基因組學(xué)知識(shí)點(diǎn)整理

1、AC/DS轉(zhuǎn)座 Ac/Ds系統(tǒng)是玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)之一。Ac是自主控制因子（autonomous element），或稱激活因子，長(zhǎng)4563bp，含有一個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因和一段與轉(zhuǎn)座酶的近末端重復(fù)區(qū)域鄰接的、短的不完整的反向重復(fù)序列。Ac缺失后能形成不同形式的Ds。Ds-a和Ac相似，只缺失了部分轉(zhuǎn)座酶基因。這點(diǎn)可解釋Ds自身不能發(fā)生轉(zhuǎn)座的原因。Ds-b的缺失片段較長(zhǎng)，僅保留了轉(zhuǎn)座酶基因的一個(gè)小片段。Ds-c僅剩有Ac因子中反向重復(fù)序列和與轉(zhuǎn)座酶結(jié)合的近末端重復(fù)區(qū)域。這些區(qū)域和片段都是Ds-c在Ac指導(dǎo)下轉(zhuǎn)座所必須的靶位點(diǎn)。Ac能自主轉(zhuǎn)座，并形成不穩(wěn)定的基因突變，但不使染色體斷裂，它能使Ds因子活化、轉(zhuǎn)

2、座，并通過Ds控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，有劑量效應(yīng)，當(dāng)Ac劑量增加時(shí)，相關(guān)的遺傳效應(yīng)延遲發(fā)生。Ds是非自主因子（nonautonomous element），又稱解離因子，是與Ac屬于同一家族的控制因子，Ds是由Ac因子中間序列的缺失而形成的，從而失去轉(zhuǎn)座酶功能。當(dāng)Ac因子存在時(shí)，能活化Ds，使其在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座或插入結(jié)構(gòu)基因之內(nèi)，導(dǎo)致基因失活或改變結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平，也可使染色體特定部位斷裂，引起缺失或重組。玉米Ds的存在能抑制鄰近基因的表達(dá)。Ac-Ds的轉(zhuǎn)座通過非復(fù)制型機(jī)制發(fā)生，且總是轉(zhuǎn)移到鄰近的位置，當(dāng)插入新靶位點(diǎn)后，原來(lái)位置上即失去Ds因子，結(jié)果可造成染色體斷裂或重排，由此可引起顯性基因丟失，

3、隱性基因表達(dá)。（小結(jié)）Ac是自主控制因子，Ds是非自主因子，Ac因子能自主轉(zhuǎn)座并形成不穩(wěn)定的基因突變，但不使染色體斷裂，它能使Ds因子活化、轉(zhuǎn)座，并通過Ds因子控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。Ac因子中間缺失后能形成不同形式的Ds因子，無(wú)轉(zhuǎn)座酶功能。Ac因子能活化Ds因子，使其在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座或插入結(jié)構(gòu)基因內(nèi)導(dǎo)致基因失活或改變基因的表達(dá)水平，也可使染色體特定部位斷裂，引起缺失或重組。Ds因子必須由Ac提供轉(zhuǎn)座酶才能轉(zhuǎn)座，Ds因子或多或少缺失Ac因子中的部分片段。所有的Ds因子要實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座，必須由一對(duì)IR和與其比鄰的一段短的可被Ac轉(zhuǎn)座酶識(shí)別的序列。Ac-Ds的轉(zhuǎn)座通過非復(fù)制型機(jī)制發(fā)生，且總是轉(zhuǎn)移到鄰近的位置當(dāng)插

4、入新靶位點(diǎn)后，原來(lái)位置上即失去Ds因子，結(jié)果可造成染色體斷裂或重排，由此可引起顯性基因丟失，隱性基因表達(dá)。非編碼RNA（siRNA和miRNA的產(chǎn)生過程、相同點(diǎn)、不同點(diǎn)）小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小RNA（microRNA；miRNA）是兩種序列特異性地轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，是小RNA的最主要組成部分，它們的相關(guān)性密切，既具有相似性，又具有差異性。對(duì)小RNA的深入研究將使我們更深一步了解生命的奧秘。本文主要介紹這兩種小RNA分子及其作用機(jī)理。siRNA介紹 RNA干涉（RNAi）在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，通過這種方式，利用具有同源

5、性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉默，迅速阻斷基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉過程中人工體外合成的小片段RNA，由約20個(gè)堿基對(duì)組成，包括5個(gè)磷酸鹽，2個(gè)核苷和3個(gè)懸臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是對(duì)特定信使RNA（mRNA）進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素。1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn)2125nt 的dsRNA 的出現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾?，而在轉(zhuǎn)基因正確表達(dá)的植株中則未出現(xiàn)。隨后，Hammond 等進(jìn)行的細(xì)胞提取物核酸酶活性實(shí)驗(yàn)證明了小分子RNA在RNAi 中的作用，這些小分子RNA就是由dsRNA形成的siR

6、NA。siRNA 的3´-末端2-nt 的突出對(duì)靶點(diǎn)識(shí)別的特異性起一定的作用，可將其限定在第一個(gè)堿基對(duì)相鄰的不成對(duì)堿基的位置。兩個(gè)研究小組以數(shù)以千計(jì)的人類和老鼠基因?yàn)槟繕?biāo)創(chuàng)建RNAi庫(kù)的進(jìn)展，科學(xué)進(jìn)展已清晰地表明：在哺乳動(dòng)物中利用小的干涉RNA和短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs，shRNA）來(lái)進(jìn)行RNA干涉以使基因沉默已經(jīng)成為強(qiáng)大而有力的生物工具。例如，在基因操作較困難的神經(jīng)元中，也有成功進(jìn)行RNAi的報(bào)道。Krichevsky等將化學(xué)合成的21nt siRNA通過陽(yáng)離子脂類轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元，顯著抑制內(nèi)源靶基因和轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。抑制神經(jīng)元NO合成酶表

7、達(dá)能有效降低疼痛，在Korneev的實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的雙鏈RNA成功地抑制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)NO合成酶表達(dá)，獲得RNA干擾的成功。RNAi能在極低濃度（nmol范圍）siRNA存在下顯示出特殊有效性。miRNA介紹miRNA的研究起始于時(shí)序調(diào)控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegan）中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)可時(shí)序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在線蟲C.elegan中發(fā)現(xiàn)第二個(gè)異時(shí)性開關(guān)基因let-7，2001年10月science報(bào)道了三個(gè)實(shí)驗(yàn)室從線蟲、果蠅和人體克隆的幾十個(gè)類似C.elegan的lin-4的小

8、RNA基因，稱為microRNA。隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNAs。對(duì)一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育進(jìn)程，造血過程，器官形成，凋亡，細(xì)胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生(Kim, 2005)。miRNAs是一種2125nt長(zhǎng)的單鏈小分子RNA，其結(jié)構(gòu)特征如下：廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，它本身不具有開放閱讀框（ORF）；成熟的miRNA，5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3端為羥基，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但

