微生物限度方法適應(yīng)性試驗方案

1、XXXXXXXXXXX有限公司膠囊用明膠微生物限度檢查方法適用性試驗方案 文件編號：YZF-QC-001-01起草人： （QC） 年 月 日審核人： （QA） 年 月 日批準(zhǔn)人： （質(zhì)量負責(zé)人） 年 月 日目 錄.驗證目的.驗證原理.驗證人員.相關(guān)文件.驗證內(nèi)容.驗證周期7.驗證綜合結(jié)論1. 驗證目的 建立微生物限度檢查方法適用性試驗驗證，通過驗證確認(rèn)檢測所采用的方法適合于本公司所用原料膠囊用明膠的微生物限度的測定。2. 驗證原理 通過試驗數(shù)據(jù)結(jié)果，比較實驗組中試驗菌的恢復(fù)生長結(jié)果來評價整個驗證方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。3. 驗證人員職位姓名負責(zé)內(nèi)容QC檢驗員負責(zé)驗證方案的起草和實施，并對

2、所測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負責(zé)。QC負責(zé)人負責(zé)驗證方案的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標(biāo)準(zhǔn)檢驗操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)行，負責(zé)組織實施。QA負責(zé)人負責(zé)驗證實施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。審核人負責(zé)驗證方案及報告的審核和批準(zhǔn)。4. 相關(guān)文件 中國藥典2015版四部通則1105、通則11065. 驗證內(nèi)容 通過驗證以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定；確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，就按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再

3、進行驗證，直至驗證結(jié)果符合設(shè)立的驗證標(biāo)準(zhǔn)。5.1微生物計數(shù)法驗證 當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查時，應(yīng)進行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。驗證試驗可與供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)同時進行。5.1.1驗證用菌種 枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501（第一代） 金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003（第一代） 銅綠假單胞菌CMCC（B）44102（第一代） 白色念珠菌CMCC（F）98001（第一代） 黑曲霉CMCC（F）98003（第一代）5.1.2驗證依據(jù)：中國藥典2015版四部5.1.3驗證步驟5.1.3.1

4、菌液制備5.1.3.1.1分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)3035培養(yǎng)1824小時后，分別取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物0.9%無菌氯化鈉溶液1ml+9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-610-7，細菌數(shù)為不大于100cuf/ml，做活菌計數(shù)備用。5.1.3.1.2接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)2025培養(yǎng)2到3天后，取12環(huán)白色念珠菌斜面培養(yǎng)物加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-410-7，菌液為不大于100 cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。5.1.3.1.

5、3接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)2025培養(yǎng)57天后，取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液1ml+9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-4，菌液為不大于100cuf/ml，做活菌計數(shù)備用。5.1.3.2 陰性對照 為確認(rèn)試驗條件是否符合要求，應(yīng)進行陰性對照試驗。5.1.3.3 計數(shù)方法適用性試驗 5.1.3.3.1供試液制備 取供試品10g，加45 PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖，放置45水浴保溫使其完全溶解，搖勻，作為1:10供試液，備用。 5.1.3.3.2

6、試驗組： 取1:10的供試液加入試驗菌，使1ml供試液中含菌量不大于100cfu。注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 5.1.3.3.3菌液組： 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液同試驗組操作。測定所加的試驗菌數(shù)。 5.1.3.3.4供試品對照組：取制備好的供試液。以稀釋液替代菌液同試驗組操作。按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。 5.1.3.3.4陰性對照組： 取0.9%無菌氯化鈉溶液，空白對照。5.1.4結(jié)果至少應(yīng)進行3次獨立試驗。若試驗組的菌回收率均0.52，則照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)；若任一次

7、試驗中試驗組的菌回收率不在范圍內(nèi)，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率在規(guī)定范圍內(nèi)。5.1.4.1試驗組的菌回收率=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌數(shù)組平均菌落數(shù)5.1.4.2連續(xù)3批驗證的菌落計數(shù)結(jié)果 5.1.4.2.1規(guī)格：0#藍白 批號：201412001 驗證試驗結(jié)果（常規(guī)法） 單位（cuf/ml）技術(shù)方法試驗菌株菌濃度（ml）試驗次數(shù)菌液組供試品對照組實驗組回收率實際回收率理論需氧菌總數(shù)計數(shù)大腸埃希菌10-610.5210-620.5210-630.52金黃

