, animal models1 疾病簡介1.1 疾病表現(xiàn)肺出血-腎炎綜合征(Goodpastures syndrome,GPS)又稱抗基膜性腎小球腎炎，1919年由Goodpastu

5、re首先描述男性病患一例，1958年Stanton和Tange正式將此類疾病名為Goodpastures syndrome，它是以肺出血和急進(jìn)型腎炎為特征的一種綜合征，與自身免疫有關(guān)，臨床少見 【1】。其主要臨床表現(xiàn)為咯血和急進(jìn)性腎炎；腎（肺）活檢免疫熒光檢查顯示腎小球基底膜或（和）肺毛細(xì)血管基底膜LgG、G3線樣沉積；血清抗腎小球基底膜抗體陽性；影像學(xué)上主要表現(xiàn)為中下肺野中外帶腺泡結(jié)【2】。X線檢查見兩肺有彌漫性或結(jié)節(jié)狀陰影，自肺門向周圍擴(kuò)散，肺尖及近膈肌處清晰，常一側(cè)較重，有的無咯血史，但經(jīng)痰含鐵血黃素及胸片檢查證實(shí)有出血。免疫熒光檢查顯示肺泡間隔和肺毛細(xì)血管基膜有免疫球蛋白和C3呈線狀沉

6、積。1.2 病因GPS的發(fā)病機(jī)理不甚明確，一般認(rèn)為其可能系病毒感染和/或吸入某些化學(xué)性物質(zhì)引起的原發(fā)性肺損害。有學(xué)者認(rèn)為與以下因素有關(guān)： 1.2.1 感染   呼吸道感染，特別與流感病毒感染是本病最常見的誘因。最近研究發(fā)現(xiàn)獲得性免疫缺陷病患者感染卡氏肺囊蟲肺炎(Pneumocystis Carinii Pneumonia)后，機(jī)體易產(chǎn)生抗GBM抗體。Calderon等報(bào)道4例HIV感染者中3例抗型膠原3鏈抗體(抗GBM抗體)陽性，提示卡氏肺囊蟲肺炎時(shí)肺泡損害可以誘發(fā)肺出血-腎炎綜合征。1.2.2 接觸汽油蒸汽、羥化物、松節(jié)油及吸入各種

7、碳?xì)浠衔??！?】1.2.3 吸入可卡因   Perez等報(bào)道1例長期吸煙的患者在吸用可卡因3周以后發(fā)生了肺出血一腎炎綜合征。 GPS臨床上并不常見，其發(fā)病率約為每年0.10.5/100萬人，占急進(jìn)型腎小球腎炎病例的1%2%，可發(fā)生于任何年齡,但以青年男性多見,平均年齡2126.8歲,男女比例約為3.691。我國自1965年首例報(bào)道以來，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)已有100余例見諸報(bào)道?！?】在臨床上，新生兒肺出血(neonatal pulmonary hemorrhage，NPI)的發(fā)病率要遠(yuǎn)高于GPS。NPI是指肺部累積兩個(gè)肺葉以上的出血，是新生兒期病情非常兇險(xiǎn)、

8、發(fā)展極快的一種危重疾病，它是新生兒嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，是新生兒期死亡的重要原因之一?！?】目前尚無特效治療措施，病死率極高。新生兒肺出血的病因很多，包括低溫、缺氧及感染等，但其確切發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明?！?】2 造模方法目前構(gòu)建肺出血實(shí)驗(yàn)動物模型的方法很多，但是多數(shù)多是模擬新生兒肺出血發(fā)病機(jī)制，對新生兒肺出血進(jìn)行研究。在研究過程中，我們將肉眼觀察肺出血情況的結(jié)果分成5 級：I級正常肺；II級肺水腫； III級點(diǎn)狀肺出血；IV級局灶性肺出血；V級彌漫性肺出血【6】。現(xiàn)將模型制作方法介紹如下。2.1低溫缺氧造模方法【6】2.1.1方法采用出生47d的Wistar新生大鼠40只, 隨機(jī)4組。A組為正

