流式細胞儀培訓手冊

1、流式細胞儀培訓手冊序論學習儀器的最好方法是操作儀器，然而在理解原理的基礎(chǔ)上進行儀器操作無疑會起到事半功倍的作用。本書介紹了流式細胞儀的基本知識，并從不同角度詳盡闡述了各種臺式機（FACScanTM，F(xiàn)ACSortTM，F(xiàn)ACSCaliburTM，和BD LSR）及大型機（FACS VantageTM，F(xiàn)ACSVantageTM SE，和FACStarPLUSTM）之間的不同。閱讀本書有助于增強讀者操作儀器的動手能力和經(jīng)驗。目錄第1章 綜述4第2章 液流系統(tǒng)第3章散射光信號及熒光信號3.1 散射光信號3.2 熒光信號3.3 熒光補償?shù)?章光電系統(tǒng)4.1 光平臺4.2 光學濾片4.3 信號探測器4

2、.4 閾值第5章數(shù)據(jù)分析5.1 數(shù)據(jù)采集及顯示5.2 設(shè)門5.3 細胞亞群的數(shù)據(jù)分析5.4 流式細胞儀其它應(yīng)用的數(shù)據(jù)分析5.5 CellQuest軟件使用5.6 MutiSet軟件使用5.7 Simultest軟件使用5.8 B27軟件使用5.9 WinMDI軟件使用5.10 FACSPress軟件使用5.11 System II軟件使用5.12 MultiCycle軟件使用5.13 Modfit使件使用第6章流式基本檢測項目6.1 淋巴細胞亞群檢測 （雙色、三色、四色，三種軟件分析）6.2 B27的檢測6.3 血小板抗體檢測 6.4 網(wǎng)織血小板及紅細胞分析 6.5 干細胞檢測 6.6 DNA

3、倍體分析 6.7 凋亡檢測第7章分選6.1 分選第8章激光器及光路校正7.1 激光器的工作原理7.2 光路校正第9章答案第一章 綜 述流式細胞術(shù)是一項快速檢測分析單個粒子多物理特性的高技術(shù)，通常指細胞通過激光束時在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以及相對的熒光強度。通過光電系統(tǒng)記錄細胞的散射光信號和熒光信號可得知細胞特性。流式細胞儀主要由三部分組成：流動室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下：·液流系統(tǒng)：依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)。·光路系統(tǒng)：細胞由激光激發(fā)，通過光學濾片產(chǎn)生光信號，并傳送到相應(yīng)的探測器。·電系統(tǒng)：把光信號轉(zhuǎn)換為電信號

4、。對于有分選裝置的儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。在流式細胞儀中，細胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細胞都適用于流式分析。在實際工作中，用實體組織進行流式細胞分析往往是不可能的，分析之前必須對其進行分解。被液滴包繞的粒子稱為細胞液柱，當粒子經(jīng)過激光照射區(qū)時，通過激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。含有熒光的粒子就會表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)（相應(yīng)的透鏡，濾片和探測器）收集。分光器和濾光片引導散射光和熒光至相應(yīng)的探測器，把光信號轉(zhuǎn)換為電信號。單個粒子通過其表現(xiàn)出的光散射和熒光屬性，通過列表模式（List mode）完成數(shù)據(jù)采集，并對樣本中的細胞亞群進行

5、分析。圖1-1 散射光和激發(fā)光信號轉(zhuǎn)換成為計算機可處理的充電脈沖習題：概覽1 流式細胞儀可測量細胞或粒子的哪些屬性？2 大多數(shù)流式細胞儀使用何種光源？3 流式細胞儀的三大系統(tǒng)是什么？4 哪種類型的生物樣本最適于做流式細胞分析？5 液流包繞細胞形成？6 帶有熒光的細胞通過激光束時，會產(chǎn)生哪兩種光信號？7 由粒子激發(fā)的光由 收集。8 所有流式細胞測量是在單個細胞上同時進行嗎？（對錯）9 在進行流式分析之前粒子必須是單個細胞懸液嗎？（對錯）第二章液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中心。而且在特定時間內(nèi)，應(yīng)該只有一個細胞或粒子通過激光束。因此

6、，必須在流動室內(nèi)把細胞注入鞘液流。流動室是液流系統(tǒng)的核心部件，臺式機中流動室稱為樣品槽，大型機稱之為噴嘴。在流動室內(nèi)細胞液柱聚焦于鞘液中心，細胞在此及激光相交。流動室內(nèi)充滿鞘液，根據(jù)層流原理，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱。這種同軸流動的設(shè)計，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態(tài)，這個過程稱為流體聚焦。該原理適用于所有流動室，如圖2-1和2-2所示：圖2-1 細胞液柱通過樣品槽產(chǎn)生流體聚焦，圖2-2 細胞液柱通過噴嘴產(chǎn)生流體聚焦樣本壓力和鞘液壓力是不同的，且樣本壓力總是大于鞘液壓力。樣本壓力調(diào)節(jié)器通過改變樣本壓力的方法控制樣本流速。&#