9、是和siRNA密切相關(guān)。成熟的miRNA 5端的磷酸基團(tuán)和3´端羥基則是它與相同長(zhǎng)度的功能RNA降解片段的區(qū)分標(biāo)志。miRNA獨(dú)有的特征是其5端第一個(gè)堿基對(duì)U有強(qiáng)烈的傾向性，而對(duì)G卻有抗性，但第二到第四個(gè)堿基缺乏U，一般來(lái)講，除第四個(gè)堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。MiRNAs具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性。miRNAs的表達(dá)方式各不相同。線蟲和果蠅當(dāng)中的部分miRNA在各個(gè)發(fā)育階段都有表達(dá)而且不分組織和細(xì)胞特性，而其他的miRNA則表現(xiàn)出更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臅r(shí)空表達(dá)模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern

10、）只有在特定的時(shí)間、組織才會(huì)表達(dá)。細(xì)胞特異性或組織特異性是miRNA的表達(dá)的主要特點(diǎn)，又如擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達(dá)，在某些組織低水平表達(dá)，在莖、葉等組織中卻無(wú)任何表達(dá)的跡象；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不到miR3-miR6，在成年果蠅中表達(dá)的miR-1和let-7也無(wú)法在果蠅胚胎中表達(dá)，這同時(shí)體現(xiàn)了miRNA的又一特點(diǎn)基因表達(dá)時(shí)序性。MiRNA表達(dá)的時(shí)序性和組織特異性提示人們miRNA的分布可能決定組織和細(xì)胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對(duì)組織的發(fā)育起重要作用。在科研上，一個(gè)小RNA分子要成為miRNA，需要符合以下條件：a）表達(dá)需

11、要用Northern-blot來(lái)證實(shí)；b）小RNA分子必須是處在具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體RNA分子中遠(yuǎn)離環(huán)或膨脹部分的一端才行；c）小RNA分子必須在系統(tǒng)發(fā)育上具備相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。d）前體RNA分子會(huì)在Dicer功能下降時(shí)積累起來(lái)（該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)由于實(shí)踐較難，只做參考）。這些標(biāo)準(zhǔn)單獨(dú)一條不足以證明一個(gè)未知小RNA分子是否就是是miRNA，具體地，如果小RNA分子符合上面的a（表達(dá)）和b（結(jié)構(gòu)）兩條標(biāo)準(zhǔn)；或者a（表達(dá)）和c（保守性）；如果表達(dá)量很低難以檢測(cè)，那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目標(biāo)分子，并符合c（保守性）；小RNA分子如果不是通過cDNA克隆的方法得到的，那么就必須符合a（表達(dá)）和前體RNA分子

12、結(jié)構(gòu)和保守性的標(biāo)準(zhǔn)才行；如果小RNA分子被推測(cè)為miRNA，那么符合c（系統(tǒng)發(fā)育保守性）和d（累積性）標(biāo)準(zhǔn)也行；這樣我們就可以認(rèn)為該小RNA分子就是miRNA分子。尋找miRNA的方法：這里我們簡(jiǎn)單看一下分子信息學(xué)的方法：應(yīng)用計(jì)算機(jī)的方法如MirScan來(lái)尋找miRNA分子已經(jīng)在線蟲及脊椎動(dòng)物體內(nèi)取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前述的計(jì)算機(jī)方法的基礎(chǔ)上提出一種可以進(jìn)行高通量篩選miRNA靶位點(diǎn)的方法。用這種方法篩選miRNA的原理：該方法的出發(fā)點(diǎn)為前體的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)及miRNA在物種間的保守性。miRNA基因可能定位于編碼蛋白基因的內(nèi)含子區(qū)域（有意義鏈或反意義鏈）及遠(yuǎn)離任何已知基因的基

13、因間區(qū)域。一些時(shí)候，幾個(gè)發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)以多順反子的形式叢集在一起.Uwe Ohler, Chris Burge等人給出了一些可以提高尋找miRNA基因的準(zhǔn)確性的一些附加條件：1）上游和下游保守序列的數(shù)量；2）候選發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的上游高度保守的模序的存在。MIT的Bartel and Chris Burge報(bào)道了一種可以用來(lái)探測(cè)miRNA與其作用的靶基因之間的關(guān)系的新的計(jì)算機(jī)的方法TatgetScan。他們針對(duì)已知的每一個(gè)miRNA，掃描mRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)DNA轉(zhuǎn)譯為蛋白的生化信息，搜索與miRNA匹配的片段，然后對(duì)miRNA與mRNA的匹配程度評(píng)分，推測(cè)在三個(gè)或以上物種中獲得高分的mRNA為該miRNA

14、的靶基因。RISC介紹RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的組裝是在RNAi和miRNA通路中最為復(fù)雜的過程。它涉及到小RNA的生產(chǎn)器（Dicer）；小RNA螺旋結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的RLC組裝；解螺旋后對(duì)稱/不對(duì)稱的RNA螺旋結(jié)構(gòu)及對(duì)應(yīng)的特異性的AGO蛋白質(zhì)的招募活動(dòng)。剛產(chǎn)生的siRNAs和miRNAs都是雙鏈結(jié)構(gòu)，這種雙鏈結(jié)構(gòu)需要解螺旋才能被組裝到RISC中發(fā)揮作用。組裝后的復(fù)合物分別稱為siRISC和miRISC。通過對(duì)鏈兩端的熱力學(xué)穩(wěn)定性分析，可以將siRNA分為兩大類：對(duì)稱性siRNAs和非對(duì)稱性siRNAs。對(duì)稱性siRNAs有著相

15、同穩(wěn)定性的末端；從而兩條鏈有著同等結(jié)合到RISC中的機(jī)會(huì)(Schwarz et al., 2003)。與之不同的是，非對(duì)稱性siRNAs的一端穩(wěn)定性會(huì)比另外一端差些。因?yàn)榉€(wěn)定性較差的一端容易解螺旋，因此，偏向性地產(chǎn)生一條鏈結(jié)合到RISC復(fù)合物上，這個(gè)過程我們稱之為“RISCs的非對(duì)稱性組裝(Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003)”。不同的AGO蛋白質(zhì)使得RISCs有著不同的功能，這可能是由AGO蛋白質(zhì)上PIWI結(jié)構(gòu)域決定的。根據(jù)AGO蛋白質(zhì)的不同，我們將RISCs分成兩種：切割型RISC和非切割型RISC。但具體到一個(gè)RISC是否切割一個(gè)目標(biāo)m

