超氧化物歧化酶

1、超氧化物歧化酶(SOD)簡述YB 2012級(jí)生物技術(shù) 摘要：超氧化物歧化酶首先由Mann和Keilin從牛紅細(xì)胞中分離提取出,是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,由于其具有清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的作用,而引起廣大學(xué)者的關(guān)注。本文概述了SOD的分類、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及研究進(jìn)展,并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：超氧化物歧化酶;SOD;理化性質(zhì)生物體內(nèi)低濃度超氧陰離子自由基(O-2)是維持生命活動(dòng)所必需的,其濃度過高時(shí),可引起機(jī)體組織細(xì)胞氧化損傷,導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生疾病,甚至死亡。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,簡稱SOD)是清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的一種重要抗氧化酶,具有抗

2、衰老、抗癌、防白內(nèi)障等作用1,因而受到全世界學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注,使之成為涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域及醫(yī)藥、化工、食品等生產(chǎn)行業(yè)的一個(gè)熱門研究課題2。1. SOD的分類 SOD廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物中1。根據(jù)其結(jié)合金屬種類不同,可分為三類:第一類為Cu·Zn-SOD,呈藍(lán)綠色,相對(duì)分子量約為32kDa,主要存在于真核細(xì)胞細(xì)胞漿、葉綠體和過氧化物酶體內(nèi);第二類為Mn- SOD,呈紫紅色,相對(duì)分子量約為40kDa,主要存在于真核細(xì)胞線粒體和原核細(xì)胞中;第三類為Fe-SOD,呈黃褐色,相對(duì)分子量約為38.7kDa,主要存在于原核細(xì)胞及一些植物中2。2. SOD的結(jié)構(gòu)1975年R

3、ichardson得到了CuZn-SOD的三維結(jié)構(gòu)5,發(fā)現(xiàn)它是由2個(gè)基本相似的亞基組成的二聚體,且每個(gè)亞基含有1個(gè)銅原子和1個(gè)鋅原子。2個(gè)相同亞基之間通過非共價(jià)鍵的疏水相互作用而締合,類似于圓筒的端面。CuZn-SOD的單個(gè)亞基活性中心結(jié)構(gòu)見圖1。從圖中可知Cu與4個(gè)來自組氨酸殘基(His44,46,61,118)的咪唑氮配位呈現(xiàn)1個(gè)三角雙錐畸變的四方錐構(gòu)型,Zn則與3個(gè)來自組氨酸殘基(His61,69,78)的咪唑氮和1個(gè)天門冬氨酸殘基(Asp81)的羧基氧配位,呈畸變的四面體構(gòu)型。Mn-SOD和Fe-SOD的結(jié)構(gòu)則比較簡單,且二者相似,每個(gè)亞基的活性中心金屬離子,都是與1個(gè)水分子和3個(gè)組氨

4、酸(His)殘基及1個(gè)天門冬氨酸(Asp)殘基的羧基氧配位,呈畸變四方錐構(gòu)型6。Mn-SOD和Fe-SOD一般為二聚體或四聚體,每個(gè)亞基含0.5一1.0個(gè)Mn和Fe原子。它們?cè)诳臻g結(jié)構(gòu)上與Cu·Zn-SOD不同,含有較高程度的。一螺旋,而件折登較少?，F(xiàn)已有多種生物中的SOD的三維結(jié)構(gòu)登錄到GenBank中,并且對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析。3. SOD的理化性質(zhì)3.1 SOD的主要物化特性 近年來很多專家對(duì)SOD的物化特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究,研究結(jié)果表明:SOD屬酸性蛋白酶,對(duì)pH、熱和蛋白酶水解等反應(yīng)比一般酶穩(wěn)定7。將三類SOD的主要物化特性列于表1。Joan等人指出不同來源的Cu

5、83;Zn-SOD具有較高的同源性,它們的物化特性也很相似,據(jù)推測它們可能由同一原始酶進(jìn)化而來。不同來源的Mn-SOD和Fe-SOD也具有相似的物理性質(zhì)和較高的同源性,它們可能由另一原始酶進(jìn)化而成。3.2 SOD的活性中心和催化機(jī)理三類SOD的活性中心都含有金屬離子。如采用物理或化學(xué)方法除去金屬離子，則酶活喪失;如重新加上金屬離子，則酶活又恢復(fù)。Cu·Zn - SOD的活性中心形態(tài)像個(gè)橢圓形口袋，口袋底部的Cu2+與4個(gè)His和1個(gè)H2O配位，E2+與3個(gè)His和1個(gè)Asp配位。Cu和Zn離子之間通過共同連接1個(gè)His而構(gòu)成咪唑橋結(jié)構(gòu)8?？诖L15A°、寬9A°、