9、常對照組, 置于25恒溫環(huán)境中。其余大鼠放入氧濃度為5% 6%的有機(jī)玻璃箱內(nèi), 并將該箱放入(10±1)冰箱中。按置放時(shí)間分為: 低溫缺氧1h組(B組);低溫缺氧2h組(C組);低溫缺氧4h組( D 組) , 將此3組新生大鼠分別于1, 2, 4 h 后取出并迅速放入置于水浴箱中的有機(jī)玻璃箱內(nèi), 維持箱37, 供氧使箱內(nèi)氧濃度達(dá)99. 5% 100%, 3 組均持續(xù)2 h。斷頭法處死動物, 肉眼觀察肺出血情況。2.1.2建模結(jié)果結(jié)果病理分級如下：具體病理改變?yōu)楣忡R下見部分肺泡含氣不全,部分肺泡代償性擴(kuò)張,肺泡腔內(nèi)有較多水腫液和紅細(xì)胞,肺泡間隔明顯水腫;部分細(xì)支氣管腔內(nèi)可見水腫液及壞死

10、脫落細(xì)胞;毛細(xì)血管中度充血。電鏡下毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中度腫脹,異染色質(zhì)增多、邊聚,血管腔變窄,部分基底膜變薄或中斷,肺泡間隔可見紅細(xì)胞;II型上皮細(xì)胞及其中的線粒體均腫脹,嵴模糊,板層小體數(shù)目減少,可見排空現(xiàn)象, 肺泡面微絨毛減少,但上皮細(xì)胞之間緊密連接尚無異常。2.1.3模型特點(diǎn)肉眼觀察均有不同成度的肺出血，其中彌漫性肺出血多表現(xiàn)為全肺各葉的大片出血。本動物模型的制作具有一定的合理性及可重復(fù)性,便于開展對肺出血發(fā)病機(jī)制的研究,盡管模型的制作對臨床給予了一些啟示,但低溫缺氧后再復(fù)溫供氧所致肺出血的機(jī)理,尚需進(jìn)一步研究。2.2五羥色胺氣管滴入造模方法【7】2.2.1方法將動物編號秤重后，取仰臥位固

11、定，剪開頸部皮膚，暴露氣管，將接有水柱的小號套管針插入氣管5mm，拔出針芯，看到水柱隨呼吸上下波動即表示進(jìn)入氣管；動物分別取右側(cè)臥及頭高位體位，用移液器將生理鹽水及不同濃度5-HT 20ul的注入氣管。2.2.2 結(jié)果具體的濃度及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：光鏡觀察結(jié)果如下：正常肺臟組織局灶性肺出血肺組織點(diǎn)狀肺出血肺組織 彌漫性肺出血肺組織由數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和光鏡觀察結(jié)果所知，通過外源性5-HT氣管滴入可以建立新生大鼠的肺出血動物模型，以濃度1*10-5mol/L較為適宜，隨著5-HT濃度增加，大鼠死亡率增加，但肺出血的程度無顯著差異。2.2.3模型特點(diǎn)本模型制作簡便，重復(fù)性好，其中彌漫性肺出血占10% 15%便于

12、在此基礎(chǔ)上進(jìn)行有關(guān)肺出血的進(jìn)一步研究。2.3注射IV型膠原3鏈抗體造模方法【8】2.3.1方法采用體重150g180gWistar-Kyoto(WKY)大鼠。從牛腎小球基底膜組織分離IV膠原六聚體，然后分解為單體和二聚體。然后將制備好的注射物不同劑量的制備物分別注射給大鼠，進(jìn)行觀察；7天后再次注射，15天后觀察結(jié)果。2.3.2結(jié)果注射單體膠原的大鼠無明顯結(jié)果，注射二聚體和六聚體的大鼠可見明顯的肺出血，在尿液中可檢測到尿蛋白，在腎小球基底膜可發(fā)現(xiàn)線性IgG。牛3(IV)NC1A二聚體免疫后大鼠肺組織。A.對照組大鼠正常的肺組織切片(HE,×150)。B. 20ug 3(IV)NC1二聚