7、183;臺式機：單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出，粒子或細胞在流動室內(nèi)及激光相交（圖2-1）。除BD LSR型臺式機有樣本壓力細調(diào)旋鈕外，大多數(shù)臺式機都采用固定的樣本壓力（分低，中，高速）。·大型機：單個細胞懸液從噴嘴噴出后，粒子或細胞在流動室外及激光相交（圖2-2）。且樣本壓力連續(xù)可調(diào)。增加樣本壓力就是通過加寬液柱的方法增加樣本流速。換言之，在特定時間內(nèi)，允許更多細胞通過液流。當液柱變寬時，一些流經(jīng)激光束的細胞會偏離中心，光斑也會偏離理想角度，這在一定程度下是允許的。·高流速適用于定性測量，如免疫表型。樣本流變寬，細胞間距離縮短，這樣在單位時間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細

8、胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。·低流速促使樣本流變窄，單個細胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細胞可流經(jīng)激光束的中心，細胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測分辨率要求高的實驗，如DNA分析。為確保粒子和細胞完全通過激光束，正確調(diào)節(jié)樣本壓力對實驗操作是至關(guān)重要的。習題：液流系統(tǒng)1 流式細胞儀中液流系統(tǒng)的作用是什么？2 細胞流經(jīng)激光束時影響激光照射細胞的兩個因素是什么？3 在特定時間內(nèi)，應(yīng)該有多少細胞流過激光束？4 單個細胞懸液在 內(nèi)注入 。5 鞘液環(huán)包樣品并使之居中的過程稱為 效應(yīng)。6 什么調(diào)節(jié)器可以控制細胞液柱的寬窄？7 對于臺式機，樣本的固定壓力是多少。8 增加樣本壓力，也就是

9、 樣本流速和液柱。9 DNA研究對檢測分辨率要求較高，推薦流速為多少。10 加大流速會降低檢測分辨率。（對錯）11 定性檢測時可使用高流速。（對錯）第三章散射光信號和熒光信號的檢測上一章我們了解到粒子或細胞是如何依次通過液柱的，本節(jié)我們首先學習激光如何照射在單個細胞上的。3.1散射光信號粒子折射激光產(chǎn)生散射光信號。散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù)（如染色），因此被稱為細胞的物理特性，即細胞的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。散射光及細胞膜，核膜以及細胞結(jié)構(gòu)的折射性、顆粒性密切相關(guān)，細胞形狀和表面形貌也對其產(chǎn)生影響。前向角散射：前向角散射（FSC）光及被測細胞的大小和面積有關(guān)，檢測的是激光束照射方向及收集散射光

10、信號的光電倍增管軸向方向的散射光信號（見圖3-1）。FSC不受細胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號處理。側(cè)向角散射：側(cè)向角散射（SSC）光及被測細胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感（見圖3-1）。SSC收集及激光束正交90度方向的散射光信號。圖3-1 細胞的光散射特性上述兩種信號都是來自于激光原光束，目前采用這兩個參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類的細胞亞群，同時可獲得細胞相關(guān)的重要信息，下圖（圖3-2）為FSC和SSC組成的二維散點圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細胞、單核細胞及粒細胞區(qū)分開。圖3-2 FSC、SSC二維散點圖習題：散射光信號1 什么時候會發(fā)生

11、光散射現(xiàn)象。2 光散射信號及細胞的哪些特性有關(guān)。3 及激光束方向相同的光散射稱為 散射。4 FSC及細胞的哪些特性相關(guān)？5 及激光束方向呈90度角的光散射稱為 散射。6 SSC及細胞的 和 相關(guān)。7 和 雙參數(shù)的組合可區(qū)分不同種類的細胞亞群。3.2 熒光信號熒光物質(zhì)吸收符合其波長范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過剩能量成為光子。這種能量的轉(zhuǎn)換稱為熒光。能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長范圍稱為激發(fā)光譜。因為更多的能量消耗在吸收轉(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。熒光物質(zhì)的發(fā)射波長范圍叫做發(fā)射光譜。目前的流式細胞儀大多采用氬離子激光器，因為488nm

12、的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光（詳見第7章）。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號愈強。FITC的激發(fā)光譜如圖3-3所示，488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時會表現(xiàn)出最強熒光信號，而當FITC被其波譜范圍內(nèi)的其它波長激發(fā)時，也會檢測到熒光，但信號強度不會這么高。圖3-3 FITC、PE、PerCP、APC染料的激發(fā)光譜如果激發(fā)光波長都是488nm，而發(fā)射光波長又不是極其接近的話，我們可以同時檢測兩種以上的熒光。如FITC和PE雙染就符合這種條件。這兩種熒光素的發(fā)射光譜如圖3-4所示。雖然PE的激發(fā)光譜的峰值不是488nm，但也足以檢測到熒光。

13、更重要的是，F(xiàn)ITC的發(fā)射光波長是530nm，PE的發(fā)射光波長是570nm。他們的發(fā)射光波長足夠遠，可以使用不同的檢測器。被檢測到的熒光信號數(shù)量及粒子中標記上的分子數(shù)量成正比。圖3-4 FITC、PE、PerCP、APC染料的發(fā)射光譜圖3-5 熒光標記抗體對細胞表面抗原的特異性結(jié)合對單克隆抗體進行熒光染色，通過分析細胞表面抗原標記確認細胞類型（見圖3-5）。在細胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細胞亞群。每個亞群的染色模式及FSC和SSC數(shù)據(jù)相結(jié)合，用于識別樣本中的細胞種類，并可以得到各細胞亞群的百分含量。而且，還可以對感興趣的細胞進行再分選。3.3熒光補償使用流式細胞儀進行多色分析時