6、深6A°，口袋底部是Cu2+和Zn2+存在的部位，底物就結(jié)合于口袋之中?；钚灾行牡腍is對(duì)酶活性至關(guān)重要，該殘基受損，酶活性喪失，位于活性中心附近且與Cu2+相距6A°的精氨酸143，因具有正電荷，是進(jìn)人活性中心的誘導(dǎo)者，并提供H+以加快歧化速度。如果該酶殘基被修飾，大部分正電荷消失，不利的進(jìn)人，酶活性降低99% 。Cu2+和Zn2+對(duì)活性中心的作用亦不同，Cu2+是必需的，任何金屬取代Cu2+都可使酶失活，而Zn2+被Co2+, Hg2+、Cd2+取代而不影響活性7。Mn-SOD和Fe-SOD的活性中心的金屬離子與3個(gè)His,1個(gè)Asp和1個(gè)H2O配位。三類SOD的活性中

7、心均含有金屬離子,His、Asp和H2O8。氧化物可以與Cu2+和Zn2+配位而使酶失活,但不受乙醇、氯仿影響;金屬的鰲合劑如EDTA可除去Cu2+、Zn2+,導(dǎo)致酸失活;H2O2能與Cu2+反應(yīng),使Cu2+變成Cu+,導(dǎo)致酶失活;添加·OH清除劑可保護(hù)酶的天然結(jié)構(gòu)。Mn-SOD具有抗CN-能力,但可被乙醇、氯仿破壞,Mn-SOD可由氧誘導(dǎo)產(chǎn)生,其增加是和高壓氧的量有關(guān),故認(rèn)為Mn-SOD是內(nèi)源性0夏的“清道夫”。Fe-SOD能抗CN-,但氧不能誘導(dǎo)Fe-SOD的產(chǎn)生,Fe-SOD是外源性的清除劑。SOD是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶,它的作用底物是超氧陰離子,它催化超

8、氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng),從而清除q。其催化機(jī)理是:SOD(氧化型)+ SOD-（還原型）+ ，SOD-（還原型）+ SOD(氧化型)+H2O2 ，總反應(yīng)式：3.3 SOD的化學(xué)修飾SOD作為藥用酶用于臨床受以下因素的影響:半衰期短,通常只有610min;分子量大,不易透過細(xì)胞膜;抗原性;如用于口服,易被蛋白水解酶水解。鑒于上述不利因素,對(duì)SOD分子進(jìn)行改造就顯得十分重要,近年很多專家對(duì)SOD分子的修飾進(jìn)行了研究911,目的是為了提高SOD的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)表明:修飾酶不僅完全保留了天然酶的活性,而且在耐熱、耐酸、耐堿和抗胃蛋白酶水解能力等方面都明顯地優(yōu)于天然酶,修飾酶較天然酶穩(wěn)定(表2,圖2),特別

9、是酶經(jīng)修飾后大大延長了在體內(nèi)停留時(shí)間12。目前對(duì)SOD進(jìn)行分子修飾改造的途徑有:對(duì)SOD氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾;用水溶性大分子對(duì)SOD進(jìn)行共價(jià)修飾;對(duì)SOD進(jìn)行酶切修飾7。近年來用水溶性大分子對(duì)SOD修飾研究和應(yīng)用較多,原因有3個(gè)方面:反應(yīng)條件溫和,且酶活保持較好;形成共價(jià)蛋白加合物水溶性好;具有較好的生物相容性10。天然牛血SOD的t1/2的6min,而右旋糖酐SOD、低分子聚蔗糖SOD、高分子聚蔗糖SOD、聚乙二醇SOD的t1/2;分別為7,14,24,35h12。并且聚乙二醇與SOD共價(jià)修飾后,除可使半衰期延長外,還可粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面,增加了其抗自由基作用13。另據(jù)Michelso

10、n等人報(bào)道,SOD被脂質(zhì)體包裹可明顯延長半衰期。將SOD包人脂質(zhì)質(zhì)體后不但可提高SOD進(jìn)人細(xì)胞的量,還可以選擇性地將SOD導(dǎo)人到一定的器官中14。4. SOD的研究進(jìn)展 超氧化物歧化酶是生物體防御氧化損傷重要的生物酶。近些年,國內(nèi)外學(xué)者除對(duì)動(dòng)物SOD進(jìn)行研究外,還對(duì)植物SOD和微生物SOD進(jìn)行了研究。4.1微生物SOD的研究進(jìn)展近幾十年,SOD一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。但他們的研究大多集中于從動(dòng)物血液或臟器中提取SOD,易受原料來源、產(chǎn)品得率、穩(wěn)定性及安全性等方面的限制。微生物具有原料便宜易得,可大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì),因而,近些年很多學(xué)者都致力于用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的研究。上世紀(jì)80年代后,美

