博士論文答辯

1、博士論文答辯博士論文答辯草魚核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域草魚核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域 (nucleotide-binding oligomerization domain，NOD )基因和基因和-干擾素相關(guān)基因干擾素相關(guān)基因( IFN-gamma related gene，IFN-rel)的克隆及其表達(dá)的克隆及其表達(dá) 指導(dǎo)教師：彭克美指導(dǎo)教師：彭克美 教教 授授 聶聶 品品 研究員研究員 答答 辯辯 人：陳文欽人：陳文欽 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技-動物醫(yī)學(xué)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 2010年5月30日答辯內(nèi)容答辯內(nèi)容五、課程學(xué)五、課程學(xué)習(xí)及文章發(fā)習(xí)及文章發(fā)表情況表情況四、創(chuàng)新點四、創(chuàng)新點及下步

2、研究及下步研究計劃計劃二、草魚二、草魚NODNOD基因基因三、草魚三、草魚- -干擾素相關(guān)干擾素相關(guān)基因基因一、研究一、研究 背景背景1.概述概述 以往為人們所熟知的PRRs主要是一些膜結(jié)合蛋白如甘露糖受體、To1l樣受體、CD14和清道夫受體等，主要識別胞外環(huán)境的微生物結(jié)構(gòu)成分。最近的研究發(fā)現(xiàn)，胞漿中也存在著識別細(xì)菌和病毒成分的PRRs核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白。蛋白。一、研究背景一、研究背景2.NOD蛋白的組成和結(jié)構(gòu)蛋白的組成和結(jié)構(gòu) 通過對人類基因數(shù)據(jù)庫同源搜索，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多個成員： NOD1(CARD4)、NOD2(CARD15)、NOD3-NOD5、

3、NALP1-14 、IPAF、CIITA、NAIP等。 NOD 蛋白主要由三個不同的結(jié)構(gòu)域組成：（1）LRR：是富含亮氨酸的重復(fù)序列，位于C端（2）NACHT：位于中央，對于NOD蛋白的寡聚體化和活化非常重要。（3）效應(yīng)結(jié)構(gòu)域：位于N端，可以是1個PYD，1個或2個CARD ，或者是3個BIR。一、研究背景一、研究背景NOD家族的結(jié)構(gòu)示意圖家族的結(jié)構(gòu)示意圖NALP1NALP2-14NOD1NOD2CARDPYDNACHTNADLRRBIRADFIINDCIITAIPAFNAIPNOD3NOD4XNOD5一、研究背景一、研究背景3.NOD的識別作用的識別作用 已有研究表明，NOD1和NOD2是細(xì)

4、胞內(nèi)細(xì)菌肽聚糖的感受器，能識別細(xì)菌肽聚糖(PGN) 的降解產(chǎn)物。NOD1 識別的最小結(jié)構(gòu)是革蘭氏陰性細(xì)菌的產(chǎn)物內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid , meso-DAP) ；NOD2 識別細(xì)菌的最基本結(jié)構(gòu)是PGN 的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）。MDP 幾乎存在于所有細(xì)菌的PGN 中，因此，NOD2 既是G+細(xì)菌也是G-細(xì)菌的感受器。 一、研究背景一、研究背景 4.NOD 蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 在非活化狀態(tài)，NOD1、NOD2 的LRR 和NACHT結(jié)合保持分子處于折疊狀態(tài)。當(dāng)NOD1 和NOD2通過LRR 和配體結(jié)合后可以打

5、開，通過NACHT自身寡聚，NOD分子的CARD 和下游RICK分子的CARD 結(jié)構(gòu)域發(fā)生嗜同種結(jié)合，活化RICK。經(jīng)過復(fù)雜的磷酸化，活化NF- B，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄以及抗菌肽的合成。 一、研究背景一、研究背景NODs介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路圖介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路圖 5.NOD蛋白的生物學(xué)功能蛋白的生物學(xué)功能 NOD蛋白主要的生物學(xué)功能是加強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)探測微生物感染的能力，產(chǎn)生IL-1等促炎因子，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。近來的研究發(fā)現(xiàn)NOD蛋白除了識別細(xì)菌產(chǎn)物外，還可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、直接參與細(xì)菌感染的控制?，F(xiàn)在也有最新報道，證明NOD蛋白也在抗病毒免疫中起著重要作用。一、研究背景一、研究背景6