13、體免疫后大鼠肺組織，可見局灶出血和肺泡壁增厚（PAS染色×150）。C. 50ug 3(IV)NC1二聚體免疫后大鼠肺組織，可見肺泡中有紅細(xì)胞（HE染色×300）。D. 50ug 3(IV)NC1二聚體免疫后大鼠肺組織，可見紅細(xì)胞和含鐵血黃素沉著。右下角小圖可見巨噬細(xì)胞內(nèi)含含鐵血黃素。（Gomoris Prussian Blue染色×300，右下角×800）。2.4腹腔注射脂多糖造模方法【9】 2.4.1方法該方法模擬的是有感染引起的肺出血。選擇新生Wistar大鼠，日齡7天，體重12到18克，共88只。將88只大鼠隨機(jī)分成8組，分別為生理鹽水對照組（8

14、只）, LPS 注射后30min 組（8只）,1 h 組（8只）, 2 h 組（8只）, 4 h 組（8只）, 8 h 組（8只），16 h 組(16只) , 24 h 組(24只)。腹腔注射脂多糖，劑量為5 mg/ kg。注射后病理分級如下：2.4.2結(jié)果其中16 h 組死亡8 只, 24 h 組死亡17 只。所有存活動物按設(shè)定時(shí)間斷頭處死, 立即打開胸腔, 右肺上葉作光鏡及電鏡病理檢查。肺組織大體病理改變?yōu)?LPS 注射后0.5 h 肺組織即可見點(diǎn)狀肺出血, 給藥后1 8 h, 肺出血的程度自局灶性到彌漫性逐漸加重, 大鼠發(fā)生肺出血的數(shù)量也逐漸增多。光鏡檢查顯示，隨著肺組織從正常到彌漫性肺

15、出血發(fā)展, 光鏡下可見肺組織毛細(xì)血管充血, 少量出血到彌漫性出血, 肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞逐漸增多, 到給藥后48 h, 肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)可見大量的紅細(xì)胞, 但未見明顯的中性粒細(xì)胞浸潤。給藥后16 h, 肺泡腔內(nèi)可見較多的中性粒細(xì)胞及少量的巨噬細(xì)胞, 給藥后24 h, 肺組織內(nèi)可見大量的中性粒細(xì)胞。透射電鏡顯示正常新生大鼠肺組織可見毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù), 基膜完整。隨著給藥后時(shí)間的延長, 正常結(jié)構(gòu)已破壞。給藥后4 8 h 改變最嚴(yán)重, 可見毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體空泡變性, 內(nèi)皮細(xì)胞間胞膜不連續(xù), 細(xì)胞間連接消失, 基膜變薄, 斷裂, 氣血屏障破損。2.4.3模型特點(diǎn)此模型病理改變與新生兒肺出血的病理改變

16、相似，在早期, 是否發(fā)生一過性肺毛細(xì)血管內(nèi)壓力的增加而引起的機(jī)械性肺損傷, 尚待進(jìn)一步研究。2.5 皮下注射腎上腺素造模方法【10】2.5.1方法選用一月齡SD大鼠24只，雌雄不限，隨機(jī)分成兩組。實(shí)驗(yàn)組大鼠背部注射0.1%腎上腺素注射液，每日2次，第一天劑量每次0.2mg/kg，第二天每次0.3mg/kg，以此逐漸增加至第七天0.8mg/kg（體重以第一天稱量為準(zhǔn)）。對照組大鼠相同部位同等容量生理鹽水，每日兩次。實(shí)驗(yàn)組大鼠死后便立即處死，解剖觀察，病理分級如下：2.5.2結(jié)果電鏡結(jié)果如圖：A：肺氣泡擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞 B：I型上皮局部崩潰C：II型細(xì)胞板層小體空泡化，線粒體腫脹，絨毛減少 D：毛

17、細(xì)血管擴(kuò)張充血，充氣，氣血屏障變薄，可見氣血屏障全層斷鏈，紅細(xì)胞即將逃逸出毛細(xì)血管2.5.3 模型特點(diǎn)該模型是模擬臨床先天性心臟病, 超量輸液致嚴(yán)重肺血管充血導(dǎo)致的新生兒肺出血。本模型的制作具有一定的合理性和可重復(fù)性, 便于開展對肺出血的研究, 但實(shí)驗(yàn)時(shí)間偏長,有待改進(jìn)。2.6注射鉤端螺旋體培養(yǎng)液造模方法【11】2.6.1方法采用體重150500g健康豚鼠。將豚鼠左側(cè)腹部被毛剪去一塊，常規(guī)消毒，每只豚鼠腹壁皮下注射017黃疸出血型鉤端螺旋體的培養(yǎng)混懸液（每只×40視野含2040條，由四川醫(yī)學(xué)院鉤端螺旋體病防治研究實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)成功）0.20.4ml，進(jìn)行感染?？墒?00%的豚鼠復(fù)制有肺出