11、國和日本已先后開發(fā)了用發(fā)酵法生產(chǎn)SOD,大大降低了生產(chǎn)成本。目前,國內(nèi)外在微生物SOD的菌種選育、發(fā)酵工藝、分離提純、生理學(xué)研究、基因克隆表達(dá)及SOD應(yīng)用方面都取得一定的研究進(jìn)展15,16。4.2植物SOD的研究進(jìn)展植物細(xì)胞在正常代謝活動(dòng)和逆境條件下均能產(chǎn)生活性氧。近年來,國內(nèi)外的專家學(xué)者主要研究了SOD與植物抗逆性的關(guān)系。研究表明,在逆境條件下,植物的抗性與植物體內(nèi)能否維持較高的SOD活性水平有關(guān)。環(huán)境脅迫能誘導(dǎo)植物SOD基因的表達(dá)。當(dāng)前,不同類型的SOD基因已被轉(zhuǎn)化到多種植物中,有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SOD在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達(dá)可以不同程度地提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗能力17,18。因此,可利用

12、基因工程方法來獲得抗逆植株。4.3動(dòng)物SOD的研究進(jìn)展目前,SOD作為O2-特異清除劑,已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化妝品行業(yè)當(dāng)中。4.3.1 SOD在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用SOD由于半衰期短、分子量大、易失活等缺點(diǎn),不利于臨床使用,而基因工程手段對(duì)SOD分子進(jìn)行化學(xué)修飾則成為近些年的研究熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明,修飾酶不僅完全保留了天然酶的活性,在耐熱、耐酸堿度、抵抗蛋白酶水解以及穩(wěn)定性方面也明顯優(yōu)于天然酶,大大延長了它在體內(nèi)停留的時(shí)間4。當(dāng)前已有多種藥用SOD應(yīng)用于臨床中,主要集中于抗炎癥、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤和自身免疫系統(tǒng)疾病等與活性氧損傷有密切關(guān)系的病癥中。4.3.2 SOD在食品工業(yè)中的應(yīng)用SOD應(yīng)

13、用于食品工業(yè)中,主要是作為食品添加劑和重要的功能性基料。目前,已開發(fā)的產(chǎn)品有以大蒜為原料生產(chǎn)的大蒜粉、大蒜油,以獼猴桃為原料生產(chǎn)的獼猴桃汁以及添加SOD的牛奶、咖啡、酸奶、啤酒等保健食品。4.3.3 SOD在化妝品行業(yè)中的應(yīng)用由于SOD具有抗衰老作用,它已被廣泛應(yīng)用于化妝品中,對(duì)于治療皺紋、雀斑、粉刺、色素沉著等具有明顯作用。因此,含有SOD的化妝品倍受女性青睞。5. 展望目前,SOD作為藥用酶用于臨床已有深入研究,但由于其制備純化工藝復(fù)雜,生產(chǎn)成本高,因而在食品中應(yīng)用不是很廣泛,鑒于從微生物中提取SOD存在諸多優(yōu)點(diǎn),因此用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD有可能不經(jīng)過提純直接用于食品、化妝品及食品添加劑中

14、。隨著研究進(jìn)一步加深,利用微生物生產(chǎn)SOD進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段,相信其在醫(yī)藥、食品、化妝品等方面應(yīng)用更加廣泛。參考文獻(xiàn)1 丁書茂,楊旭.超氧化物歧化酶及其模擬化合物研究進(jìn)展J.高等函授學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,17(1): 1-5.2 張曉燕.超氧化物歧化酶的研究現(xiàn)狀及在食品中的應(yīng)用綜述J.揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,6(1): 34-37.3 蔡敬杰,樊志.超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展J.天津化工,1997,2: 2-4.4 王震宙,陳紅蘭.SOD的應(yīng)用研究進(jìn)展J.食品科技: 29-30.5 陳忠寧.毛宗萬,唐雯霞.銅鋅超氧化物歧化酶的結(jié)構(gòu)機(jī)理及其模擬研究進(jìn)展J.化學(xué)通報(bào).1993,(6)：1-7

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