8、色葡萄球菌10-610.5210-620.5210-630.52枯草芽孢桿菌10-610.5210-620.5210-630.52白色念珠菌10-510.5210-520.5210-530.52黑曲霉10-510.5210-520.5210-530.52霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)白色念珠菌10-510.5210-520.5210-530.52黑曲霉10-510.5210-520.5210-530.52 檢驗人： 復(fù)核人： 日期： 年 月 日 5.1.4.2.2規(guī)格：0#藍白 批號：201412001 驗證試驗結(jié)果（常規(guī)法） 單位（cuf/ml）技術(shù)方法試驗菌株菌濃度（ml）試驗次數(shù)菌液組供試品對照組

9、實驗組回收率實際回收率理論需氧菌總數(shù)計數(shù)大腸埃希菌10-610.5210-620.5210-630.52金黃色葡萄球菌10-610.5210-620.5210-630.52枯草芽孢桿菌10-610.5210-620.5210-630.52白色念珠菌10-510.5210-520.5210-530.52黑曲霉10-510.5210-520.5210-530.52霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)白色念珠菌10-510.5210-520.5210-530.52黑曲霉10-510.5210-520.5210-530.52 檢驗人： 復(fù)核人： 日期： 年 月 日 5.1.4.2.3規(guī)格：0#藍白 批號：201412

10、001 驗證試驗結(jié)果（常規(guī)法） 單位（cuf/ml）技術(shù)方法試驗菌株菌濃度（ml）試驗次數(shù)菌液組供試品對照組實驗組回收率實際回收率理論需氧菌總數(shù)計數(shù)大腸埃希菌10-610.5210-620.5210-630.52金黃色葡萄球菌10-610.5210-620.5210-630.52枯草芽孢桿菌10-610.5210-620.5210-630.52白色念珠菌10-510.5210-520.5210-530.52黑曲霉10-510.5210-520.5210-530.52霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)白色念珠菌10-510.5210-520.5210-530.52黑曲霉10-510.5210-520.5210

11、-530.52 檢驗人： 復(fù)核人： 日期： 年 月 日 5.1.5 結(jié)論 5.2控制菌檢查法的驗證 當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查時，應(yīng)進行控制菌檢查法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的的控制菌檢查方法測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢驗方法應(yīng)進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。5.2.1驗證用菌種 大腸埃希菌CMCC（B）44102（第一代） 乙型付傷寒沙門菌CMCC（B）50094（第一代）5.2.2驗證依據(jù)：中國藥典2015年版四部5.2.3 大腸埃希菌、沙門菌檢查法 5.2.3.1菌液制備 分別接種大腸埃希菌、乙型付傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物

12、至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)3035培養(yǎng)1824小時后，分別取大腸埃希菌、乙型付傷寒沙門菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-610-7，細菌數(shù)為10100cuf/ml，做活菌計數(shù)備用。 5.2.3.2 陰性對照 為確認(rèn)試驗條件是否符合要求，應(yīng)進行陰性對照試驗。5.2.3.3 控制菌檢查方法適用性試驗5.2.3.3.1 供試液制備：同需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法驗證。5.2.3.2.2大腸埃希菌5.2.3.2.2.1試驗組 取供試品10ml及不大于100cuf/ml大腸埃希菌接種至100ml的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)大腸埃希菌檢查法進行檢查。5.2.3.2

13、.2.2 陰性對照組 取PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml加至100ml的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)大腸埃希菌檢查法進行檢查。5.2.3.2.2.3陽性對照組 取不大于100cuf/ml大腸埃希菌1ml接種至100ml的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)大腸埃希菌檢查法進行檢查。5.2.3.2.3沙門氏菌5.2.3.2.3.1試驗組 取供試品10g及不大于100cuf/ml乙型副傷寒沙門菌接種至200ml的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)沙門菌檢查法進行檢查。5.2.3.2.3.3陰性對照組 取PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml加至200ml的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)沙門氏菌檢查法進行檢查。5.2.3.2.3.4陽性對照組 取不大于cuf/m乙型副傷寒沙門菌1ml接種至200ml的增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)沙門菌檢查法進行檢查。5.2.3.2.4 結(jié)果 至少應(yīng)進行3次獨立試驗。陽性對照組應(yīng)檢出試驗菌，陰性對照組應(yīng)無菌生長。若試驗組檢出試驗菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。5.2.3.2.4.1驗證連續(xù)三批的觀察結(jié)果 5.2.3.2.4.1.1大腸埃希菌驗證試驗結(jié)果供試品規(guī)格批號項目試驗組陰性