14、，由于熒光發(fā)射光譜的重疊，需要做補償調(diào)整在流式細胞儀上進行多色免疫熒光分析時，使用的不同熒光素的發(fā)射光譜有重疊現(xiàn)象，如果不對這種現(xiàn)象做適當?shù)恼{(diào)整，就會導致某一熒光素發(fā)出的熒光被其它“錯誤”的檢測器檢測到。這種由于補償問題導致的錯誤，會得到假陽性的錯誤結(jié)果，并可能在等高圖的多色分析時，得到錯誤的細胞群體。這里，我們可以通過使用恰當?shù)膯稳净螂p染的樣本，對補償加以調(diào)整，去除光譜重疊部分的影響信號，就可以準確地在流式細胞儀上進行細胞多色分析了。單克隆抗體偶聯(lián)上熒光素fluorescein isothiocyanate（FITC）、R-phychoerythrin（R-PE）以及Cy-Chrome，就可

15、以用來檢測某一細胞群的多種抗原特性了。在做這樣的多色分析時，使用同一波長的激發(fā)光（488nm），即15毫瓦氬離子激光。FITC的發(fā)射光為綠色熒光（峰值為530nm），信號被FL1檢測器檢測；R-PE的發(fā)射光為橙紅色熒光（峰值為575nm），信號被FL2檢測器檢測；Cy-Chrome的發(fā)射光為紫紅色熒光（峰值為670nm），信號被FL3檢測器檢測。但是，F(xiàn)ITC的發(fā)射光譜有橙紅色光，而R-PE的發(fā)射光譜也有綠色光，等等，依次類推。這些光譜的交叉重疊，會導致熒光信號被相應(yīng)檢測器以外的錯誤的檢測器探測到。因此，要使用補償?shù)霓k法校正這種信號重疊導致的錯誤。它通過電子補償?shù)霓k法，來去除重疊信號的影響，通

16、過電子補償，使檢測到的單染細胞的另外兩種熒光信號及未染色細胞的信號水平相同。補償不足或補償設(shè)置不當，都會導致假陽性結(jié)果或人為造成直方圖的偏移。例如，在多色分析中，如果熒光染色細胞的補償設(shè)置不足，就可能在雙色等高圖上顯示出一個假的雙陽性群體，導致數(shù)據(jù)分析失誤。在三色熒光分析時，為了防止由于補償造成的錯誤，應(yīng)該使用單染細胞調(diào)整補償（另外兩種熒光為陰性對照），即用每一個熒光抗體單染細胞，然后調(diào)整每兩種顏色之間的補償。雙色分析時，可以使用兩個互斥的單陽性抗體，通過兩種單陽性細胞群體和雙陰性群體來調(diào)整補償。為了使測定結(jié)果標準化，并達到長期檢測儀器性能的目的，應(yīng)該每日使用標準熒光微球和自動的定標/補償軟件

17、，做熒光補償?shù)某醪秸{(diào)整。流式細胞儀多色分析的補償調(diào)整步1 根據(jù)實驗室要求，每日做儀器校正（calibration/standardization）。2 檢測一個未染色樣本（自發(fā)熒光），調(diào)整前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC設(shè)置，使測定細胞群體顯示好，并可以按要求設(shè)門。3 設(shè)門后，調(diào)整自發(fā)熒光的FL1、FL2、FL3的電壓設(shè)置（detector settings），在對數(shù)模式下，使自發(fā)熒光位于熒光直方圖的左側(cè)（101以內(nèi)）。比較自發(fā)熒光和陽性細胞的熒光強度，保證每個熒光的陽性水平都可以按比例顯示。4 使用熒光抗體逐個染色（單染），運行單染樣本，調(diào)整補償。監(jiān)測雙色點圖，調(diào)整補償設(shè)置（compe

18、nsation settings），使染色陽性細胞和未染色陰性細胞在橫軸水平，在縱軸垂直。例如，對于PE標記的單克隆抗體染色的細胞群，上下調(diào)整FL1-%FL2的設(shè)置，使FL2陽性群體及FL2陰性群體上下垂直（FL2 vs FL1點圖）；然后，使用FITC標記的單克隆抗體染色的細胞群，左右調(diào)整FL2-%FL1的設(shè)置，使FL1陽性群體及FL1陰性群體左右水平（FL2 vs FL1點圖）。然后，再依次調(diào)整第三色補償FL2-%FL3和FL3-%FL2。5 使用雙色補償質(zhì)控樣本，微調(diào)補償。用FITC和PE單克隆抗體，PE和Cy-Chrome單克隆抗體染色，最好使用單克隆抗體和同型對照染互斥的單陽性細胞群