6、.選題的目的與意義選題的目的與意義 盡管對哺乳動物胞內(nèi)模式識別受體在參與對細(xì)菌的識別、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用等方面進(jìn)行了深入的研究，但國內(nèi)外對魚類NOD基因的研究僅有2篇報道。迄今為止，對魚類NOD基因的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的特征以及是否具有類似于哺乳動物的功能還是不清楚的。本論文擬通過對草魚NOD1和NOD2基因的克隆以及表達(dá)分析，旨在揭示魚類NOD基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)特征。同時該研究為進(jìn)一步研究NODs基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 一、研究背景一、研究背景二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析1. gcNODs基因的分子特點基因的分子特點1.1 gcNOD1: cDNA包含3215

7、bp，ORF區(qū)域為2813bp，大約編碼937個氨基酸, 5-UTR為350bp， 3-UTR為52bp 。 C端的LRR結(jié)構(gòu)域，位置在769-791、825-851；N端有一個CARD，結(jié)構(gòu)域在11-73； NOD1的NACHT結(jié)構(gòu)域在186-359。1.2 gcNOD2: cDNA全長3130bp，編碼982個氨基酸； ORF為2949bp，編碼982氨基酸，5-UTR為81bp， 3-UTR為103bp， C端LRR有7個串聯(lián)結(jié)構(gòu)域；N端有兩個CARD，結(jié)構(gòu)域在27-81、111-200；中間NACHT結(jié)構(gòu)域在271-441。二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析二

8、、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析草魚NOD1草魚NOD2草魚NODs基因的結(jié)構(gòu)示意圖NACHTCARDLeucine Rich Repeat二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析2. gcNODs基因的基因組結(jié)構(gòu)基因的基因組結(jié)構(gòu)97496817152324131 99 96 4718955241751804848484 84 84 8484124grass carp NOD1173561127176584 848484 8484319266147 108 87 89 190 90511grass carp NOD2草魚NOD1基因組全長9kb,由

9、11個外顯子和10個內(nèi)含子組成草魚NOD2基因組全長5kb,由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析3. gcNODs基因的內(nèi)含子相位基因的內(nèi)含子相位12345678910gcNOD10122222222zfNOD10122222222hNOD10122222222gcNOD2012222222zfNOD2012222222hNOD2012222222表1.草魚、斑馬魚以及人NODs基因內(nèi)含子相位二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析4. gcNODs基因與其他物種基因與其他物種NODs基因的氨基酸相同基因的氨基酸相同/相

10、相似性比較似性比較Full-length CARDsNACHTLRRszebrafish NOD181.3/86.773.1/75.692.5/95.488.2/94.9human NOD150.2/70.938.4/54.758.0/73.057.9/78.5pig NOD151.1/71.534.9/52.358.6/74.757.9/76.9mouse NOD150.4/70.939.5/52.358.0/76.454.9/74.4Full-length CARDsNACHTLRRszebrafish NOD283.8/92.068.5/77.690.1/95.982.8/91.8hum

11、an NOD245.6/62.629.6/46.557.3/73.154.1/67.8pig NOD246.8/65.227.6/47.456.7/73.752.6/69.3mouse NOD247.0/64.728.5/48.459.6/74.353.0/67.0二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析 human NOD1 pig NOD1 mouse NOD1 chicken NOD1 zebra finch NOD1 frog NOD1 grass carp NOD1 zebrafish NOD1 fugu NOD1 stickleback NOD1 medaka

12、NOD1 fugu NOD2 stickleback NOD2 medaka NOD2 grass crap NOD2 zebrafish NOD2 mouse NOD2 human NOD2 chimpanzee NOD2 pig NOD2 cattle NOD2 mouse CARD12 monkey CARD12 human CARD12 chimpanzee CARD127910010010010010096100100100771001001006110089991001001001000.25. gcNODs基因的分子進(jìn)化樹基因的分子進(jìn)化樹二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基

13、因的克隆與表達(dá)分析6. gcNODs基因在不同組織中的組成性表達(dá)基因在不同組織中的組成性表達(dá)二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析7. gcNODs基因在肽聚糖刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)基因在肽聚糖刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)*二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析*8. gcNODs基因在基因在脂多糖脂多糖刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)*二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析*9. gcNODs基因在基因在Poly I:C刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)*二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析10. gcNODs

