紙層析法分離氨基酸試驗(yàn)報(bào)告

1、紙層析法分離氨基酸一、前言紙層析法紙層析法又稱紙色譜法， 是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)。 本世 紀(jì)初俄國植物學(xué)家 M.Tswett 發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子 中不僅有葉綠素還含有其它色素。 現(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、 分子 生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。 它是一種以紙為載 體的色譜法。 固定相一般為紙纖維上吸附的水分， 流動(dòng)相為不與水相 溶的有機(jī)溶劑；也可使紙吸留其他物質(zhì)作為固定相，如緩沖液，甲酰 胺等。將試樣點(diǎn)在紙條的一端， 然后在密閉的槽中用適宜溶劑進(jìn)行展 開。當(dāng)組分移動(dòng)一定距離后，各組分移動(dòng)距離不同，最后形成互相分 離的斑點(diǎn)。將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他

2、適宜方法確定 斑點(diǎn)位置。根據(jù)組分移動(dòng)距離 （Rf 值） 與已知樣比較，進(jìn)行定性。用 斑點(diǎn)掃描儀或?qū)⒔M分點(diǎn)取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量 （ 如 光度法、比色法等 ） 。紙層析法 （paper chromatography） 是生物化學(xué)上分離、鑒定氨 基酸混合物的常用技術(shù)， 可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定 量測(cè)定; 也是定性或定量測(cè)定多肽、核酸堿基、糖、有機(jī)酸、維生素、 抗菌素等物質(zhì)的一種分離分析工具。 紙層析法是用濾紙作為惰性支持 物的分配層析法， 其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相， 展層用的有 機(jī)溶溶劑是流動(dòng)相。在環(huán)境分析測(cè)試中， 有時(shí)用紙層析法分離試樣組分， 它用于一些 精度

3、不高的分析，如3, 4-苯并芘。但不如GC HPLQ應(yīng)用普遍。做葉綠體色素分離時(shí)用到 , 將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體 與層析液 （石油醚）混合，將濾紙一段進(jìn)入混合液體， 四種色素在層析 液中的溶解度不同， 在濾紙上留下 4條色素帶。 由此觀查出各種色素 的相對(duì)含量和種類。紙層析法一般用于葉綠體中色素的分離， 葉綠體中色素主要包括 胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b,它們?cè)趯游鲆褐械娜芙舛?不同，溶解度大的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散地快，反之則慢 ; 含量較多 者色素帶也較寬。 最后在濾紙上留下 4條色素帶, 所以利用紙層析法 能清楚地將葉綠體中的色素分離。氨基酸 氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位

4、,廣泛用于食品、醫(yī)藥、添加劑 及化妝品行業(yè)。隨著生物工程技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展逐漸成為 2l 世紀(jì)全球 的主要產(chǎn)業(yè)之一,氨基酸的需求量越來越大,品種變更越來越快,工 藝改革越來越新。 目前全世界氨基酸每年的產(chǎn)量為 100 萬噸,而需求 總量是 800萬噸。我國自 20世紀(jì) 60年代起, 氨基酸的應(yīng)用在食品工 業(yè)占 61, ,在飲料工業(yè)占 30, ,醫(yī)藥、日用化工、農(nóng)業(yè)、冶金、環(huán)保、 輕工、生物工程技術(shù)等方面占用的比例逐年增加。氨基酸在人類生活的很多方面都有著應(yīng)用 :（ 1）在食品行業(yè)的應(yīng)用（2）在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用3）在飼料添加劑行業(yè)的應(yīng)用（4）在化妝品行業(yè)的應(yīng)用（ 5）在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用（6）在其他行業(yè)的應(yīng)

5、用氨基酸工業(yè)還有著廣闊的發(fā)展前景 :（ 1）傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)方法（ 2）運(yùn)用基因工程手段生產(chǎn)氨基酸（ 3）大力發(fā)展藥用中間體 , 具體為: 氨基酸及其衍生物逐漸成為藥用中間體 非天然氨基酸是合成活性藥物的重要原料 生產(chǎn)高附加值的非天然氨基酸二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握分配層析的原理， 學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù) （ 包括 點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量 ） 。2. 學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分 （水解、層析及鑒定 ） 分析的方法。三、實(shí)驗(yàn)原理1. 紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。 濾紙纖維上的羥基 具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相 流經(jīng)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分

6、配而得到分離。2. 溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用比移值 Rf 值表示：3. Rf= 原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離 /原點(diǎn)到溶劑前沿的距離4. 在一定的條件下某種物質(zhì)的 Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān) 本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。四、實(shí)驗(yàn)試劑和器材實(shí)驗(yàn)試劑：1. 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。2.80%甲酸3.0.1%茚三酮丙酮溶液4. 氨基酸混合液（每種氨基酸500mg/mL）5. 正丁醇實(shí)驗(yàn)器材：1. 新華濾紙2. 培養(yǎng)皿3. 電熱鼓風(fēng)干燥箱4. 吹風(fēng)機(jī)5. 毛細(xì)管6. 針、線、尺。7. 鐘罩（高約430mm直

7、徑約290mm具磨口塞）五、操作步驟標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析單向上行層析氨基酸 Rf 值的測(cè)定1. 濾紙：選用國產(chǎn)新華1號(hào)濾紙，6cm x 7cm在距濾紙2cm處劃線，用鉛筆在線上標(biāo)上四個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣位子（留出縫線空間）。2. 點(diǎn)樣：點(diǎn)樣要合適， 樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長，以致分離不 清； 用毛細(xì)管吸取氨基酸樣品， 與濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣處的 中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出； 點(diǎn)樣的擴(kuò)散直徑控制在 0.5cm 之內(nèi)，點(diǎn)樣過程中必須在第一滴 樣品干后再點(diǎn)第二滴，為使樣品加速干燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，但要注 意溫度不可過高，以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果； 將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意