19、體?？梢詫煞N單染細胞混合，用一個樣本管進行雙色補償調(diào)整（如混合FITC和PE染色細胞），在缺少互斥標記的情況下，可以使用此方法。每一種細胞群體應(yīng)位于相應(yīng)的象限。在某些流式細胞儀上，F(xiàn)L1和FL3不能直接進行補償。因此，做雙色分析時，不需要做FITC/Cy-Chrome補償對照管。6 檢查三色熒光染色的細胞群，在前面的步驟里，已經(jīng)做好了補償，因此，這里就不需要再調(diào)整了。7 獲取樣本的對照管和實驗管，并保存數(shù)據(jù)文件。8 每一個多色分析的實驗，都需要進行補償?shù)恼{(diào)整。因此，每做一種多色分析的實驗，都要用單染和雙染對照樣本，按照3-7步做實驗條件的調(diào)整。為了減少不同試劑間的熒光條件的調(diào)整，在開始調(diào)整補

20、償時，首先應(yīng)選擇各熒光通道中染色最強的試劑/細胞。習題：熒光信號1 當熒光物質(zhì)吸收激光能量，并釋放過剩能量時，會發(fā)射 。2 熒光物質(zhì)能被激光激發(fā)出熒光的波長范圍稱為 。3 由熒光染料發(fā)射的波長稱為 。4 在流式細胞儀中通常采用什么激光器。5 能夠激發(fā)FITC和PE的波長是多少。6 流式細胞儀最常用的兩種熒光素是 和 。7 熒光素標記抗體用于檢測 。第四章光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)由光學激發(fā)器和光學收集器組成。光學激發(fā)器包括激光和透鏡，透鏡用于形成激光束，并使之聚焦。光學收集器則由若干透鏡組成，用于收集粒子發(fā)射的光束-激光束相互作用，透鏡組和濾片發(fā)送激光束至相應(yīng)的光學探測器。光平臺的設(shè)計可實現(xiàn)以上功能。4

21、.1 光學平臺流式細胞儀的光平臺提供了一個固定平面，將激光源、光學激發(fā)器和收集器控制在一個固定的位置。因而臺式機的流動室和光路是固定的，能夠保證光斑和樣本流自始至終保持恒定。圖4-1和圖4-2分別為臺式機FACS Calibur 和BD LSR 的光平臺系統(tǒng)。圖4-1 臺式機FACS Calibur 光平臺系統(tǒng)圖4-2 臺式機BD LSR光平臺系統(tǒng)在大型機中，當液流流過噴嘴時，激光束通過消色差透鏡組以最佳角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置會發(fā)生變化，所以大型機的光路沒有臺式機穩(wěn)定，需要每日優(yōu)化。光路不正有可能導致粒子受激光照射的能量不均一，從而被激發(fā)出的熒光強度也不相同，造成測量誤差。大型

22、機的光平臺系統(tǒng)見圖4-3。圖4-3 大型機FACS Vantage SE 光平臺系統(tǒng)習題：光學平臺1 光平臺為激光器及 提供了一個固定平面。2 保證所有細胞受到均一的光照強度的兩個必要條件是什么。3 每次使用大型機時都需要進行光路校正（對錯）。4 在臺式機中，固定的 能夠保證激光截取 的位置是不變的。4.2 光學濾片當細胞或粒子流過激光照射區(qū)時，SSC和熒光信號很弱，需要使用光電倍增管（PMTs）收集，而FSC信號很強，由光電二極管收集即可。所有信號經(jīng)由透鏡組和濾片組到達相應(yīng)的檢測器。光電倍增管（PMTs）檢測到的熒光信號常常是很微弱的。在光電倍增管（PMTs）前設(shè)置濾片可以使相當窄的一波長范

23、圍內(nèi)光通過，提高了熒光信號的純度和強度，因而每個檢測器只有一種指定波長的熒光信號進入而被檢測，使光譜帶寬接近熒光染料的發(fā)射峰值。這種濾片稱為帶通（BP）濾片。如：FITC檢測器前的濾片標志為530/30，其含義是光譜發(fā)射波長：530±15nm，或者說允許通過的波長范圍在515nm和545nm之間。BP 500/50則表示其允許通過波長范圍為475nm-525nm。流式細胞儀中常用的濾片還有長通濾片（LP）和短通濾片（SP），長通濾片使特定波長以上的光通過，特定波長以下的不通過。如LP500濾片，將允許500nm以上的光通過，而500nm以下的光吸收或返回。短通濾片及長通濾片相反，特定

24、波長以下的光通過，特定波長以上的光吸收或返回。（見圖4-4）。分光器的主要作用是完成光的收發(fā)。二色性反射鏡就是其中一種。560短通二色性反射鏡如圖4-1所示發(fā)射560nm或小于560nm的波長（如圖4-1所示）。大于560nm的波長被反射。圖4-4 光線通過長通濾片、短通濾片及帶通濾片的波長范圍習題：光學濾片1 檢測器前放置濾片作用是什么。2 帶通濾片530/30發(fā)射的波長范圍是 到。3 用于選擇性地通過特定波段熒光并將另一波段熒光反射至合適的探測器中。4 濾片允許特定波長及以下的光通過，而 濾片允許特定波長及以上的光通過。4.3 光電探測器處在液流中的粒子通過激光束時產(chǎn)生光信號，這些光信號通