14、基因在基因在呼腸孤病毒呼腸孤病毒感染感染下的誘導(dǎo)型表達(dá)下的誘導(dǎo)型表達(dá)*二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析11. gcNOD1基因重組蛋白的表達(dá)與純化基因重組蛋白的表達(dá)與純化97.466.243.031.020.114.4二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析11. gcNOD1基因重組蛋白的表達(dá)與純化基因重組蛋白的表達(dá)與純化M 1 2 3 4 5 6 7 897.466.243.031.020.1二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析12. gcNOD1蛋白的免疫組化蛋白的免疫組化ABCDEF二、二、gcNODs基因的克隆與

15、表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析13.13.小結(jié)小結(jié)（1）首次從魚類中克隆了NOD1和NOD2基因，氨基酸的排列、基因組結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子相位的分析都顯示了NOD1和NOD2在進(jìn)化上具有很強(qiáng)的保守性；（2）熒光定量分析顯示草魚的NOD1和NOD2基因呈廣泛的組成性表達(dá)分布，在所檢測的組織中都可以檢測到表達(dá)；二、二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析（3）來自革蘭氏陽性菌的PGN對草魚NOD1的表達(dá)在大多數(shù)組織中沒有顯著的作用；（4）在LPS刺激下，gcNOD1的誘導(dǎo)表達(dá)特征與gcNOD2相似；（5）polyI:C和病毒感染也能誘導(dǎo)gcNOD1和gcNOD2的表達(dá)。三、三、gc IFN

16、-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析1. gcIFN-rel基因的分子特點基因的分子特點 IFN-rel基因的cDNA包含861bp， 其中5- UTR長39 bp，ORF長504bp編碼167個氨基酸，3- UTR長316bp。 3- UTR富含AT（75.2%），一個潛在的多腺苷酸加尾信號（AATAAA)位于polyA尾上游13bp。三、三、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析AAATTCGCTTGGTTCACAGCACCAAAACACAAACACAAAGAATGGATTCTTGGCTCAACA M D S W L NTGATGCTGCTGTGTGGAC

17、TTCTGTTAATAGCATCTCTTCAGACAACCAACGCTTTCAGATM M L L C G L L L I A S L Q T T N A F R TTCGACGGTCCAAAAGCGAGATGACCCATTTGGAGACAAATATCCACTCTCTGCAAGAACF R R S K S E M T H L E T N I H S L Q EATTATgtaagtgatgtctactatcatgaacttcagcagggggtttgaaagcaactcttgtH Y ctgtgttaacaagatgaatcacttcaagtcctactcatatctgtatgttatagtt

18、tggtcttgcggctaatattagcaagaagagacctattgcacaataaatttcacgaaactttgttcttagattaggagttaagattcaccagagatgcacattcattcataacgtttgctgttttttgcccgctttctttagAAAACACGTGGCACAGAATGGGTTTCAAAGTCTGTTTTTGTTCC K T R G T E W V S K S V F V PTCATCTGAACCAGCTGAATgtaagtttttactgtgcaaaatgctaaaatattaaaatgca H L N Q L N actgaatgatat

19、atatgcctctatatatgtatcatgctaataatacttgtttctcttagTCCAAGGCTTCCTGCACTTGTCAGGCGCTGTTGCTTGAAAGAATGCTGAACATCTACGAAGS K A S C T C Q A L L L E R M L N I Y E AACTTTTCCAAGACATGAAGTCTGAGCATAAAGAAGGGAGAAAAGATCTAGACCATCTAAE L F Q D M K S E H K E G R K D L D H L TGGATGAGGTGAAAAAGCTGAGGGGAAATTATAAGGAAGAACATAAAGTATG

20、GAAAGAGCM D E V K K L R G N Y K E E H K V W K ETTCAGGAAATGAACTCAGTCAAGgtaaacattaagagaaagtcctgtcttcattgtgaatL Q E M N S V K gtgtacattttgagttattgaattgctgtttatcatatgatatcaggtcaggtgatataatatatgatatggtactgtatctaatacaaatatttgtcctcactctcacaagGTGAAAAA V KTGGAACAATCCGAGGAGGAGCATTAAATGACTTTCTCATGGTGTTTGATCGGG