18、血，30%的豚鼠有黃疸。2.6.2結(jié)果感染后肺出血呈漸進(jìn)性變化，最初僅針尖大小，以后發(fā)展成為斑塊或大葉。出血灶的擴(kuò)延有直接擴(kuò)大、點(diǎn)灶融合及沿支氣管腔蔓延等多種方式。出血灶絕大多數(shù)分布于臟層膜下淺表部位，僅晚期才蔓延到深部。感染57d，血小板計(jì)數(shù)減少，血塊不收縮，心電圖出現(xiàn)QT延長，心動過緩心肌糖原減少，心肌出血，同時(shí)血管脆性增加，肺出血嚴(yán)重。少數(shù)豚鼠表現(xiàn)全肺出血，死時(shí)口鼻流出少量血液。2.6.3模型特點(diǎn)該模型可用于彌漫型肺出血發(fā)病機(jī)理和搶救措施比較系統(tǒng)的研究。2.7沖擊傷和燒傷復(fù)合傷【12】2.7.1方法用體重180到220克的雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為沖擊傷組、燒傷組和燒沖復(fù)合組，沖擊傷

19、后15min內(nèi)速發(fā)死亡大鼠另列一組。以BST-1型生物激波管致沖擊傷, 沖擊波超壓峰值為429.3±11.5KPa，正壓作用時(shí)間55到60ms，負(fù)壓40.8 KPa，持續(xù)約20ms。沖后用5KW溴鎢燈致體表15%III度燒傷, 單燒組只造成15%III度燒傷。于傷后2、12、24、72和168h各組分別麻醉活殺5只, 取出心肺，固定切片觀察。2.7.2結(jié)果本實(shí)驗(yàn)速發(fā)死亡大鼠除肺臟外無肉眼可見的其它臟器損傷, 平均肺出血體積占全肺96.3 % , 水腫多位于出血區(qū)邊緣組織, 單純肺水腫較少。嚴(yán)重肺水腫只見于稍晚(> 0.5 h)死亡的動物。因此嚴(yán)重肺出血是致死的主要原因。2.7.

20、3模型特點(diǎn)肺是沖擊傷時(shí)最易受損的靶器官之一,在以超壓為主的沖擊波作用下, 損傷尤為突出。肺出血是肺損傷的最主要病變，所以可以用沖擊傷又發(fā)肺心病。核爆炸沖擊傷由動壓和超壓作用所致，肺臟病理變化表現(xiàn)為出血、水腫、破裂、血?dú)馀菪纬?、局部肺泡萎陷或擴(kuò)張。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M核爆炸時(shí)的沖擊傷造成的肺出血，對其進(jìn)行研究，但是動物在受傷即刻或數(shù)分鐘內(nèi)形成如此廣泛而嚴(yán)重的肺出血, 其機(jī)理值得進(jìn)一步研究。2.8注射兔抗大鼠肺臟血清造模方法【13】這種造模方法比較特別，首先是將大鼠肺臟的不溶提取物（球蛋白檢測呈陰性）用生理鹽水稀釋后注射入家兔體內(nèi)，6到13周后耳靜脈采血提血清，然后將陽性血清注入大鼠體內(nèi)，四周后處死大鼠觀察

21、肺臟的病變情況。結(jié)果顯示肺臟出現(xiàn)明顯的腫脹和出血，腎臟也出現(xiàn)不同程度的損傷。在當(dāng)時(shí)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了一個(gè)假說，有些器官病變是由于自身的免疫失調(diào)造成的。雖然這種造模方法比較復(fù)雜，但是其結(jié)果比較顯著，是研究自身免疫造成的肺心病的較優(yōu)模型。2.9外源性內(nèi)皮素-1(exET-1)致肺出血造模方法【14】2.9.1方法Wistar新生大鼠100只,日齡45 d,體重810 g,雌雄不限。隨機(jī)分為對照組A組10只,實(shí)驗(yàn)組90只中分為B、C、D、E 4組各20只、F組10只,每組動物間體重?zé)o差異。經(jīng)氣管插管于氣管內(nèi)滴入生理鹽水(對照組)及不同濃度exET-1(實(shí)驗(yàn)組)各30l。 A組滴生理鹽水,BF組滴exE