25、過光電探測器轉(zhuǎn)換成電信號（電壓），然后到相應(yīng)的通道。BD流式細胞儀有兩種類型的光電探測器：光電二極管和光電倍增管（PMTs）。光電倍增管（PMTs）對光信號比光電二極管敏感，所以前者用于檢測較弱的SSC信號和熒光信號；后者用于檢測較強的FSC信號。粒子進入照射區(qū)開始散射光或熒光時產(chǎn)生充電脈沖，首先光信號或光子由光電倍增管（PMTs）或光電二極管轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號，產(chǎn)生電流，電流經(jīng)由放大器，轉(zhuǎn)換成充電脈沖。當粒子位于激光束正中時，脈沖最大，熒光最強。當粒子偏離激光束時，脈沖回到基線（如圖4-5所示）。圖4-5 充電脈沖的產(chǎn)生充電脈沖的大小取決于光電倍增管前置放大器獲得的光子數(shù)量，放大器可設(shè)置為線

26、性放大或者對數(shù)放大（Lin或Log）。對數(shù)放大（Log）常常用于把陰性信號從微弱的陽性信號中分離出來；而線性放大（Lin）通常用于放大散射光信號和熒光信號。充電脈沖通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器把0-1000mV的脈沖轉(zhuǎn)換成為代表0-1,000mV通道的數(shù)值。通道數(shù)值經(jīng)由輸入輸出（GPIO）數(shù)據(jù)線傳送到計算機進行處理顯示（見圖4-6）。圖4-6 模擬信號到數(shù)字信號的轉(zhuǎn)換過程習題：光電探測器1 收集FSC光信號。2 敏感度高的 收集SSC光信號和熒光信號。3 探測器產(chǎn)生電流，經(jīng)由放大器轉(zhuǎn)換成電壓。（對錯）4 模數(shù)轉(zhuǎn)換器（ADC）的作用。4.4 閾值閾值用于設(shè)置低于該道值的信號不被處理，只有高于等于閾值道數(shù)的信號

27、才會被送入計算機進行處理。每次只能有一個設(shè)閾參數(shù)。如：對免疫表型實驗，閾值應(yīng)設(shè)為FSC，以消除低于閾值道數(shù)的碎片。用戶可根據(jù)實驗要求設(shè)置其它參數(shù)的閾值。第二個閾值適用于配有兩個激光器的臺式機。如果設(shè)置了兩個閾值，那么粒子必須同時滿足兩個閾值的要求才會被當作信號細胞處理。習題：閾值1 FSC閾值用于消除 信號。2 如果設(shè)置兩個閾值，細胞必須符合其中一個閾值的要求才會被當作信號細胞處理。（對錯）第五章 數(shù)據(jù)分析5.1 數(shù)據(jù)采集及顯示光信號轉(zhuǎn)換成電壓脈沖后，再通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成為計算機能夠儲存處理的數(shù)字信號。流式細胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標準格式存儲，該標準由“分析細胞學協(xié)會”制定。根據(jù)FSC標準，數(shù)據(jù)

28、存儲格式應(yīng)包括三個文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設(shè)置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。4參數(shù)（FSC，SSC，F(xiàn)ITC和PE）的單細胞分析會生成8位數(shù)據(jù)。當單個樣品累計收集到10000個細胞時，F(xiàn)CS數(shù)據(jù)文件為80kB。數(shù)據(jù)采集存儲完畢后，細胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數(shù)如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道。縱軸表示在該通道內(nèi)收集到的細胞數(shù)量（如圖5-1）。處在同一通道的每一細胞均符合該通道的信號值，而且具有相同的信號密度。通道右側(cè)信號的熒光強度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強。圖5-1 流式數(shù)據(jù)分析圖雙參數(shù)可在二維散點圖中同時顯示，X軸顯示通道1（FL1），Y軸顯示通道2（FL2）。

29、3維圖通過X，Y，Z三個軸分別顯示每個通道的細胞量（如圖5-1）。習題：數(shù)據(jù)采集及顯示1 在直方圖中橫軸和縱軸分別表示。2 二維點圖用于顯示 參數(shù)。3 在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表 。5.2 設(shè)門通過設(shè)門的方法可以定義細胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據(jù)FSC或細胞大小，在FSC，SSC的散點圖中設(shè)門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。圖5-2 全血樣本中淋巴細胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖習題：設(shè)門1 設(shè)門的方法通常用于分析樣本內(nèi)的指定細胞。（對錯）5.3 細胞亞群的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析包括從點圖中的list-mode文件中顯示數(shù)據(jù),然后統(tǒng)計點圖中的細

30、胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點圖用于顯示數(shù)據(jù)，而且可通過設(shè)門的方法區(qū)分指定的細胞亞群。如圖5-3所示，在淋巴細胞亞群周圍設(shè)門，以單獨分析或分選該亞群細胞。圖5-3 選定淋巴細胞亞群設(shè)門門內(nèi)細胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。在下面的實例中，我們將詳盡闡述細胞亞群百分含量的不同分析方法。我們可以通過單參數(shù)直方圖，二維點圖和三維圖來分析結(jié)果。單參數(shù)直方圖可定位邊界，二維點圖可設(shè)置象限標志。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計表以輸出結(jié)果。直方圖可直觀單個參數(shù)的細胞數(shù)量。陰性對照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界（見圖5-4）。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3 FITC陽性峰。圖5-4 陰性

