基因組文庫構(gòu)建

1、編輯ppt1第四章 基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫(genomic library)即基因文庫(gene bank)是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片斷的重組DNA克隆群體。構(gòu)建基因文庫時(shí)先提純生物的總DNA，通過機(jī)械剪切或酶切使其成為一定大小的片段，連接到適當(dāng)載體(常為噬菌體)上，經(jīng)體外包裝轉(zhuǎn)染細(xì)菌，得到一群含不同DNA片段的重組噬菌體顆粒。此即是基因文庫。這群DNA片段含蓋基因組全部基因。編輯ppt2 cDNA文庫(cDNA library) ： 克隆的重組cDNA的總和，通常是在細(xì)菌或酵母中。這些克隆代表從某個(gè)特定物種或器官的所有mRNA制備得到的cDNA。 cDNA分子克隆(cDNA clo

2、ne) ：將cDNA片段裝在載體上轉(zhuǎn)化細(xì)菌,擴(kuò)增出多克隆的過程，最終可建立cDNA文庫。編輯ppt3建庫的目的：1.從復(fù)雜的基因組中分離單拷貝的基因；2.是從來源復(fù)雜的總mRNA的cDNA文庫中分離稀有的cDNA克隆。建庫的關(guān)鍵：如何產(chǎn)生足夠數(shù)量的重組DNA建庫應(yīng)注意： 1.保證載體DNA和靶DNA均不被外源DNA序列污染； 2.盡可能用“ 電話克隆”。編輯ppt4 組織 載體 ( 選擇一種) mRNA DNA cDNA 部分或完全 消化的 DNA 甲基化，加接頭 的雙鏈 DNA 大小分級(jí) 可供克隆的 DNA 片段 連接 DNA 片段和載體 重組載體 DNA 導(dǎo)入 E.coli (體外包裝或轉(zhuǎn)

3、化) 基因庫的鑒定與效價(jià)測定 篩選目的基因 擴(kuò)增文庫長期保存 構(gòu)建基因組 DNA 和 cDNA 文庫的流程示意圖 編輯ppt5 第一節(jié) DNA克隆片段的產(chǎn)生與分離一.基因組DNA的片段化 1.用限制酶片段化:用限制酶消化DNA，不經(jīng)凝膠電泳分部離,直接和載體連接的克隆方法叫鳥槍法(shot-gan approach) 存在的問題： 所形成的重組體分子是一群帶有大小不同插入片段的混合群體。以每個(gè)載體可插入13kbDNA計(jì)算， 基因庫至少含1030萬個(gè)重組質(zhì)粒。從中篩出目的基因工作量是很大的。 目的基因內(nèi)部可能有一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，即一個(gè)基因分載在 幾個(gè)重組質(zhì)粒上，完整篩出更不容易。編輯ppt62

4、.隨機(jī)片段化： 超聲波：可產(chǎn)生300bp的短片段。高速攪拌：1500轉(zhuǎn)/分30分 可切 平均長度8kb的分子群體。3.雙酶消化單酶消化的產(chǎn)物一般分子較大，選擇時(shí)要考慮到載體容量，如噬菌體插入片段不超過25kb,為此可選用識(shí)別4bp的限制酶(切割平均長度為256bp) ,識(shí)別6bp的限制酶切割平均長度4096 bp. 編輯ppt7雙酶切產(chǎn)生的DNA片段平均大小不超過1kb,但如采用雙酶部分消化，產(chǎn)物的分子量可達(dá)1030kb,它們存在著隨機(jī)序重疊，用蔗糖梯度離心或凝膠電泳可將這些片段群體按大小分開，可得到的分子量大小約為20kb的隨機(jī)DNA片段群體。二. DNA片斷大小的分部 如已知含目的基因克隆

5、片段的大小范圍，可在克隆前用蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳將DNA群體按大小分部分離。三.目的基因克隆片段的富集。編輯ppt8 四.克隆數(shù)的確定任一DNA序列在文庫中出現(xiàn)的概率： N:該序列需要克隆的總數(shù)；p:待克隆DNA序列在文庫中設(shè)定的出現(xiàn)概率，一般為99；I：待克隆DNA片段的長度，假定為17kb;G: 基因組DNA的總長度，如人類為3109bp)/1ln()1ln(GIpN編輯ppt9 將數(shù)據(jù)代入上式 = 8.1105N的含義是克隆大小為17kb的人類DNA時(shí)，所構(gòu)建的基因文庫數(shù)必須在 8.1105 以上時(shí)，才能以99的概率得到此克隆。)30/171ln()99. 01ln(MbkbN編