16、RNA分子，情況就更為復(fù)雜些，一般的以下五個(gè)方面決定(Tang, 2005)：a）必須是切割型RISC；b）小RNA分子和目標(biāo)的mRNA的配對(duì)情況要達(dá)到一定的水平；c）特定生物/組織/細(xì)胞中的RISC的切割速率情況（就是說(shuō)在不同的細(xì)胞中是那種形式占據(jù)主導(dǎo)地位，是切割還是抑制）；d）小RNA分子的來(lái)源背景；e）目標(biāo)mRNA的特性（數(shù)量，更新速率，結(jié)構(gòu)，翻譯能力）。siRNA的生成及作用機(jī)制dsRNA 引起的RNAi 大致可分為3個(gè)階段即啟動(dòng)、剪切、倍增:1、啟動(dòng)階段 研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)dsRNA 除外源性導(dǎo)入外，可能來(lái)源于病毒激活、轉(zhuǎn)座子活化及特異重復(fù)序列或其他未知途徑。研究證實(shí)dsRNA 在體內(nèi)通過

17、2123 個(gè)核苷酸(nt) 片段即小干擾RNA ( siRNA) 發(fā)揮其抑制作用。RNase 是為數(shù)不多的對(duì)長(zhǎng)dsRNA 顯示特異性的核酸酶，依據(jù)區(qū)域結(jié)構(gòu)可將其分為3 個(gè)類型，其中第3 類以果蠅的CG4792 和線蟲的K12H4. 8 為代表，二者在RNA 干擾過程中可以將dsRNA 加工成siRNA，現(xiàn)在稱此酶為Dicer 酶。人類Dicer 酶是一個(gè)接近普通RNase 的蛋白，能夠結(jié)合并剪切不同的dsRNA。其結(jié)構(gòu)主要包括:N 端螺旋酶區(qū)、PAZ區(qū)、C 端RNase 區(qū)(由dsRNA 結(jié)合區(qū)和串聯(lián)核酸酶區(qū)組成) 以及ATP 結(jié)合區(qū)和DECH 盒。另外，在其他諸如小鼠等生物中也發(fā)現(xiàn)類似的Di

18、cer 酶。Dicer 酶在剪切長(zhǎng)dsRNA 為siRNA 過程中起了關(guān)鍵性作用。在線蟲及其他生物中發(fā)現(xiàn)了lin24 和let27，這是2 個(gè)單鏈RNA 分子，其突變失活可影響發(fā)育，被稱為stRNA (small temporal RNA) 。二者是特異性蛋白編碼基因的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可在翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。成熟stRNA可與mRNA的3端非編碼區(qū)結(jié)合而阻遏其翻譯，并不引起mRNA 降解。2、效應(yīng)階段 Elbashir等在果蠅體外系統(tǒng)中加入合成2123nt 的siRNA， 使之能有效降解同源mRNA， 而當(dāng)siRNA 濃度增加到一定閾值時(shí)，mRNA 降解程度不再繼續(xù)增加，提示在果蠅裂解液中含

19、有一定數(shù)量RNAi 所需蛋白因子。進(jìn)一步研究得知RNAi 所需蛋白因子是一種復(fù)合物，被稱為RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC) 。RISC 是一種核糖核蛋白，包含有RNA 和蛋白成分。其中的RNA 就是siRNA，其蛋白成分包括AGO22、VIG 和dFXR 以及Dmp68 等，實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些成分是RISC 的一部分且為RNAi 所必需。在剪切過程中siRNA 的結(jié)構(gòu)起了重要作用，具有典型結(jié)構(gòu)的siRNA 較平末端siRNA 更能有效引起RNAi 作用，尤其是3端外懸的第2 個(gè)核苷酸影響siRNA 對(duì)靶mRNA 的剪切作用。另外，siR

20、NA 對(duì)靶mRNA 剪切具有精確的序列特異性。3、倍增階段 以往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)僅需少量siRNA 即可引起強(qiáng)烈同源基因表達(dá)抑制，因此眾多學(xué)者推測(cè)在RNAi 過程中存在倍增放大機(jī)制。有人認(rèn)為在前述的mRNA剪切過程中產(chǎn)生的2123nt 片段可能會(huì)作為新的siRNA 而繼續(xù)參與RNAi 過程， 從而使干擾作用放大。這種擴(kuò)增機(jī)制只是一種推測(cè)，是否存在尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究確定。RNAi 的系統(tǒng)性作用也是其引起人們關(guān)注的重要原因，但機(jī)制不明。Spankuch Schmitt 等在乳腺癌細(xì)胞系、子宮頸癌細(xì)胞系、結(jié)腸癌細(xì)胞系等細(xì)胞中成功進(jìn)行了RNAi 實(shí)驗(yàn)，并觀察到癌細(xì)胞增殖明顯減少、凋亡顯著增加。Krichev

21、sky 等用合成的siRNA 導(dǎo)入有絲分裂后期的原代神經(jīng)元中，有效抑制了其內(nèi)源性基因表達(dá)，使應(yīng)用RNAi 技術(shù)研究神經(jīng)發(fā)育及功能調(diào)控成為可能;不久前Song 等在小鼠體內(nèi)進(jìn)行RNAi 實(shí)驗(yàn)，有效抑制了Fas21 基因表達(dá)，從而延長(zhǎng)了患自身免疫性肝炎小鼠的生命，為進(jìn)行RNAi 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。隨著RNAi 作用機(jī)制的進(jìn)一步明確、應(yīng)用技術(shù)的完善成熟，RNAi 技術(shù)必將為人類研究基因功能，以及對(duì)癌癥等疾病進(jìn)行基因治療提供強(qiáng)大武器。RNAi干涉的關(guān)鍵步驟是組裝RISC和合成介導(dǎo)特異性反應(yīng)的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC中，然后與靶標(biāo)基因編碼區(qū)或UTR區(qū)完全配對(duì)，降解靶標(biāo)基因，因此說(shuō)s

22、iRNA只降解與其序列互補(bǔ)配對(duì)的mRNA。其調(diào)控的機(jī)制是通過互補(bǔ)配對(duì)而沉默相應(yīng)靶位基因的表達(dá)，所以是一種典型的負(fù)調(diào)控機(jī)制。siRNA識(shí)別靶序列是有高度特異性的，但這并不是說(shuō)反義鏈上所有的堿基都對(duì)發(fā)揮這種特異性起到了相同的作用。因?yàn)榻到馐紫仍谙鄬?duì)于siRNA來(lái)說(shuō)的中央位置發(fā)生，所以這些中央的堿基位點(diǎn)就顯得極為重要，一旦發(fā)生錯(cuò)配就會(huì)嚴(yán)重抑制RNAi的效應(yīng)，相對(duì)而言，3´末端的核苷酸序列并不要求與靶mRNA完全匹配。miRNA的生成及作用機(jī)制與小分子siRNAs相比，盡管兩者在分子特性、生物起源等方面是相似的，但也存在不少的差異。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下產(chǎn)生，而成熟m