8、縫線處紙的兩邊不要接觸。 避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動(dòng)特別快 而造成溶劑前沿不齊，影響 Rf 值。3. 將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi) （ 注意濾紙不要碰皿壁 ）， 當(dāng)溶劑展層至距離紙的上沿約1cm時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆標(biāo)出溶 劑前沿位置。4. 顯色：待展層基本結(jié)束后，置65C鼓風(fēng)箱中10-20min，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點(diǎn)。5. Rf值的計(jì)算：用尺測(cè)量顯色斑點(diǎn)的中心與原點(diǎn)（點(diǎn)樣中心）之 間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離， 求出此值，即得氨基酸的Rf值. 計(jì)算出3種氨基酸在酸系統(tǒng)中的Rf值，判斷待測(cè)樣組成。酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2（體積比），茚三酮

9、 2ml。溫度25C，時(shí)間1h。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果亮氨酸甘氨酸脯氨酸待測(cè)氨基酸原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離6.052.903.492.613.746.47原點(diǎn)到溶劑前沿的距離7.247.247.247.24Rf0.840.400.480.360.520.89判斷待測(cè)氨基酸亮氨酸甘氨酸脯氨酸甘氨酸脯氨酸亮氨酸理論Rf0.790.300.48七、注意事項(xiàng)1點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴；2. 為使樣品加速干燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，但要注意溫度不可過高， 以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果；3將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi)時(shí)，注意濾紙不要碰皿壁；4.使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻；5點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太

10、濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長，以致分離不 清；6. 使用茚三酮顯色法，必須在整個(gè)層析操作中避免手直接接觸層 析紙，因?yàn)槭稚铣３Ｓ猩倭亢镔|(zhì)。顯色時(shí)它也呈現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。污 染了層析結(jié)果，因此操作時(shí)應(yīng)戴橡皮手套或指套。同時(shí)也要防止空氣 中的氨；7. 展層展開時(shí)切勿是樣品點(diǎn)浸入溶劑中。八、思考題1. 為什么在展層時(shí)有時(shí)用一種溶劑系統(tǒng)，而有時(shí)用兩種溶劑系 統(tǒng)？答：這是根據(jù)Nernst在1891年提出的分配定律：一種溶質(zhì)在兩 種給定的互不相溶的溶劑中分配時(shí)， 在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì) 在兩相中的濃度比為一常數(shù)，即分配系數(shù) （Kd）。Kd二Ca/Cb Ca和Cb 是互不相溶的兩相，即A相和B相的濃度。這里的兩

11、相可以使固相、液相和氣相。意思就是溶質(zhì)在A和B兩種溶劑組成的混合溶劑里分配時(shí)，分配比是恒定的。2. 酸性溶劑系統(tǒng) （ 或堿性溶劑系統(tǒng) ）對(duì)氨基酸極性基團(tuán)的解離有 何影響?答：酸性溶液中，有利于氨基酸的堿式電離，氨基結(jié)合質(zhì)子，整 個(gè)分子帶正電荷；反之，堿性溶液中有利于羧基的酸式電離，氨基酸 分子整體帶負(fù)電荷。3. 酸性溶劑系統(tǒng) （或堿性溶劑系統(tǒng) ）對(duì)堿性氨基酸 （賴、精、組 ） 和酸性氨基酸（天冬、谷）的Rf值有什么影響？答：酸性溶劑系統(tǒng)對(duì)堿性氨基酸的溶解性加強(qiáng)， 在層析過程中易 溶于 流動(dòng)相。所以跑得比較快，因此 Rf 值增大。反之，堿性性溶 劑系統(tǒng)中酸性氨基酸 Rf 值增大。4. 什么是分配

12、系數(shù)？答：分配系數(shù)是指一定溫度下，處于平衡狀態(tài)時(shí)，組分在固定相 中的濃度和在流動(dòng)相中的濃度之比，以 K表示。九、討論經(jīng)過本次利用紙層析法分離氨基酸實(shí)驗(yàn)， 使我較為熟練的掌握了 利用紙層析法分離氨基酸的具體流程及方法，并且了解了其工作原 理，這對(duì)于以后的學(xué)習(xí)是有很大幫助的。經(jīng)查閱資料得，亮氨酸的理 論 Rf 值為 0.79 （酸相），脯氨酸的理論 Rf 值為 0.48 （酸相），甘 氨酸的理論 Rf 值為 0.30 （酸相）。通過比對(duì)濾紙上單一氨基酸層析位置、計(jì)算出其實(shí)驗(yàn) Rf 值并查 閱資料得知， 濾紙上待測(cè)氨基酸的種類及具體位置， 較為粗略地分離 了亮氨酸、脯氨酸及甘氨酸這三種氨基酸?？傮w來講，本次試驗(yàn)三種氨基酸實(shí)驗(yàn) Rf 值偏小，。經(jīng)過分析后， 得出幾點(diǎn)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，如下：1. 點(diǎn)樣過程中未在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴；2. 雖用玻璃罩將濾紙罩住，但還是會(huì)有些許空氣中的氨在其中， 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；3. 將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi)時(shí)，濾紙不小心觸碰到皿 壁，出現(xiàn)虹吸現(xiàn)象；4. 使用新鮮配制的溶劑系統(tǒng)時(shí)，并未完全搖勻；5. 使用茚三酮顯色法， 必須在整個(gè)層析操作中避免手直接接觸層 析紙，因?yàn)槭?/p>