6、輯ppt10五. cDNA文庫 一.概況: cDNA文庫是通過反轉(zhuǎn)錄mRNA，并制備雙鏈雙鏈cDNAcDNA(double stranded cDNA)來構(gòu)建的。 構(gòu)建cDNA文庫的策略是取決于：(1)目的mRNA的相對(duì)豐度；(2)篩選方法： 除簡單的分子雜交法外還可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用各種方法進(jìn)行鑒定。編輯ppt11cDNA文庫的優(yōu)點(diǎn) (1)使遺傳物質(zhì)為RNA病毒可建立文庫； (2)因克隆數(shù)比基因組文庫少得多，易于篩選； (3)從分化特異的細(xì)胞的cDNA文庫中可分離到特異表達(dá)的基因。 (4)建庫時(shí)已排除了其它的RNA，使假陽性率減低。 (5) cDNA文庫可在細(xì)菌中表達(dá)，可用多種策略進(jìn)行篩選。編輯p

7、pt12但應(yīng)注意： (1) 細(xì)胞中不同mRNA的豐度不同，低豐度的mRNA要求很高的克隆數(shù)(要用公式來計(jì)算)。 (2)有的基因表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空性，要獲得其mRNA并非易事。用不同發(fā)育階段，或不同組織細(xì)胞中的mRNA制備的cDNA文庫會(huì)包含一些共同和特異序列。這可用于分離差異表達(dá)的基因。 (3)cDNA文庫的DNA無內(nèi)含子、調(diào)節(jié)元件和基因間DNA。不能用于基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的研究。一個(gè)基因經(jīng)不同的剪接可產(chǎn)生不同的部分重疊的cDNA克隆。編輯ppt132.制備cDNA文庫 分離代表細(xì)胞中主要mRNA(rRNA和tRNA因其豐富和大小的一致性，可以通過分級(jí)直接分離)。mRNARNA的提取的提取可以通過

8、多胸腺嘧啶的柱子分離。然后被反轉(zhuǎn)錄。cDNA第一鏈的合成用oligo(dT)引物，因?yàn)殚L的mRNA沒有被完全反轉(zhuǎn)錄,因此中部可加另一引物。第二鏈第二鏈cDNAcDNA的合成的合成是用自身引物的，一個(gè)更有效的方法是在cDNA第一鏈加尾(如多聚胞嘧啶)，然后用oligo(G)為引物起始第二鏈的合成。這樣產(chǎn)生的雙鏈cDNA可以通過加接頭或同聚尾巴插入載體。編輯ppt14 AAAAAAA mRNA (a) 隨機(jī)六堿基 (b)寡聚(dT)引物 第一條 cDNA 的合成 An An NNNNNN Tn (c)發(fā)夾引物 (d)同聚物加尾反應(yīng) 第二條 cDNA 的合成 TTTTTT GGGGGG TTTTTT

9、 CCCCCC 加接頭 1 TTTTTT GGGGGG TTTTTT AAAAAA CCCCCC AAAAAA 切除發(fā)夾 通過以下途徑將 cDNA 插入載體 a. 平端克隆 TTTTTT b. 加接頭 AAAAAA c. 進(jìn)一步進(jìn)行同聚物加尾反應(yīng) 加接頭 2 TTTTTT AAAAAA 經(jīng)酶切進(jìn)行定向克隆 cDNA 克隆 編輯ppt15第二節(jié) 構(gòu)建文庫的載體一一.噬菌體載體噬菌體載體 基礎(chǔ)：裸露的噬菌體重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或包裝后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。 載體篩選：在細(xì)菌菌苔中形成噬菌斑。 重組篩選： 插入載體通過可見標(biāo)記的插入失活(cI基因的打斷阻止溶源性，產(chǎn)生的噬菌體更清澈；現(xiàn)代的載體攜帶lacZ