23、iRNAs的產(chǎn)生要復(fù)雜一些，首先pri-miRNA在核內(nèi)由一種稱為Drosha酶處理后成為大約70nt的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)(Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004)；這些pre-miRNAs在Exportin-5幫助下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核外之后再由胞質(zhì)Dicer酶進(jìn)行處理，酶切后成為成熟的miRNAs(Lund et al., 2004; Yi et al., 2003)。兩者的作用機(jī)制上也存在差別，成熟的miRNAs則是通過與miRNP核蛋白體復(fù)合物結(jié)合，識(shí)別靶mRNA

24、，并與之發(fā)生部分互補(bǔ)，從而阻遏靶mRNA的翻譯。在動(dòng)物中，成熟的單鏈miRNAs與蛋白質(zhì)復(fù)合物miRNP結(jié)合，引導(dǎo)這種復(fù)合物通過部分互補(bǔ)結(jié)合到mRNA的3UTR（非編碼區(qū)域），從而阻遏翻譯。而在siRNA通路中，單鏈的siRNA結(jié)合到RISC復(fù)合物中，引導(dǎo)復(fù)合物與mRNA完全互補(bǔ)，通過其自身的解旋酶活性，解開siRNAs，通過反義siRNA鏈識(shí)別目的mRNA片段，通過內(nèi)切酶活性切割目的片段，接著再通過細(xì)胞外切酶進(jìn)一步降解目的片段。除此之外，miRNA也可以切割完全互補(bǔ)的mRNA，而siRNA也可以阻遏3UTR具有短片斷互補(bǔ)的mRNA的翻譯。一般來(lái)說(shuō)，一種miRNA它在mRNA上的識(shí)別位點(diǎn)有多個(gè)

25、，而這種多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)對(duì)于miRNA發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后抑制作用是必要的。3非編碼區(qū)也是調(diào)控翻譯的一個(gè)重要組成部分。一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的總體結(jié)構(gòu)由5'非編碼區(qū)(5'Untranslated Region，5'UTR)，編碼區(qū)（Open Reading Frame，ORF）和3'非編碼區(qū)（3' Untranslated Region，3'UTR）組成?，F(xiàn)已了解3'UTR具轉(zhuǎn)錄本特異性，它在mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾、細(xì)胞內(nèi)定位及轉(zhuǎn)運(yùn)、維持mRNA穩(wěn)定性及保證翻譯的效率方面都具重要的調(diào)控功能。3'UTR是發(fā)生3'末端加工的區(qū)域，包含各種順式(cis-)

26、作用元件，能夠和特定的加工復(fù)合物互作以調(diào)控mRNA的3'末端加工。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明，真核生物中3'末端加工涉及3'UTR內(nèi)某個(gè)位點(diǎn)的剪切和末端添加多聚腺苷酸尾Poly(A+)兩個(gè)關(guān)鍵過程。應(yīng)用缺失實(shí)驗(yàn)和序列分析已確認(rèn)了哺乳動(dòng)物mRNA的3'UTR包含了核心順式作用元件。這類元件與加工復(fù)合物的相互作用是3'末端形成的核心機(jī)制，包括三部分：Poly(A+)位點(diǎn)，也可稱為剪切位點(diǎn)(cleavage site， CS)，保守序列為YA (Y代表T 或C)的二聚核苷酸，這種保守序列的單堿基比例為A > T > C > G；Poly（A+）位點(diǎn)

27、上游（5'端）10-30 nt 處存在著保守的Poly(A+)定位信號(hào)序列(以AATAAA為主)。Poly（A+）位點(diǎn)下游（3'端）存在著穩(wěn)定3'末端加工復(fù)合物作用的保守性稍差的T/GT豐富序列，稱為下游作用元件。miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為三種：第一種以線蟲lin-4為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類。第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA，這說(shuō)明某些miRNA和siRNA一樣

28、參與了機(jī)體內(nèi)一些特異性mRNA的剪切過程。第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式，當(dāng)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，直接靶向切割mRNA，如果蠅和Hela細(xì)胞中l(wèi)et-7直接介導(dǎo)RISC分裂切割靶mRNA；當(dāng)與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)基因基因表達(dá)的作用，如線蟲中的let-7與靶mRNA3´端非翻譯區(qū)不完全配對(duì)結(jié)合后，阻遏調(diào)節(jié)基因的翻譯。對(duì)于miRNAs的研究已經(jīng)成為目前的一大熱點(diǎn)，而種種跡象表明miRNAs可能是一類與腫瘤發(fā)生有關(guān)的新的基因。像miRNA-15a和miRNA-16a與CLL有關(guān)，miRNA-142則與侵襲性的B細(xì)胞性白血病有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNAs能

29、夠在腫瘤形成中發(fā)揮作用，可以作為腫瘤抑制基因；另外一些miRNAs則是作為癌基因存在。植物miRNA從2002年起才有報(bào)道，編碼植物miRNAs的基因明顯不同于其他生物：植物編碼miRNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能更大，植物的miRNA與互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)配一般也少于動(dòng)物，在進(jìn)化上表現(xiàn)地更為保守。但和動(dòng)物miRNA一樣，miRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也是發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，在RNase酶切割后以雙鏈形式存在，最后釋放互補(bǔ)鏈，miRNA成熟。科學(xué)家們已發(fā)現(xiàn)miRNA在動(dòng)植物早期發(fā)育中起的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，包括植物葉、花的發(fā)生，動(dòng)物胚胎及組織發(fā)育等。例如，在carpel factory (car) 突變株中3個(gè)miRNAs的表達(dá)水平

30、顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個(gè)類似Dicer的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數(shù)的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達(dá)也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育過程。Brennecke等人利用電腦尋找靶標(biāo)基因，證實(shí)了miRNA不完全結(jié)合3´UTR中存在細(xì)胞死亡誘導(dǎo)基因，這提示說(shuō)明miRNA對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行更為重要的調(diào)控作用。盡管現(xiàn)在研究者們對(duì)于miRNAs的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深刻，仍然有很多的猜想需要證實(shí)，比如對(duì)miRNAs的潛在的生物學(xué)效應(yīng)的猜測(cè)；miRNAs在高級(jí)真核生物體內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控

31、作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要；miRNAs可能代表一個(gè)新層次上的基因表達(dá)調(diào)控模式，等等。所以說(shuō)，大多數(shù)miRNAs的功能仍然是個(gè)謎，有待于研究者們更深入的研究。siRNA和miRNA的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)相同點(diǎn)：1、 二者的長(zhǎng)度都約在22nt左右；2、 二者都依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)；3、 二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在；4、 二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有重疊；5、 miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前提形成。不同點(diǎn)：1、 根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，是生物體的固有因素；而si

32、RNA是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。2、 結(jié)構(gòu)上，miRNA是單鏈RNA，而siRNA是雙鏈RNA。3、 Dicer酶對(duì)二者的加工過程不同，miRNA是不對(duì)稱加工，miRNA僅是剪切pre-miRNA的一個(gè)側(cè)臂，其他部分降解；而siRNA對(duì)稱地來(lái)源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。4、 在作用位置上，miRNA主要作用于靶標(biāo)基因3-UTR區(qū)，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5、 在作用方式上，miRNA可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用，而siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。6、 miRNA主要在發(fā)育

