(完整版)SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)(原版)

1、 sds- sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳sds-polyacrylamide gel electrophoresis sds-page食品科學(xué)食品科學(xué) 王玲華王玲華一、什么是一、什么是sdssds十二烷基硫酸鈉一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體和分子團(tuán)的混合形式存在。sdssds的作用的作用 破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)解聚而改變?cè)械臉?gòu)象，保證解聚后的蛋白質(zhì)分子與sds充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-sds復(fù)合物。二、二、sds-pagesds-page的基本原理的基本原理（一）蛋白質(zhì)分子的解聚（一）蛋白質(zhì)分子的解聚 樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入

2、陰離子去污劑樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入陰離子去污劑sdssds和強(qiáng)還和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)分子解聚，與原劑后，蛋白質(zhì)分子解聚，與sdssds結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)白質(zhì)-sds-sds復(fù)合物，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于復(fù)合物，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞亞基分子量的大小基分子量的大小，而蛋白質(zhì)原有電荷因素可以被忽略。，而蛋白質(zhì)原有電荷因素可以被忽略。1 1、sdssds 陰離子去污劑陰離子去污劑 變性劑變性劑 助溶性試劑助溶性試劑 斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵 分子去折疊分子去折疊 破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)2

3、 2、強(qiáng)還原劑、強(qiáng)還原劑 巰基乙醇（巰基乙醇（-mercaptoethanal-mercaptoethanal） 二硫蘇糖醇（二硫蘇糖醇（dithiothreitoldithiothreitol，dttdtt） 使半胱氨酸殘基之間的使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵二硫鍵斷裂。斷裂。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)- -sdssds復(fù)合物的特點(diǎn)復(fù)合物的特點(diǎn)：（1 1）形狀像一個(gè)長橢圓棒。）形狀像一個(gè)長橢圓棒。（2 2）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基- -sdssds膠束基本上是相膠束基本上是相同的。同的。（3 3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。（4 4）所帶

4、的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有電荷，）所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有電荷，消除了蛋白質(zhì)分子間原有電荷差異。消除了蛋白質(zhì)分子間原有電荷差異。 復(fù)合物在復(fù)合物在sds-pagesds-page系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的取決于橢圓棒的長軸長度長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在1515kdkd200kd200kd之間時(shí)，之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系3 3、影響、影響sdssds電泳的關(guān)鍵因

5、素電泳的關(guān)鍵因素（1 1） 溶液中溶液中sdssds單體濃度（單體濃度（1mmol/l)1mmol/l) 大多數(shù)蛋白質(zhì)與大多數(shù)蛋白質(zhì)與sdssds結(jié)合的重量比為結(jié)合的重量比為1 1：1.41.4（2 2） 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度（不樣品緩沖液的離子強(qiáng)度（不0.26)0.26) 低離子強(qiáng)度低離子強(qiáng)度的溶液中，的溶液中，sdssds單體才具有較高的平單體才具有較高的平衡濃度。衡濃度。（3 3） 二硫鍵是否完全被還原二硫鍵是否完全被還原 當(dāng)二硫鍵被當(dāng)二硫鍵被徹底還原徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚被解聚，sdssds才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移率和才能定量地結(jié)合到亞基上而給出

6、相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。（二）緩沖系統(tǒng)的選擇（二）緩沖系統(tǒng)的選擇 一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的phph范圍，范圍，凡凡不與不與sdssds發(fā)生相互作用發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵沖液的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。的。電泳緩沖液的種類：電泳緩沖液的種類：1 1、磷酸緩沖液、磷酸緩沖液2 2、tris-tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng)醋酸鈉緩沖系統(tǒng)3 3、咪唑緩沖液系統(tǒng)：、咪唑緩沖液系統(tǒng)： 比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低，電泳速比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電

7、性低，電泳速 度要比后者快一倍。度要比后者快一倍。4 4、尿素系統(tǒng)：、尿素系統(tǒng)： 適用分子量低于適用分子量低于1515kdkd的蛋白樣品。的蛋白樣品。5 5、tris-tris-甘氨酸甘氨酸系統(tǒng)：系統(tǒng)： 使用最多的緩沖液使用最多的緩沖液6 6、tris-tris-硼酸鹽緩沖液：硼酸鹽緩沖液： 測(cè)定糖蛋白的分子量測(cè)定糖蛋白的分子量（三）凝膠濃度的選擇（三）凝膠濃度的選擇 由于由于sdssds電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后度，只取決于分子解聚后sds-sds-蛋白質(zhì)膠束的大小，蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會(huì)直接影響分辨率。因此凝膠濃度