10、基因，以蘭-白篩選)。編輯ppt16 置換載體Spi-表型(對(duì)P2感染敏感性消失)是中心“ 填充片段”gam和red基因座丟失引起的。 供體DNA的大?。?插入載體：0-10kbp; 置換載體：9-23kbp。 插入大小范圍被有效形成噬菌斑的野生型基因組 75-105所限制。 主要應(yīng)用： 插入載體:cDNA克隆和表達(dá)文庫;噬菌體展示。 置換載體:基因組DNA克隆。編輯ppt17二. 粘粒粘粒( (cosmid) )載體載體 基礎(chǔ)：包含噬菌體cos位點(diǎn)的質(zhì)粒； 導(dǎo)入宿主：經(jīng)體外包裝，再轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞； 載體篩選：類似于質(zhì)粒 重組篩選：可見標(biāo)記插入失活和小片段插入的陽性篩選； 供體DNA大?。?0-

11、45kbp。插入大小范圍被有效形成噬菌斑的野生型基因組 75-105所限制。 主要應(yīng)用：基因組文庫構(gòu)建。編輯ppt18 真核基因組 DNA 取代型噬菌體載體 COS Charon 4A 機(jī)械剪切 EcoRI EcoRI 酶切 加人工接頭 酶切 連接 cos cos 體外包裝 轉(zhuǎn)染 E.coli 編輯ppt19三.質(zhì)粒載體構(gòu)建cDNA文庫雙鏈質(zhì)粒 DNA5 3 AAAAAAn 加錨定引物(寡聚 T) pBR322 5 3 AAAAAn 3 5 TTTT RT 酶 限制酶 用 NaOH 降解 mRNA 用 Klenow 酶合成第二鏈 SI 酶降解發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端轉(zhuǎn)移酶dGTP 末端轉(zhuǎn)移酶加寡聚 C C

12、CC CCC GGGGGG 連接 轉(zhuǎn)化 E.coli 擴(kuò)增 以質(zhì)粒為載體構(gòu)建 cDNA 文庫編輯ppt20四.大容量克隆載體 基因組作圖中使用的高容量人工染色體克隆載體的比較基因組作圖中使用的高容量人工染色體克隆載體的比較。載體系統(tǒng)克隆容量評(píng)價(jià)YAC(酵母人工染色體)酵母著絲粒,復(fù)制起始點(diǎn)和端粒200kb2Mbp嵌合發(fā)生率高(在基因組中不相連的連續(xù)片段)；不穩(wěn)定(自發(fā)缺失)；很難與酵母染色體分離；PAC(P1 人工染色體)細(xì)菌噬菌體 P1100300kbBAC(細(xì)菌人工染色體)F 質(zhì)粒300kb穩(wěn)定，但在細(xì)菌外難以維持MACs(哺乳類人工染色體)基于 Epstein-Barr 病毒的游離載體3

13、00kb 人類人工游離染色體(human artificial episomal chromosome,HAECHAEC)是一類發(fā)展 中的 MACs,它來自于 Epstein-Barr 病毒編輯ppt21(1)(1)細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基礎(chǔ)：大腸桿菌F質(zhì)粒 導(dǎo)入宿主：電轉(zhuǎn)化 載體篩選：顯性選擇標(biāo)記重組篩選：插入片段大小供體DNA大?。?00kbp主要應(yīng)用：大基因組分析評(píng)論：低頻率的重排和嵌合分子。載體在每個(gè)細(xì)胞中維持一個(gè)或兩個(gè)拷貝，產(chǎn)生少量供體DNA。編輯ppt22 HindIII Co

14、s NotI NotI Z T7 SP6 ParC CMr HindIII 部分酶切 ParB BAC oriS ParA PFGL repE HindIII CIP Pulsed-field gel electrophoresis 連接編輯ppt23編輯ppt24 (2) P1P1載體和載體和P1P1人工染色體人工染色體(P1 artificial chromosomes, PACs) 基礎(chǔ)：噬菌體P1 導(dǎo)入宿主：體外包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo) 載體篩選：顯性選擇標(biāo)記 重組篩選：應(yīng)用對(duì)致死標(biāo)記的打斷進(jìn)行陽性篩選 供體DNA大小：約100kbp 主要應(yīng)用：大基因組分析 評(píng)論：重排和嵌合分子少。載體維持低拷貝，