33、過程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，而siRNA不參與生物生長(zhǎng)，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。基因陷阱（Gene Trap）1 . 基因陷阱的原理目前已發(fā)展了三種不同的陷阱系統(tǒng) 增強(qiáng)子陷阱,啟動(dòng)子陷阱和基因陷阱 。它們之間最大的不同體現(xiàn)在報(bào)道基因重組體的組成和插入位置上?；蛳葳迨沁@三種方法的統(tǒng)稱。1 . 1增強(qiáng)子陷阱(enhancer t rap) 將某報(bào)道基因與一個(gè)精巧的啟動(dòng)子相連,組成一增強(qiáng)子陷阱重組體(見圖1B) ,它不會(huì)自主起始轉(zhuǎn)錄,而需由被插入的細(xì)胞基因組中的增強(qiáng)子幫助才可轉(zhuǎn)錄。若報(bào)道基因最終表達(dá),則可推知插入位點(diǎn)附近有增強(qiáng)子,或有基因,即實(shí)現(xiàn)了以該增強(qiáng)子陷阱重

34、組體發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子的目的。1 . 2啟動(dòng)子陷阱(p ro moter t rap) 通過將報(bào)道基因插入到細(xì)胞基因組的外顯子上(見圖 C) ,一旦發(fā)現(xiàn)它與細(xì)胞基因組基因被共同轉(zhuǎn)錄或表達(dá),則可知該報(bào)道基因附近有啟動(dòng)子,從而起到了以之為誘餌,發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的目的,這就是啟動(dòng)子陷阱。1 . 3基因陷阱(gene t rap) 基因陷阱重組體由報(bào)道基因和接受體剪接部位(splice acceptor , SA)組成(接受體剪接部位在報(bào)道基因上游) ,該重組體需要插入到細(xì)胞基因組的內(nèi)含子中隨著基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)(見圖1D) ,故如能檢測(cè)到融合轉(zhuǎn)錄物或融合蛋白,則證明插入位置附近有基因存在 2 。啟動(dòng)子陷阱和基因陷阱都

35、有位置限制,前者需插入到外顯子,后者則需插入到內(nèi)含子,增強(qiáng)子陷阱卻沒有此位置限制;由于增強(qiáng)子與基因的位置可近可遠(yuǎn),故增強(qiáng)子陷阱不易定位基因;此外,對(duì)啟動(dòng)子陷阱和基因陷阱而言,插入可能導(dǎo)致基因失活。下面以帶SA的基因陷阱(即第三種基因陷阱)的一個(gè)成功例子具體闡明這一系統(tǒng)的工作原理。1998年Tate等以2半乳糖苷酶2新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶為報(bào)道基因,和上游的接受體剪接部位SA構(gòu)成重組體, 只有以正確的方向整合到內(nèi)含子的表達(dá)基因才有可能被剪接成基因轉(zhuǎn)錄物或表達(dá)為融合蛋白,利用此基因陷阱“釣”出了一小批新的染色體蛋白和核蛋白 3 。2 . 基因陷阱的特點(diǎn)基因陷阱的優(yōu)勢(shì)在于它只在表達(dá)水平上定位基因,細(xì)胞基因

36、本身的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)不受影響,所以可檢測(cè)功能上多余的基因,也可檢測(cè)在基因表達(dá)多個(gè)水平上都有作用的基因,或低水平表達(dá)的重要基因,而以前的功能基因組學(xué)的方法對(duì)這些基因都是無(wú)法確定的?；蛳葳宓牟蛔阒饕憩F(xiàn)在以下幾個(gè)方面:(1) 表達(dá)基因的確定較困難且耗時(shí)長(zhǎng) 如何克隆和篩選融合轉(zhuǎn)錄物或融合蛋白是一件很費(fèi)時(shí)費(fèi)力的事。通常根據(jù)所插入的報(bào)道基因的DNA序列為引物,用PCR技術(shù)獲取兩側(cè)序列,再與ES T數(shù)據(jù)庫(kù)比較和確定基因功能。最近出現(xiàn)一些很好的解決方法,如在RACE的微透析和固相測(cè)序中采用自動(dòng)化和熒光測(cè)序,可縮短時(shí)間;或只測(cè)一小段DNA序列即與ES T數(shù)據(jù)庫(kù)已有序列進(jìn)行比較,若已有人研究過,則不用繼續(xù),若從沒

37、研究過,則應(yīng)得到目的基因全長(zhǎng)并分析其功能。(2) 突變的細(xì)胞的表型不明顯 主要原因是被捕獲的基因不一定有很明顯的表達(dá)方式,以及突變的ES細(xì)胞克隆不一定有明顯的表型。目前的解決方法是進(jìn)行體外預(yù)先篩選我們需要的融合基因株系。(3) 報(bào)道基因表型可能會(huì)喪失 若報(bào)道基因沒按預(yù)期加以整合,或報(bào)道基因被剪接時(shí)整個(gè)被切除,都可能使報(bào)道基因表型喪失而無(wú)從著手。(4) 目前使用的基因陷阱系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的傷害大 畢竟基因陷阱是插入了一段外源DNA ,所以是一種劇烈的方法,會(huì)有致死效應(yīng)(美國(guó)加州大學(xué)Berkeley分校的實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞或胚胎致死頻率是1/ 3) 4 。在一些情況下應(yīng)采用柔和一些的方法,如進(jìn)行重組體的置換而

38、不是插入,用點(diǎn)突變,選擇性地采用表型突變 5 。3 . 基因陷阱的應(yīng)用 基因陷阱的應(yīng)用主要集中在醫(yī)療和制藥上,而目前小鼠是探討人類生理過程最好的模型,因此許多應(yīng)用性的工作都以小鼠作為研究對(duì)象。一般在小鼠中不使用增強(qiáng)子陷阱,其基因組很大但基因頻率很低,故很難定位增強(qiáng)子;報(bào)道基因一般是lac2Z ,它的上游有一個(gè)或多個(gè)受體剪接部位,由逆轉(zhuǎn)錄病毒引入全能胚胎干細(xì)胞,再移入小鼠種系中。1988年就已有人在小鼠細(xì)胞中使用基因陷阱 6 。最近美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(N IH)的科研人員報(bào)道以小鼠為材料,利用H IV21慢病毒來(lái)研究哺乳動(dòng)物的細(xì)胞分化和發(fā)現(xiàn)新的基因,而慢病毒作為基因陷阱載體,是因?yàn)樗麄兛呻S機(jī)插入動(dòng)物