31、對照峰M1（NORM001）和CD3 FITC陽性峰M2（NORM002）圖5-5的統(tǒng)計結(jié)果表明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內(nèi)淋巴細胞2891個。其中M1（陰性）細胞619個，M2（CD3陽性）細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%。圖5-5 直方圖統(tǒng)計結(jié)果二維點圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個點表示一個或多個細胞。圖5-6為陰性對照圖，用于設(shè)定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區(qū)分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限（LL）為雙陰性細胞，左上象限（UL）為Y軸陽性細胞（CD19 PE），左下象限（LR）為X軸陽性細胞（

32、CD3 FITC），右上象限（UR）為雙陽性細胞（CD19+/CD3+）。圖5-6 陰性對照組(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE雙染樣本(NORM002) 如圖5-7所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43%。圖5-7 散點圖統(tǒng)計結(jié)果另一個分析方法是劃定區(qū)域，也就是設(shè)門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域（如圖5-8所示）；然后統(tǒng)計該區(qū)域內(nèi)指定細胞亞群的百分含量。在圖5-9中，R4門內(nèi)為CD4陽性，CD3陰性的淋巴細胞亞群，其結(jié)果為：40/2866=1.40%。圖5-8 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本分析圖

33、圖5-9 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果這種方法在分析不同的供體細胞時存在一個缺陷，因為如果事先定義好細胞亞群的區(qū)域或邊界，在隨后的文件中，下一個樣本的細胞亞群位置會發(fā)生變化，這就需要操作者重新調(diào)整區(qū)域或邊界位置。為避免這種情況的發(fā)生，我們采用一種稱為集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM軟件就屬于集群分析軟件。該軟件的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動，自動變換區(qū)域或邊界到相應(yīng)的細胞亞群位置（見圖5-10）。圖5-10 使用Attractors分析軟件時二維點圖的前后變化對比5.4 流式細胞儀的

34、其它應(yīng)用以及數(shù)據(jù)分析這些分析方法通常適用于計算離散細胞群的百分含量，對于分析單克隆細胞株分子是否呈陽性并不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統(tǒng)計結(jié)果遠遠大于陰性對照組，那么我們認為其結(jié)果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細胞的表達越高，陽性率越高。如圖5-11所示，左圖為單細胞群的散射光信號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。圖5-11 單細胞株分析圖除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子（接合子）定量分析

35、。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計算每個細胞的抗體結(jié)合位點數(shù)。如圖5-12所示，Y軸上的圓圈代表從標準曲線獲取的信息，用于計算每個細胞的接合點位數(shù)。圖5-12 使用QuantiCALC軟件計算每個細胞的抗體結(jié)合位點數(shù)我們使用ModFit LTTM軟件進行DNA定量分析。因為DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是離散的，所以我們對曲線以下的面積進行積分，以得到每個細胞亞群的百分含量結(jié)果。圖5-13 細胞周期的DNA直方圖習題：數(shù)據(jù)分析1二維點圖和一維直方圖的作用分別是什么？2 見圖5-4和圖5-5，CD3陰性和陽性的百分含量分別是多少。3 LL象限代表雙陽性細胞亞群。（對錯）4

36、 見圖5-6和圖5-7，淋巴細胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。5 只能使用矩形設(shè)定細胞區(qū)域范圍。（對錯）6 使用區(qū)域設(shè)定法分析樣本有哪些不足。7 避免細胞亞群移動的分析方法是什么。8 在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。5.5 CellQuest和CellQuest Pro軟件使用CellQuest和CellQuest Pro軟件是目前運用最為廣泛的流式細胞儀采集及分析軟件。它運行于蘋果電腦上，優(yōu)質(zhì)的矢量圖顯示使得操作界面特別優(yōu)美?，F(xiàn)最新的微軟公司的Vista軟件也是仿蘋果操作系統(tǒng)界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro時的強大功能及視覺質(zhì)感。C

37、ellQuest和CellQuest Pro軟件主安裝在BD FACSCalibur型流式細胞儀上。1軟件數(shù)據(jù)流程 在CellQuest和CellQuest Pro軟件的數(shù)據(jù)流分為二個部分：方案和數(shù)據(jù)包。方案是指用戶可以建立采集或分析所需的直方圖或散點圖、設(shè)門并定義門及門、門及圖之間的邏輯關(guān)系。可以使用方案進行數(shù)據(jù)采集或分析以往已有的數(shù)據(jù)。每個采集方案分析樣本后會生成數(shù)據(jù)包，該數(shù)據(jù)包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測參數(shù)上的數(shù)值，格式為FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuest Pro方案文件的圖標CellQuest和CellQuest Pro數(shù)據(jù)文件的圖標CellQue

38、st和CellQuest Pro軟件中還會有關(guān)于儀器設(shè)置的文件，保存所有的實驗條件。它只能由CellQuest和CellQuest Pro軟件打開。數(shù)據(jù)包必須由方案文件打開，無法單獨顯示，或者可由第三方軟件進行分析，如WinMDI。2.軟件及儀器的連接流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發(fā)出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。1、 先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。2、 在蘋果菜單下點擊CellQuest和CellQuest Pro軟件。3、 從Aquire菜單下選擇connet to cytometer。3方案及數(shù)據(jù)之間的關(guān)系CellQuest和C