15、但可以通過誘導(dǎo)噬菌體P1溶菌循環(huán)擴(kuò)增。編輯ppt25(3)(3)酵母人工染色體酵母人工染色體(yeast artificial chromsomes, YACs) 基礎(chǔ)：釀酒酵母中心粒、端粒和ARS 導(dǎo)入宿主：轉(zhuǎn)化酵母原生質(zhì)體 載體篩選：顯性篩選標(biāo)記(營養(yǎng)缺陷型的恢復(fù)) 重組篩選：插入片段大小 供體DNA大?。?000kbp 主要應(yīng)用：大基因組分析，YAC轉(zhuǎn)基因小鼠 評(píng)論：YAC的缺點(diǎn)是高頻率的自發(fā)缺失，和克隆的嵌合化。重組載體的大小，需要電泳分析，有時(shí)難以區(qū)分內(nèi)源性染色體。YAC維持低拷貝。編輯ppt26 CEN4 EcoRI ARSI SUP4 TRPI Amp URA3 DNA ori

16、EcoRI 部分酶切 TEL TEL BamHI BamHI BamHI 和 PFEG(pulsed field gel Ecoli 雙酶切 electrophorcsis ) 脈沖電泳 變角電場電泳 連接 編輯ppt27第三節(jié) 文庫的篩選 一.基因組DNA文庫的篩選 篩選DNA文庫是分離目的基因常用的方法；在成千上萬的克隆中僅極少數(shù)含目的基因，且大多數(shù)基因的產(chǎn)物不具有可選擇的表型特征，因此可采用以下策略來進(jìn)行篩選：(1)用特異探針進(jìn)行分子雜交；(2)用免疫和生化方法來檢測基因產(chǎn)物；(3)用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。編輯ppt28二.cDNA的篩選 (1)最佳的cDNA文庫其mRNA在細(xì)胞中高

17、水平特異表達(dá)； (2)有的目的mRNA的豐度極低，那么就應(yīng)選擇其豐度相對(duì)較高的細(xì)胞來構(gòu)建文庫，并要計(jì)算好文庫應(yīng)具有的克隆數(shù)； (3)細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的表達(dá)量常常是表明mRNA豐度的敏感指標(biāo)。編輯ppt29表 24.4 根據(jù)所提供的來源和信息，從 cDNA 或基因組文庫中分離基因的策略所提供的信息所提供的信息篩選策略篩選策略功能克隆功能克隆- -不需要表達(dá)不需要表達(dá)高度度 mRNA豐富克隆從 cDNA 文庫中隨機(jī)選擇克隆，測序確定產(chǎn)物已知部分序列用寡核苷酸探針篩選a有部分克隆或同源序列在低嚴(yán)格條件下用克隆的片段或同源基因篩選已知部分多肽序列用簡并性寡核苷酸猜測體猜測體(guessmers)篩選文

18、庫兩種組織中表達(dá)差異差減篩選，通過差減雜交得到富含差異表達(dá)克隆的文庫cDNAcDNA 表達(dá)的功能克隆表達(dá)的功能克隆提供突變通過對(duì)突變表型的互補(bǔ)篩選(表型恢復(fù))提供抗體同免疫檢測篩選文庫特異性的產(chǎn)物通過特殊技術(shù)篩選文庫，如對(duì) DNA 結(jié)合蛋白的 southweatern 雜交，相互作用蛋白的酵母雙雜交體系，酶對(duì)底物的轉(zhuǎn)化等定位克隆定位克隆提供結(jié)構(gòu)突變?nèi)绻蛔冇扇笔б穑瑥幕蚪M消減文庫來克隆由轉(zhuǎn)座子插入引起的突變?nèi)绻蛔冇刹迦牖蜣D(zhuǎn)座子件引起，用轉(zhuǎn)座序列作為探針篩選突變體文庫，通過質(zhì)粒拯救分離克隆基因在染色體上的位置通過從相關(guān)標(biāo)記或染色體斷點(diǎn)相連接的染色體步移(chromosomewalking,