22、T-1,濃度分別為2×10-6,3×10-6,4×10-6,5×10-6及10×10-6 (單位均為mol/L)。2.9.2結(jié)果注入藥液3 h后處死動物,取出雙側(cè)肺臟,觀察肺組織大體病理及用10%中性福爾馬林固定24 h,石蠟包埋后HE染色,光鏡觀察。肺出血發(fā)生率(包括點(diǎn)狀、局灶及彌漫)從B組的40%(8/20)升至D組的80%(16/20),彌漫性肺出血數(shù)量亦逐漸增加,其中D組肺出血最嚴(yán)重,但E及F組肺出血發(fā)生率反降至50%(10/20)及20%(2/10)。exET-1濃度3×10-6mol/L時(shí)新生大鼠無死亡,濃度>3&#

23、215;10-6mol/L時(shí),死亡率從D組的20%(4/20)升至F組的60%(6/10),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明,exET-1氣管內(nèi)滴入可致肺出血:B、C、D、E、F各組肺出血病變均重于正常對照組(P均<0.05),D組(4×10-6mol/L exET-1)又重于B、C、E、F各組(P均<0.05),而該4組間差異無顯著意義(P均>0.05)。盡管隨exET-1濃度的增加,死亡率上升,但死亡大鼠病變程度不同,D組以局灶及彌漫性肺出血為多,E及F組則以肺水腫及點(diǎn)狀出血為主,且后兩組存活大鼠肺出血程度亦較輕。2.9.3模型特點(diǎn)采用exET-1氣管內(nèi)滴入,可建立新生大

24、鼠肺出血動物模型,并在一定濃度范圍內(nèi),隨exET-1濃度的增加,肺出血加重。其中D組肺出血程度最重,提示肺組織中內(nèi)源性ET-1水平異常升高,也可能是導(dǎo)致肺出血的原因之一。此外,存活大鼠紫紺以滴入exET-1后30 min最嚴(yán)重,符合內(nèi)源性ET-1在(1530)min達(dá)最大血管收縮效應(yīng)的特點(diǎn)。3展望由于肺出血的致病因素很多，關(guān)于肺出血的模型也很多。在這些模型當(dāng)中，低溫缺氧造模方法，腹腔注射脂多糖法，皮下注射腎上腺素法，注射IV型膠原3鏈抗體法，這四種方法操作簡便，對動物造成的痛苦較其它方法要小，但是后兩種方法時(shí)間長，有待改進(jìn)。五羥色胺氣管滴入造模法造模時(shí)間短，可重復(fù)性好，在實(shí)驗(yàn)過程中注意對動物的

25、麻醉及手術(shù)處理。本文所介紹的這些模型均模擬的是一種因素短時(shí)間的影響，而臨床上肺出血往往是由于一種因素長時(shí)間作用或幾種因素共同作用的結(jié)果。所以，怎樣合理有效的在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立更符合臨床特點(diǎn)的肺出血模型有待進(jìn)一步研究。據(jù)有些醫(yī)院臨床檢查情況來看，有些肺出血患者有長期接觸汽油蒸汽、羥化物、松節(jié)油及吸入各種碳?xì)浠衔锏那闆r，因此可以使動物通過吸入有這類物質(zhì)的空氣來建立肺出血-腎炎綜合征的疾病模型，更詳細(xì)的研究疾病發(fā)病機(jī)理和發(fā)病過程。參考文獻(xiàn)【1】 苗姝，孫延翁等. 肺出血-腎炎綜合征1例報(bào)告并文獻(xiàn)復(fù)習(xí). 中國誤診學(xué)雜志2004年7月第4卷第7期【2】 解放軍腎臟病研究所學(xué)術(shù)委員會.腎臟病與透析移植雜志.2006年8月第15卷第4期【3】劉昭紅，廖谷清. 肺出血腎炎綜合征2例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí). 臨床醫(yī)學(xué)2004年10月第24卷第10期【4