21、CCTCTACN G T I R G G A L N D F L M V F D R A S AGAAAAACACAAAAAGGTTCAATGAGAAGATCCAAAAGTCATGTCTTTCATTTAGTAAACT E K H K K V Q *TTGCGCTTTGTTATTGTGTTAGCCTATTTATTTATAAATTATATGGAAATAATTATTTATTTTTAACTTTATAATGTACTCTACTACACCATCCATAACTTATAATCTAACTTATTCTCATCACAAGTGTGTTTGCATCATTTACAGTGTACAGAAACGATGAACGTTGATTTCTA

22、ACTGGATTTGCTTGAAATATTCTGTGAGCTTCACTGGCTAAATGTTTAATTACAATAAATTAATTTTGCATTAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA 草魚-干擾素相關(guān)基因的cDNA與基因組序列三、三、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析2. gcgcIFNIFN- -relrel基基因與其他物種因與其他物種- -干擾素與干擾素與- -干擾干擾素相關(guān)基因同源素相關(guān)基因同源性比較性比較SpeciesAmino acid identity/similarity (%)Catfish IFN-rel37.8/63.2

23、Zebrafish IFN-rel62.9/77.6Carp IFN-rel50.0/71.9Zebrafish IFN-19.8/44.3Goldfish IFN-21.7/44Cod IFN-20.6/44.3Catfish IFN-21.8/48.3Carp IFN-20.7/41.4Fugu IFN-17.7/40.7Trout IFN-119.4/48.9Trout IFN-221.5/50.6Salmon IFN-21.9/52.8三、三、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析3. gcgcIFNIFN- -relrel基因與其他基因與其他硬骨魚類硬骨魚類-

24、-干擾素干擾素與與- -干擾素相關(guān)基因干擾素相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系三、三、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析4. gcgcIFNIFN- -relrel基因的組織表達(dá)基因的組織表達(dá)三、三、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析5. gcgcIFNIFN- -relrel基因在脂多糖和基因在脂多糖和PolyI:C刺激下的刺激下的誘導(dǎo)性表達(dá)誘導(dǎo)性表達(dá)*LPS*polyI:C三、三、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析6. PGN的刺激對草魚的刺激對草魚IFN-rel、NOD1和和NOD2表達(dá)的影響表達(dá)的影響三、三

25、、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析7. gcIFN-rel基因基因在在呼腸孤病毒呼腸孤病毒感染感染下的誘導(dǎo)下的誘導(dǎo)型表達(dá)型表達(dá)*三、三、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析8.8.小結(jié)小結(jié)(1)序列分析顯示本研究所克隆的gcIFN-rel基因是一個 與斑馬魚、鯰魚和鯉魚中IFN-rel基因同源的基因，而不是那個早已存在的IFN-基因；(2)與哺乳類和鮭鱒的IFN-不同的是，從20條不同來源的草魚的序列分析顯示，gcIFN-rel在它的內(nèi)含子中缺乏多態(tài)性微衛(wèi)星序列；三、三、gc IFN-rel基因的克隆與表達(dá)分析基因的克隆與表達(dá)分析(3) gc

26、IFN-rel呈廣泛的組成性表達(dá)；(4)聚肌胞甘酸(polyI:C)，一種模擬病毒雙鏈RNA而合成的dsRNA，能上調(diào)gcIFN-rel基因的表達(dá);(5)在所分析的四個組織中， gcIFN-rel 的表達(dá)規(guī)律與gcNOD2相一致；推測IFN-和IFN-rel被細(xì)菌的產(chǎn)物PGN所激活可能是通過NOD2依賴的方式。四、創(chuàng)新點及下步研究計劃四、創(chuàng)新點及下步研究計劃1.主要創(chuàng)新點 （1） 首次從草魚中克隆了胞內(nèi)識別細(xì)菌的模式識別受體NOD1和NOD2基因的cDNA全長和基因組全長；（2） 對草魚胞內(nèi)模式識別受體NOD1和NOD2從mRNA水平、蛋白水平及細(xì)胞水平進(jìn)行了表達(dá)或定位分析；同時，首次研究了病毒的感染對細(xì)菌模式識別受體NOD1和NOD2基因表達(dá)的影響；（3） 克隆了草魚IFN-相關(guān)基因的cDNA全長和基因組全長，并對該基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究；首次提出了草魚IFN-相關(guān)基因與NOD樣模式識別受體在發(fā)揮功能上存在相關(guān)性。2.下步研究