19、)定位克隆，標(biāo)記可能是增強(qiáng)子包載載體的轉(zhuǎn)座因子非篩選方法非篩選方法基因組作圖和測序?qū)φ麄€(gè)基因組系統(tǒng)化分析表達(dá)序列標(biāo)記對(duì)隨機(jī) cDNA 克隆的大量克隆和分析a 以 PCR 為基礎(chǔ)的方法也可應(yīng)用編輯ppt30 探針的特異性可通過以下的策略來解決： 選基因的特異序列為探針； 長度不低于1720Nt； 控制退火溫度。 堿基的簡并性可通過以下的策略來解決： 選用簡并程度最低的序列； 選用使用頻率最高的密碼子； 簡并密碼子的第3個(gè)堿基可用H； 應(yīng)用混合探針； 控制退火溫度。編輯ppt31 三. 應(yīng)用寡核苷酸探針來分離目的基因1.寡核苷酸探針的來源(1)從某一物種分離到的基因序列可作為另一物種的核酸探針；(

20、2)由蛋白質(zhì)保守區(qū)中相鄰的67個(gè)氨基酸推導(dǎo)合成出核酸探針。 合成探針時(shí)必須考慮到： 探針的特異性； 堿基的簡并性。編輯ppt32四.假陽性克隆的克服 應(yīng)用混合探針分離克隆基因雖取得了良好的效果，但也會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的假陽性?？朔訇栃缘姆椒ㄓ卸? (1)制備“ 猜測體(guessmer)” 探針 猜測體 探針是根據(jù)特定物種某已知蛋白的密碼子使用頻率，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質(zhì)區(qū)段進(jìn)行人工合成的低簡并性寡核苷酸探針。編輯ppt33TC CTAGAGAGCT 保守的氨基酸序列 CysMetAspGluMetLysArgAsnIle 特異的 DNA 序列 A TG -ATG-GA -GA -A

21、TG-AA -AG AA -ATT C 簡并的探針含 8 種不同序列 A CGC TGTATGGATGAAATGAA G TGCATGGATGAAATGAA T TGTATGGACGAAATGAA TGCATGGACGAAATGAA TGTATGGATGAGATGAA TGCATGGACGAGATGAA TGCATGGATGAGATGAA TGTATGGACGAGATGAA 同 cDNA 文庫雜交 唯一的“猜測體”5 TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC 3 同克隆基因雜交的正確序列 5 TGCATGGACGAATGAA 3 ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTAT

22、AG 猜測體與克隆基因雜交存在錯(cuò)配 G C5 TGCATGGACGA ATGAAGCGCAA ATC 3 ACGTACCTGCT TACTTCGCGTT TAG T A 事實(shí)上的 DNA 序列5 TGCATGGACGAAATGAAGCGCAATATC 3 ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG 編輯ppt34 猜測體探針只要有85的 堿基能和目的基因配對(duì)即可雜交。如連續(xù)的配對(duì)區(qū)較長(達(dá)1012Nt),那么猜測體探針作用的強(qiáng)度足以鑒定出含目的基因的陽性克隆。 如錯(cuò)配的核苷酸均勻分散在探針分子的各部位，那么這種猜測體探針就不會(huì)和目的基因的序列雜交。 提高雜交溫度，以減少假陽性。編輯

23、ppt35(2)PCR猜測體技術(shù) 測定尿酸氧化酶末端一段32aa的序列； 根據(jù)此段順序兩側(cè)的序列推測,合成一組引物； 從豬肝中提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用以上 述引物對(duì)此cDNA進(jìn)行特異擴(kuò)增。 擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體上進(jìn)行克隆，并用唯一猜 測體探針進(jìn)行雜交，選擇陽性克隆。此猜測體 探針是按32aa序列推導(dǎo)猜測而來的。 分離的克隆中部為上述32aa,兩端為引物序列。 用這段插入序列為探針，在嚴(yán)格條件下篩選 噬菌體cDNA文庫。編輯ppt36 32aa 尿酸氧化酶 豬肝 mRNA 以 32aa 兩側(cè)序列 為根據(jù),合成兩組 RT 簡并引物 cDNA 用簡并引物特異擴(kuò)增豬肝的 cDNA 混合連接，克