8、的選擇會(huì)直接影響分辨率。 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃不同的凝膠濃度度. .凝膠濃度與被分離蛋白質(zhì)分子量大小關(guān)系如表凝膠濃度與被分離蛋白質(zhì)分子量大小關(guān)系如表1 1樣品分子量范圍分離膠濃度（%）蛋白質(zhì)10420-30（1-4）10415-204（104-105）10-15（1-5）1055-1051052-5核酸10415-20104-1055-10105-21052-2.6三、分離方法1、分類分類（1 1）根據(jù)對(duì)樣品的處理方式的不同）根據(jù)對(duì)樣品的處理方式的不同 還原還原sdssds電泳電泳 非還原非還原sdssds電泳電泳 帶有烷基化作用的還原帶有烷基化

9、作用的還原sdssds電泳電泳（2 2）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同 連續(xù)電泳連續(xù)電泳 不連續(xù)電泳不連續(xù)電泳（3 3）根據(jù)電泳的形式）根據(jù)電泳的形式 圓盤電泳圓盤電泳 垂直電泳垂直電泳 平板電泳平板電泳 水平電泳水平電泳2 2、操作要點(diǎn)、操作要點(diǎn)（1 1）制備凝膠）制備凝膠丙烯酰胺和交聯(lián)劑丙烯酰胺和交聯(lián)劑n,n-n,n-甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺（bisbis）在催化）在催化劑的作用下聚合。劑的作用下聚合。 過硫酸銨和四甲基乙二胺（化學(xué)聚合催化劑）過硫酸銨和四甲基乙二胺（化學(xué)聚合催化劑）催化劑催化劑 核黃素（光聚合的催化劑核黃素（光聚合的催化劑不連續(xù)電泳使用不

10、同孔徑的凝膠，使用不同的不連續(xù)電泳使用不同孔徑的凝膠，使用不同的phph和和緩沖液。緩沖液。不連續(xù)電泳的凝膠由上至下可分為：不連續(xù)電泳的凝膠由上至下可分為： (1) (1)樣品膠：大孔徑凝膠，在樣品膠：大孔徑凝膠，在ph6.76.8ph6.76.8的的tris-tris-hclhcl中聚合，含有樣品。中聚合，含有樣品。 （2 2）濃縮膠：除不含樣品外，其他與樣品膠相）濃縮膠：除不含樣品外，其他與樣品膠相同。同。 （3 3）分離膠：小孔徑凝膠，在）分離膠：小孔徑凝膠，在ph8.88.9ph8.88.9的的tris-tris-hclhcl中聚合中聚合. .（2 2）電極緩沖液的選擇）電極緩沖液的選

11、擇（3 3）電泳）電泳加樣后，接通電源加樣后，接通電源。開始時(shí)將電流調(diào)至開始時(shí)將電流調(diào)至10ma10ma。待樣品進(jìn)。待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電流調(diào)至入分離膠時(shí)，將電流調(diào)至202030ma30ma繼續(xù)電泳，直至溴酚繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)染料到達(dá)分離膠底部上方約藍(lán)染料到達(dá)分離膠底部上方約1cm1cm時(shí)，關(guān)閉電源。拔掉固時(shí)，關(guān)閉電源。拔掉固定板，取下玻璃板，取出膠板。定板，取下玻璃板，取出膠板。（4 4）染色和脫色）染色和脫色經(jīng)經(jīng)sdssds聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品品，浸泡在，浸泡在含0.5%0.5%氨基黑氨基黑10b10b的的7%7%醋酸染色醋酸染色體中，或浸

12、泡在含體中，或浸泡在含0.1%0.1%考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)的的12.5%-12.5%-50%50%的三氯醋酸染色液中的三氯醋酸染色液中。進(jìn)行染色和蛋白進(jìn)行染色和蛋白質(zhì)的固定。質(zhì)的固定。染色染色1 12 2小時(shí)或過夜。染色后的小時(shí)或過夜。染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。3 3、電泳過程中的不正?，F(xiàn)象、電泳過程中的不正?，F(xiàn)象（1 1）“微笑微笑”現(xiàn)象現(xiàn)象 指示劑前沿呈現(xiàn)指示劑前沿呈現(xiàn) 兩邊向上兩邊向上 的曲線形，說明凝膠的的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。中間部分冷卻不好。（2 2）“皺眉皺眉”現(xiàn)象現(xiàn)象 由于垂直電泳槽的由于垂直電泳槽的裝置不合適裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的和玻璃板組成的“三明治三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。聚合不完全。（3 3）“拖尾拖尾”現(xiàn)象現(xiàn)象 樣品溶解不佳樣品溶解不佳引起。引起。（4 4）偏斜現(xiàn)象）偏斜現(xiàn)象 電極放置不平行電極放置不平行