39、細(xì)胞的基因組并可長(zhǎng)期表達(dá) 7 。法國(guó)和日本的科學(xué)家利用乙肝病毒(HBV)的DNA幫助基因陷阱的插入整合,來(lái)確定未知的肝癌相關(guān)基因。這說(shuō)明可通過研究病毒基因的整合位點(diǎn)來(lái)確定人類疾病相關(guān)基因,同時(shí)證明這些由HBV構(gòu)成的基因陷阱附近的基因?qū)?xì)胞增殖和生長(zhǎng)有重要調(diào)控作用8 。近些年來(lái),許多著名的大學(xué)和研究所已建立自己的基因陷阱實(shí)驗(yàn)室,如英國(guó)牛津大學(xué),美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室等。此外,許多生物制藥公司和研究團(tuán)體都看好基因陷阱在生物醫(yī)療和制藥方面的DNA分子標(biāo)記可對(duì)特定淋巴細(xì)胞的發(fā)生及遷移進(jìn)行跟蹤,從而為人們進(jìn)一步探索淋巴細(xì)胞的成熟、歸巢等提供了良好的研究平臺(tái)。4 .展望盡管目前斑馬魚作為免疫學(xué)模式生物還只是剛剛

40、起步,但由于其具有發(fā)育生物學(xué)研究方法成熟、進(jìn)化地位特殊、遺傳突變篩選簡(jiǎn)便等特點(diǎn),在未來(lái)的研究,特別是免疫系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育及特異性免疫系統(tǒng)進(jìn)化起源等研究領(lǐng)域中必將發(fā)揮日趨重要的作用。平衡化cDNA文庫(kù) 平衡化cDNA文庫(kù)三種平衡化理論 （PDF里的英文翻譯）飽和雜交到基因組DNA基因頻率在DNA水平上是相等的基于關(guān)聯(lián)動(dòng)力學(xué)罕見的物種二次動(dòng)力學(xué)cDNA的再次退火將退火較慢寡核苷酸指紋 基于一系列短的寡聚核苷酸探針對(duì)于高密度序列的單個(gè)的cDNA克隆經(jīng)特定雜交纏身特征型的cDNA序列即為指紋 分子標(biāo)記顯性和共顯性問題有關(guān)分子標(biāo)記共顯性 分子標(biāo)記中，顯性和共顯性，指allele而言，即指所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)

41、物(DNA片斷)。象RAPD、ISSR等顯性標(biāo)記，PCR產(chǎn)物無(wú)法確切確定，因而無(wú)法區(qū)分雜合體（heterozygosity），只能按有帶無(wú)帶進(jìn)行分析，記錄為0/1；而SSR等共顯性標(biāo)記，則能區(qū)分雜合體，即二倍體及多倍體染色體DNA上的不同變異都能顯現(xiàn)出來(lái)，而且不僅可采用0/1記錄也可按擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度（bp）進(jìn)行記錄和分析，是一種能區(qū)分雜合體的共顯性標(biāo)記，即如果同源染色體上相同的locus上，存在插入、缺失等變異，即便是單個(gè)堿基對(duì)上的差異也能同時(shí)顯示并加以分辨。所以，共顯性標(biāo)記，在揭示遺傳多樣性方面要比顯性標(biāo)記具有更大的優(yōu)勢(shì)。更為重要的是，SSR引物是以外顯子保守序列為引物結(jié)合點(diǎn)，即以已知DNA

42、序列為基礎(chǔ)所開發(fā)的引物，在基因組上具有特定的位置，所以在QTL等分析上，應(yīng)用極為廣泛。共顯性：說(shuō)白了就是可以分辨出純和的跟雜合的這個(gè)有圖示比較好理解。首先, RAPD是隨機(jī)引物，(可以理解只有正向引物，沒有反向引物。)因此，它擴(kuò)增出來(lái)的為引物結(jié)合位點(diǎn)到終點(diǎn)的長(zhǎng)度。當(dāng)然一條練上會(huì)有很多該引物結(jié)合位點(diǎn)，也就出現(xiàn)了很多片段。對(duì)于一個(gè)特定位點(diǎn)，我們可以理解只有一條正練可被擴(kuò)增。因此，在該練上只有兩種情況，有和沒有。對(duì)于SSR，有一對(duì)(正向引物和反向引物)。對(duì)于一個(gè)特定位點(diǎn)，兩條練都可被擴(kuò)增，因此.T - D NA導(dǎo)入植物基因組的分子機(jī)理農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T - DNA的轉(zhuǎn)移和整合是細(xì)菌與植物細(xì)胞相互作用發(fā)生

43、生物學(xué)效應(yīng)的過程,兼具原核生物中的細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移及真核細(xì)胞加工修飾的特點(diǎn)。其整個(gè)過程大致包括:(1)農(nóng)桿菌對(duì)受體的識(shí)別與附著; (2)農(nóng)桿菌對(duì)特異的植物信號(hào)分子的感應(yīng);(3) v i r G介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)及毒性基因的活化;(4)毒性蛋白作用產(chǎn)生T - DNA單鏈; (5)毒性蛋白轉(zhuǎn)移復(fù)合體的形成及T - DNA和毒性蛋白進(jìn)入宿主胞質(zhì); (6)成熟T - DNA復(fù)合體的形成; (7) T -DNA復(fù)合體在植物及細(xì)菌作用下被攝入細(xì)胞核;(8) T - DNA整合進(jìn)入植物基因組。2 . 1農(nóng)桿菌對(duì)受體的識(shí)別與附著單個(gè)農(nóng)桿菌以極性方式通過細(xì)胞表面的乙酰化酸性莢膜多糖介導(dǎo)附著在植物細(xì)胞表面(此過程稱為接觸

44、) 9 ,受傷的植物組織分泌一系列的酚類、糖類、氨基酸類等趨化性物質(zhì) 10 吸引農(nóng)桿菌向受傷組織集中。據(jù)研究,植物細(xì)胞表面的農(nóng)桿菌附著位點(diǎn)是有限的,根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的附著位點(diǎn)不同,每個(gè)植物細(xì)胞可以同時(shí)附著多種不同的農(nóng)桿菌菌株,但只能被1個(gè)或少數(shù)幾個(gè)菌株所轉(zhuǎn)化。且只有在創(chuàng)傷部位生存了816 h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤 11 ,這段時(shí)間稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)期。在調(diào)節(jié)期內(nèi),農(nóng)桿菌會(huì)產(chǎn)生大量纖維素和一些糖類化合物將自身束縛在植物細(xì)胞壁表面并將細(xì)胞包裹形成一個(gè)囊狀結(jié)構(gòu)(此過程稱為成囊 12 ) 。在農(nóng)桿菌識(shí)別及附著過程中,有許多基因和蛋白質(zhì)的參與。在農(nóng)桿菌體內(nèi)有一些染色體基因是農(nóng)桿菌植物互作所必需的,稱為染