24、隆 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 用猜測體探針 從重組質(zhì)粒中切下 篩選陽性克隆 插入序列 以插入序列為探針 篩選 cDNA 文庫編輯ppt37 五.應(yīng)用差別雜交或 扣除雜交法分離克隆的目的基因(一)差別雜交(diffential hybridization)1.差別雜交要擁有兩種細(xì)胞群體：在一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因正常表達(dá)，而另細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)。2.制備兩種不同的mRNA提取物。一種含一定比例目的基因mRNA的總mRNA;另一種不含目的基因mRNA的總mRNA;3.通過這兩種總mRNA為探針的平行雜交對(duì)目的基因cDNA克隆文庫進(jìn)行篩選。編輯ppt38 表達(dá)目的基因的細(xì)胞 不表達(dá)目的基因的細(xì)胞 RT

25、提取 mRNA cDNA 提取 mRNA 制備帶有放射 重組到 制備帶有放射 標(biāo)記的 cDNA 探針 載體上 標(biāo)記的 cDNA 探針 與影印的 NC 轉(zhuǎn)染 E.coli 與影印的 NC 進(jìn)行分子雜交 構(gòu)成 cDNA 文庫 進(jìn)行分子雜交 影印 影印 放射自顯影 放射自顯影 比對(duì) 比對(duì) 篩選出含目的基因的陽性克隆編輯ppt39(二)扣除雜交 差減雜交的缺點(diǎn)： (1) 靈敏度低 (2)重復(fù)性差 (3)需用大量的雜交膜，工作量大，費(fèi)時(shí)， 費(fèi)錢 故可用扣除雜交來篩選，扣除雜交也可用來分析缺失突變基因編輯ppt40 野生型 DNA 缺失突變型 A B C A C 基因組 DNA 剪切 用生物素標(biāo)記 A B

26、 C 過量 變性，退火雜交 A C B 過生物素柱 裹著生物素 的小磁珠 生物素柱 未結(jié)合的 DNA B B B 加接頭，PCR 擴(kuò)增 重組，轉(zhuǎn)化，形成克隆庫編輯ppt41(三).用差別顯示分離克隆的目的基因 DDRTPCR (1) 從一對(duì)不同的組織或器官中分離總 mRNA,分別稱為 A 組和 B 組， 并同時(shí)進(jìn)行以下反應(yīng) mRNA 5 GCAAAAAAAAAAAAn 3 3 CGTTTTTTT 5 RT 酶 3 錨定引物(5 TnGC3 ) 5 GCAAAAAAAAAAAn 3 3 CGTTTTTTT 5 5 隨機(jī)引物 3 CGTTTTTTT 5 3 錨定引物(5 TnGC3 ) 5 端隨機(jī)

27、引物 放射性標(biāo)記 dNTP 5 GCAAAAAA3 3 CGTTTTTTT5 編輯ppt42 A B A 組特有的條帶 B 組特有的條帶 A,B 共有但豐度不同的條帶DDRTPCR編輯ppt43(四)用免疫的方法分離克隆的目的基因 1.用靶蛋白制備抗體 2.用這種抗體制備抗抗體，一擴(kuò)大信號(hào)。 3.標(biāo)記抗抗體； 4.進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。編輯ppt44 噬菌體,粘粒 或質(zhì)粒文庫 影印到 NC 膜上 進(jìn)行分子雜交或免疫反應(yīng) 純化噬菌斑和菌落 編輯ppt45 母板 影印到 NC 上 目的蛋白抗抗體 目的蛋白抗體 放射自顯影的 X 光片 利用抗體篩選表達(dá)文庫編輯ppt46六.篩選YAC文庫 從理論上只要分離到

28、大量的基因組克隆，并構(gòu)建它們的限制圖就可鑒別出重疊的基因組克隆，進(jìn)而構(gòu)建出全基因組的物理圖。 實(shí)際上是很困難的。 (1)重疊的片段多，重疊的長度不均衡；(2)工作量大； 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的YAC文庫插入片段的總和相當(dāng)于58個(gè)基因組大小，則需約500個(gè)96孔板和相應(yīng)數(shù)量的雜交膜。因此，一般采Locus- specfic PCR來篩選。用“ 集”(pool)為單位(相當(dāng)于4塊96孔板)或用“ 超級(jí)集”(相當(dāng)與20塊96孔板)逐輪篩選，逐步縮小篩選范圍。編輯ppt47七.基因定位克隆 基因定位克隆 (map-based cloning)是用于分離未知結(jié)構(gòu)的目的基因。 從理論上說，任何已鑒別的突變基因都可用這種方法分離出來。 條件是： (1)已建立含此基因的YAC文庫