39、ellQuest Pro軟件的方案及數(shù)據(jù)相互獨立保存，數(shù)據(jù)包可以由任一方案文件進行分析，分析后不改變數(shù)據(jù)包中的任何數(shù)據(jù)。CellQuest和CellQuest Pro軟件中方案內(nèi)的直方圖或散點圖有三種狀態(tài)：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。當圖的屬性為Acquire時，此圖只限于采集下用，即只當進行檢測時它才能顯示顆粒；當圖的屬性為Analysis時，此圖只限于分析已保存的數(shù)據(jù)包，它不能用于采集數(shù)據(jù)。當圖的屬性為Acquire-Analysis時，此圖即可用于采集數(shù)據(jù)也可用于分析已有數(shù)據(jù)。所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點圖全部設(shè)為Acquire-A

40、nalysis屬性。CellQuest Pro CellQuest4方案的建立A選擇實驗參數(shù)默認情況下，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀開機后只打開一根激光器，及五個參數(shù)供選擇使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。當我們要使用第二根激光器及FL4通道時需要勾選FL4的選項，儀器自動打開633nm激光器。選擇Four Color后，儀器自動打開第二根激光器，且此時FL4可用。B,建立散點圖或直方圖，命名坐標CellQuest Pro軟件主要工作界面，軟件類似于Office word的工作面，可在A4大小的頁面上進行編輯建立各種直方圖或散點圖。使用工具條可以建立散點圖、直方圖并在圖上設(shè)立各種門

41、。在CellQuest Pro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點圖就會出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。在CellQuest軟件下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來打開圖的屬性對話框，其中包括了關(guān)于該圖所有選項。建立好直方圖或散點圖后，我們需要對所選的參數(shù)進行命名，如不修改軟件自動命名為FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜單上選擇Acquire欄目，選擇Parameter Description，可出現(xiàn)關(guān)于文件存儲和參數(shù)命名的對話框。在這個對話框中用P字母來代表每個參數(shù)，并在此對每個采集參數(shù)進行命名

42、，F(xiàn)L1為CD3FITC，F(xiàn)L2為CD4PE。C,設(shè)門并建立門及圖之間的關(guān)系在工具欄上有左側(cè)幾個按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動門。本處重點介紹Snap-To門，它可根據(jù)細胞群體的分布自動調(diào)整門的形狀適應(yīng)細胞群體。R及G的關(guān)系R是Region的首個字母，Region一般是指一個閉合形的區(qū)域，如矩形區(qū)、自由區(qū)和圓形區(qū)。區(qū)域及區(qū)域之間可以進行邏輯運算，如AND、OR、NOT等關(guān)系。當區(qū)域進行運算時軟件引進了算術(shù)公式的管理概念：Gate實際了個代數(shù)式，簡稱G，其運算式默認如下：G1 = R1，或G2=R2當我們要進行邏輯運算時，可變更為G1=R1 AND R2。此時G1就成了一個算術(shù)結(jié)

43、果了。G1=R1 AND R2G2=R1 NOT R2G3=R1 OR R2Region List管理門，可以重命名或刪除門。Gate List是對門進行邏輯運算和標識顏色的工具。建立門及圖之間的關(guān)系打開要編輯的直方圖或散點圖的屬性對話框，選擇Gate選項，選擇門即可。D，顯示統(tǒng)計參數(shù)如何編輯這些統(tǒng)計參數(shù)選擇統(tǒng)計參數(shù)框，在Stats菜單下的Edit Statistic會變得可用，點出后出現(xiàn)統(tǒng)計參數(shù)編輯對話框。選擇任意直方圖或散點圖，在Stats下拉菜單下會有更種統(tǒng)計參數(shù)選項。對應(yīng)于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計參數(shù)。5儀器的操作當計算機及流式細胞儀聯(lián)機后便會出現(xiàn)以下采集控制框：在有關(guān)儀器操作所有控制選

44、項框都在Cytometer下拉菜單下，同時按住“蘋果”鍵及1、2、3、4便可調(diào)取所有控制框：6文件的保存及調(diào)用實驗或分析過程中所建的方案可以保存下來，通File下拉菜單可以保存這些方案文件：如要打開這些分析方案只需雙建方案圖標即可；方案可以分析以往的數(shù)據(jù)包（前提是方案中的直方圖或散點圖都已定義成Acquire-Analysis屬性），有兩種方案打開以往的數(shù)據(jù)：方法一：選擇直方圖或散點圖，打開該圖的屬性框（Plot->>Format），見下圖：在以上紅色框標注的地方選擇要分析的數(shù)據(jù)包。方法二：選中方案中所有的直方圖或散點圖，打開Plots菜單，選擇Chang Data File，打開