45、色體毒性基因(Chro moso mal virulence ,chv) 。已發(fā)現(xiàn)10個(gè)這樣的基因, 它們是chvA,chvB, pscA (ex oC) , chvD, chv E, chv G, chv I,acv以及at t R和cel。在農(nóng)桿菌附著過程中,其染色體上的at t R, ch rA, chvB, pscA和cel 等基因所編碼的蛋白質(zhì)可能參與此過程13,14。其中at t R基因與大腸桿菌的一些膜蛋白或A TP結(jié)合蛋白基因具有同源性,但其產(chǎn)物尚不清楚。at t R只與細(xì)菌的附著有關(guān),并不參與T - DNA的轉(zhuǎn)移。chvA 和chvB缺失時(shí),細(xì)菌將不能合成1 . 2 -環(huán)葡聚

46、糖,表明其編碼是與1 . 2 - 環(huán)葡聚糖合成有關(guān)的蛋白質(zhì),并推測(cè)1 . 2 - 環(huán)葡聚糖可能是農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞所必需的。chvB定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。chvA 和chvB 與at t R不同, 其缺失會(huì)影響細(xì)胞遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。chvA 和chvB缺失突變體無(wú)論用共培養(yǎng)還是真空滲入法都不能轉(zhuǎn)化擬南芥15。pscA 基因可能編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶,與胞外多糖合成有關(guān)。ChvD蛋白含有保守A TP/ GTP結(jié)合的區(qū)域,其功能尚不清楚。Chv G、chv I蛋白可能對(duì)農(nóng)桿菌在植物傷口組織酸性環(huán)境下的存活有關(guān)。ceL 是與纖維素合成有關(guān)的基因,可能參與附著過程中細(xì)菌表面的成囊過程。2 . 2農(nóng)桿菌對(duì)特異的

47、植物信號(hào)分子的感應(yīng)最近的研究資料證實(shí),額外的植物細(xì)胞表面分子可能對(duì)農(nóng)桿菌的結(jié)合起重要作用。例如,對(duì)2種擬南芥生態(tài)型B1 - 1和Petergof ,以及2個(gè)WS生態(tài)型的T - DNA插入突變型rat1和rat3(Resistant to Agrobacterium t ransformatio n)的研究表明:農(nóng)桿菌不能結(jié)合到它的根外植體上 16 ,17 。雖然在B1 -1和Petergof 中影響農(nóng)桿菌結(jié)合的基因還不得而知,但rat1和rat3突變已經(jīng)知道是它們分別影響了一種為arabinogalactan的蛋白(A GP)和一種細(xì)胞壁蛋白。然而,雖然rat1 和rat2、B1 - T和Pe

48、tergof對(duì)農(nóng)桿菌感染屬難以轉(zhuǎn)化物種(recalcit rantspecies) ,但它們的雌配子仍然保持可轉(zhuǎn)化性 18 。這一結(jié)果表明,農(nóng)桿菌不同植物組織的附著與植物細(xì)胞表面不同蛋白有關(guān)。植物滲出物對(duì)農(nóng)桿菌毒性基因的轉(zhuǎn)錄激活及農(nóng)桿菌的附著是必需的。特別是從植物傷口滲出的單糖及小的酚類化合物可被農(nóng)桿菌的“雙組分”(two2co mpo nent)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)所識(shí)別。象乙酰丁香酮(Acetosyringo ne ,As) 、- 羥基乙酰丁香酮等酚類化合物與植物中合成次生代謝產(chǎn)物(如木質(zhì)素、黃酮類物質(zhì)等)的苯丙烷途徑的產(chǎn)物非常類似。這些酚類小分子化合物被稱為信號(hào)分子,能夠誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的毒性基因

49、(v i r)的表達(dá)。2 . 3v i r G介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)及v i r 區(qū)基因的表達(dá)(v i r基因活化)v i r區(qū)基因在接受植物細(xì)胞產(chǎn)生的創(chuàng)傷信號(hào)分子后,首先是virA編碼一種結(jié)合在膜上的化學(xué)受體蛋白(virA) 。按照細(xì)胞感受刺激并對(duì)此作出反應(yīng)的“雙組分系統(tǒng)”學(xué)說(shuō),virA 可能是一種整合在膜上的傳感蛋白。virA直接與植物滲出物相互作用 19 。當(dāng)酚類物質(zhì)(如AS)與感應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合后,會(huì)使整個(gè)virA蛋白構(gòu)想發(fā)生變化,其C端活化。C端有激酶的功能,使蛋白質(zhì)上的組氨酸殘基發(fā)生自磷酸化作用,從而激活virA蛋白。被激活的virA蛋白可以轉(zhuǎn)移其磷酸基因至vir G蛋白。作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活

50、化v i r 啟動(dòng)子啟動(dòng)v i r 基因表達(dá)。因此, vir G在此過程中起反應(yīng)調(diào)節(jié)器的作用。chv E可大大增強(qiáng)v i r基因被AS誘導(dǎo)的效果,其產(chǎn)物chv E可結(jié)合一些單糖,也可直接與v i rA 的周質(zhì)區(qū)相互作用,以加強(qiáng)AS對(duì)vir基因的誘導(dǎo)。除此之外, v i r G蛋白也可能參與此過程。一種誘導(dǎo)v i r基因表達(dá)的酚類化合物阿魏酸(Ferulic acid)對(duì)vir H2 突變體的作用比野生型更有效,利用質(zhì)譜等方法發(fā)現(xiàn)野生型菌株的上清液中含有大量阿魏酸的去甲基化合物咖啡酸(Caffeic acid) 。因而vir H2 蛋白可能起到負(fù)調(diào)控作用 20 。2 . 4毒性蛋白作用產(chǎn)生T -

51、 DNA單鏈(T - DNA加工)v i rC、v i rD 和v i rD2 參與T - DNA單鏈的形成。v i rD1和v i rD2是v i rD基因編碼的2個(gè)產(chǎn)物,它們相互作用并具有單鏈或特異位點(diǎn)核酸內(nèi)切酶功能。virD1 蛋白是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶,可將超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳型DNA ,并起到輔助virD2 作用。virD1識(shí)別并結(jié)合到Ti質(zhì)粒- 25bp正向重復(fù)序列(T - DNA邊界)上促進(jìn)virD2 的酶解作用。體外純化的重組virD2 可單獨(dú)起作用切割單鏈的T -DNA ,但無(wú)論在體內(nèi)還是體外,切割雙鏈的T -DNA必須virD1 和virD2共同作用。virD2直接參與T -

52、DNA的形成和加工,起內(nèi)切酶作用,在T -DNA右邊界處切開,隨后virD2 通過Tyr29與切斷的T - DNA 5末端共價(jià)連接,避免核酸外切酶降解T - 鏈。此過程需DNA解旋酸參與, virD2- T -DNA釋放需復(fù)制酶作用,以未切斷的頂鏈為模板,從右向左復(fù)制合成新的T - DNA。當(dāng)復(fù)制到左邊時(shí), T - DNA 釋放 21 。在Ti質(zhì)粒的T - DNA區(qū)留下的底鏈空缺隨后被細(xì)菌的DNA合成酶及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行修復(fù), Ti 質(zhì)粒復(fù)原。釋放的T - DNA在virD2連接下形成單鏈的DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合體未成熟的T - 復(fù)合體(Immat ure T - co mplex) 。virD2C

