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1、淀粉酶活性的測定一、實驗?zāi)康拿傅幕盍κ敲傅闹匾獏?shù),反映的是酶的催化能力,因此測定酶活力是研究酶的基礎(chǔ)。酶活力由酶活力單位表征,通過計算適宜條件下一定時間內(nèi)一定量的酶催化生成產(chǎn)物的量得到。淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類酶的總稱。-淀粉酶是一種典型的內(nèi)切型淀粉酶,主要作用于淀粉水解的液化階段,因此又叫液化酶。作為一種最重要的工業(yè)酶制劑,-淀粉酶廣泛存在于動物,植物和微生物中。其中,微生物-淀粉酶以其經(jīng)濟(jì)易得成為工業(yè)生產(chǎn)主要來源。目前,關(guān)于-淀粉酶活性的測定方法很多種。 本實驗采用楊氏改良法測定-淀粉酶;掌握測定-淀粉酶活性大小與溫度關(guān)系的方法,通過分析得出酶的最適溫度范圍。二、實驗原理酶促反應(yīng)中
2、,反應(yīng)速度達(dá)到最大值時的溫度和pH值稱為某種酶作用時的最適溫度和pH值。溫度對酶反應(yīng)的影響是雙重的:一方面隨著溫度的增加,反應(yīng)速度也增加,直至最大反應(yīng)速度為止;另一方面隨著溫度的不斷升高,而使酶逐步變性從而使反應(yīng)速度降低,其變化趨勢呈鐘形曲線變化。 不同菌株產(chǎn)生的酶在耐熱性、酶促反應(yīng)的最適溫度、PH、對淀粉的水解程度,以及產(chǎn)物的性質(zhì)等均有差異。-淀粉酶屬水解酶,作為生物催化劑可隨機(jī)作用于直鏈淀粉分子內(nèi)部的-1,4糖苷鍵,迅速地將直鏈淀粉分子切割為短鏈的糊精或寡糖,使淀粉的粘度迅速下降,淀粉與碘的反應(yīng)逐漸消失,這種作用稱為液化作用,生產(chǎn)上又稱-淀粉酶為液化淀粉酶。-淀粉酶不能水解淀粉支鏈的-1,
3、6糖苷鍵,因此最終水解產(chǎn)物是麥芽糖、葡萄糖和-1,6鍵的寡糖。 本實驗通過淀粉遇碘顯藍(lán)色,淀粉含量越高,顏色越深。用分管光度計檢測顯色效應(yīng)大小,通過分管光度值計算酶活力注意:實驗中為了消除非酶促反應(yīng)引起的淀粉水解帶來的誤差,每組實驗都做了相應(yīng)的對照實驗,在最終計算酶的活性時以測量組的值減去對照組的值加以校正。在實驗中要嚴(yán)格控制溫度及時間,以減小誤差。并且在酶的作用過程中,三支測定管及空白管不要混淆。三、材料、試劑與儀器實驗材料:-淀粉酶儀器:分光光度計、電熱恒溫水浴鍋、小臺秤、研缽、玻璃儀器若干試劑: 0.4M NaOH/0.4M CH3COOH及0.1M HCl: 0.005%工作碘液:0.
4、5克I2和5.0克KI水中研磨,定容至1000mL; 1%糊化淀粉溶液:稱取1.0克淀粉,加入25mL0.4M NaOH,605min,冷卻后加25mL0.4M CH3COOH,定容至100mL; 稀釋-淀粉酶溶液:待測樣品 四、實驗步驟 10mL1%淀粉溶液加入試管中,室溫25/45/65保溫10min于每管中各加酶稀釋液1mL,在室溫25/45/65恒溫水浴中(水浴溫度的變化不應(yīng)超過±0.5)準(zhǔn)確加熱10min,冷卻。加1mL1M鹽酸終止反應(yīng)。 取上述混合液1mL加入預(yù)先裝好10mL工作碘液的試管,搖勻。 660nm測吸光度(蒸餾水調(diào)零),記錄數(shù)據(jù)。(注:吸光度測定勿漏空白對照組)對照組為不加酶液,加相應(yīng)體積的水五、數(shù)據(jù)整理及計算溫度()254565OD660對照組OD0660 根據(jù)以上的數(shù)據(jù)整理的結(jié)果,結(jié)合以下公式計算兩種淀粉酶的活性:酶活=(D0-D)*100/D0*10*稀釋倍數(shù)D反應(yīng)混合液吸光度D0對照組吸光度100系數(shù)(%)10
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