53、 -末端保證切割反應(yīng)的準(zhǔn)確性和有效性,而virD2整體可能作為引導(dǎo)子引導(dǎo)T - DNA鏈從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。virC(章魚堿Ti質(zhì)粒含virC1 和virC2)蛋白結(jié)合到T - DNA右邊界的驅(qū)動(dòng)子序列上,促進(jìn)virD2的酶解剪切作用,提高轉(zhuǎn)移效率。2 . 5毒性蛋白轉(zhuǎn)移復(fù)合體的形成及T - DNA和毒性蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)(T - DNA轉(zhuǎn)移)vir E作為一種DNA結(jié)合蛋白,與單鏈T -DNA有很高的親合力,能與任何單鏈DNA序列結(jié)合。vir E2突變體的致病性顯著降低,由乙酰丁香酮誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌細(xì)胞中vir E2 蛋白大量積累 22 ,因而vir E2在T - DNA轉(zhuǎn)移過程中可能起著重要

54、作用。有觀點(diǎn)認(rèn)為T - DNA鏈形成后使全身被vir E2 蛋白包裹形成一種半剛性中空?qǐng)A柱形的絲狀螺旋結(jié)構(gòu)的T -復(fù)合體 23 。T -復(fù)合體這種結(jié)構(gòu)有利于保護(hù)T- DNA鏈免受細(xì)胞中核酸酶的降解 24 ,并促進(jìn)其進(jìn)入宿主細(xì)胞核中。vir E能夠防止核酸外切酶降解T -鏈,而且vir E2的C -末端含有2個(gè)核定位信號(hào)(Nuclear - localizatio n Signal ,NL S)可以協(xié)助T -復(fù)合物到植物細(xì)胞核的運(yùn)輸。但T鏈形成后的轉(zhuǎn)運(yùn)形式目前還不清楚,vir E2的結(jié)合及作用位點(diǎn)也還存在爭(zhēng)議。T - DNA的轉(zhuǎn)移及vir E2 的結(jié)合可能發(fā)生在細(xì)菌細(xì)胞中 25 ,也可能發(fā)生在宿

55、主細(xì)胞質(zhì)中,即T - DNA轉(zhuǎn)移與vir E2 的轉(zhuǎn)移,是2個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過程,vir E2 可能是在T - DNA轉(zhuǎn)化過程中由細(xì)菌產(chǎn)生后不與T - DNA鏈結(jié)合形成復(fù)合體,而是單獨(dú)地轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生作用 25 ,26 。vir E2 還可能與另外一種毒性蛋白vir E1 結(jié)合成復(fù)合體形式轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。vir E1是一種特異的陪伴蛋白(分子伴侶) ,它可以幫助vir E2 以合適的形態(tài)運(yùn)輸?shù)街参锛?xì)胞。vir E1 能防止vir E2 與T - DNA鏈結(jié)合 27 ,當(dāng)復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)后,vir E2和vir E1才分離開。2 . 6成熟T -復(fù)合物的形成及其核輸入當(dāng)T - DNA進(jìn)入植

56、物細(xì)胞質(zhì)成為成熟的T -復(fù)合物后,細(xì)菌致病蛋白vir E2 和virD2 與植物蛋白相互作用,將T - DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。virD2和vir E2 在T -復(fù)合物和輸入中的作用可以通過以下的實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。隨帶缺少核定位信號(hào)(NL S)的virD2突變體的農(nóng)桿菌株,其腫瘤發(fā)生和T - DNA的表達(dá)受到抑制。此外,也可被體外組裝的vir E2-ssDNA復(fù)合物(而不僅僅是ssDNA)注入到活的植物細(xì)胞 28 的這種核輸出所證實(shí) 29 ,30 。在宿主植物細(xì)胞中,virD2 和vi E2 可能與細(xì)胞內(nèi)因子相互作用介導(dǎo)T -復(fù)合物的核輸入并整合到宿主基因組。通過酵母雙雜交系統(tǒng)已鑒定出環(huán)親合素(

57、Cyclop hilin、2C絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP2C) 、輸入蛋白(Importin -,如At kap)等幾種與virD2和vir E2作用的植物蛋白。利用功能遺傳分析及共聚焦顯微鏡研究表明:V IP1在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能促成vir E2的核輸入 31 。因?yàn)閂 IP1是含有保守的亮氨酸鋅結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),與已知的動(dòng)物或酵母蛋白質(zhì)沒有明顯的同源性,表明它是一種與植物特異的vir E2 的核輸入有關(guān)的細(xì)胞因子。V IP1如何促進(jìn)vir E2的核輸入的詳細(xì)機(jī)制還不了解,但是,由于V IP1 本身定位在動(dòng)物、酵母和植物細(xì)胞中的核中,它結(jié)合到vir E2 上并轉(zhuǎn)運(yùn)到核中。在此過程中,

58、V IP1 可能與細(xì)胞的核蛋白- 如At kA P相互作用,促進(jìn)vir E2 的核輸入。V IP1 在T -復(fù)合物的核輸入中的作用與所觀察的結(jié)果是一致的,即V IP1其本身不能與ssDNA聯(lián)系,但能與vir E相互作用,而vir E與ssDNA相結(jié)合,因此在體外形成一種V IP1 - vir E2 - ssDNA的三級(jí)復(fù)合體形式。最近, Tzfira 32 ,33 等證實(shí)V IP1 在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的過量表達(dá)能明顯提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的效率。除At kA P和V IP1外,在其他系統(tǒng)中的核輸入中要求一種小GTP酶- GTPase Ran 34 ,35 ,它很可能參與T -復(fù)合物的核輸入。2 . 7T - DNA整合到植物基因組T - DNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組,是轉(zhuǎn)化過程中最重要也最關(guān)鍵的步驟。雖然已知T - DNA在宿主細(xì)胞核中是轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA的,但T - DNA是以雙鏈還是單鏈分子的形式整合還存在爭(zhēng)論。有趣的是大多數(shù)侵入的T - DNA分子并不能整合到宿主基因組中。然而, T - DNA 的整合效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于通過非農(nóng)桿菌介導(dǎo)如基因槍等轉(zhuǎn)化方法的整合效率。這可能與T -復(fù)合物白組分virD2 和vir E2的活性有關(guān)。virD2 和vir E與宿主細(xì)胞核的輸入及DNA的修復(fù)機(jī)制有關(guān),并促進(jìn)T - DNA的核輸入及整合。virD2在整合過程中具有雙重作