45、要分析的數(shù)據(jù)包。附：CellQuest Pro軟件所有下接菜單5.6 MutiSet軟件使用MultiSET是BD公司的一個全自動獲取分析軟件。它使用免洗試劑（TriTEST三色試劑或MultiTEST四色試劑）制備標本，可以用來做外周血的淋巴細胞及亞型分析，同時使用TruCOUTNT,可以進行絕對計數(shù)。MulSET設(shè)門分析，用Attractor定出淋巴細胞亞型區(qū)域。Attractor具有自動檢查細胞位置漂移的功能，并自動居中。因此，使用Mul軟件，可以提高實驗室的工作效率和計數(shù)的精確度。1. MultiSET文件生成的文件類型：Schedule Document File (【DDMMYY】

46、Sch)：日程記錄文件。 Laboratory Report File(【前綴】【輸入號】Lab)：實驗室報告，PICT文件。Physician Report File(【前綴】【輸入號】Phy)：醫(yī)生報告，PICT文件。Summary Report File（【DDMMYY】Sum）：總結(jié)報告，PICT文件。 Flow Cytometry Standard（FCS）Data File（【前綴】【輸入號】【試管編號】）： MultiSET軟件可以獲取或讀取的FCS2.0標準數(shù)據(jù)格式.Export Document File(【DDMMYY】Exp) ：文本文件,包含標本和試劑信息,以及每管的所

47、有亞群結(jié)果.2.軟件及儀器的連接 流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發(fā)出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。在蘋果菜單下點擊MultiSET軟件(或在Dock界面上點擊MultiSET).2. 進入MultiSET MultiSET命令菜單 參數(shù)預(yù)設(shè): Export Preferences:選擇輸出格式Tab或Comma;選擇報告哪些試驗結(jié)果,按Select Values to Export. Printing Preferences:選擇是否自動打印實驗室報告 Laboratory report,醫(yī)生報告Phys

48、ician report, 總結(jié)報告Summary report. Pannels Preferences:預(yù)先設(shè)定試驗項目Run a fixed panel,或任意選定試驗項目Run any panel. Events Preferences:選擇獲取細胞數(shù)量. Levey-Jennings Preferences:選擇質(zhì)控統(tǒng)計,每30個一統(tǒng)計(30runs),每60個一統(tǒng)計(60runs),或不統(tǒng)計(None)MultiSET運行程序 Sign In:輸入操作者、單位、實驗室主任,登記進入MultiSET. Set Up:建立測試要求. FACSComp:運行FACSComp,調(diào)整儀器條件

49、. Test Prefs:規(guī)定報告內(nèi)容. Samples:輸入標本及病人信息.以下程序自動運行,由MultiSET做提示: Acquisition:標本獲取.顯示點圖,以便查看標本獲取情況. Analysis:結(jié)果分析.顯示點圖,以便查看自動分析過程. Lab Report:做實驗室報告,顯示每個標本的各管結(jié)果. Phys Report:做醫(yī)生報告,顯示每個標本的結(jié)果及正常值范圍. Summary:總結(jié).對當次MultiSET的所有標本的結(jié)果做總結(jié).第一步:Sign In:MultiSET軟件的起始頁.輸入操作者姓名,單位名稱和實驗室主任名稱.儀器自動顯示流式細胞儀的序列號和型號.點擊Acce

50、pt,進入下一工作程序.第二步: Set Up:建立測試要求Data Source 選擇數(shù)據(jù)來源.From Data Files:對以前保存的數(shù)據(jù)文件做分析.From Cytometer:Acquisition and Analysis:在流式細胞儀上運行標本,獲得數(shù)據(jù)并分析.From Cytometer:Acquisition Only:在流式細胞儀上運行標本,獲得數(shù)據(jù)不分析. Entry Level Prefix 確定數(shù)據(jù)文件,實驗室報告,醫(yī)生報告等文件名前綴的使用. View Reports 選擇讀實驗室報告和醫(yī)生報告的時間. Automatic Saving Options 確定自動保

51、存的文件類型及保存位置.選擇是否保存Data Report,Physician Report,Summary Report,Export Document.按Location,選擇文件保存路徑,文件默認路徑BD Files:【DDMMYY】Folder(自動生成日期目錄).目錄名確認后,按Select DDMMYY確定,返回Set Up界面. 第三步: FACSComp:運行FACSComp,調(diào)整儀器條件 選擇Launch FACSComp,進行Lyse no wash校正. 如果當日已做校正,則選擇Skip FACSComp,第四步:Test Prefs:規(guī)定報告內(nèi)容選擇是否報告絕對計數(shù),是

52、否報告正常值范圍,以及總結(jié)報告的形式. Physicians Report Choices 醫(yī)生報告的亞群選項 Report Reference Ranges 報告正常值范圍 Laboratory Report Choices 選擇實驗室報告內(nèi)容 Summary Report ID 總結(jié)報告編號第五步:Samples:輸入標本及病人信息 輸入標本名稱Sample Name,標本編號Sample ID及病歷號Case Number. Panel Name選擇每個標本所做的項目. WBC Count 如果您需要絕對計數(shù)結(jié)果,但不用TruCOUNT絕對計數(shù)管,您需要輸入WBC計數(shù)總量和淋巴細胞百分含

53、量,或輸入淋巴細胞計數(shù)總量.注意:調(diào)用條件,打開CytometerInstrument SettingsOpen(FACStationBD FilesInstrument Settings FilesCalib 或Calib File 如果是對以前檢測的數(shù)據(jù)進行分析,點擊Add Sameple,添加數(shù)據(jù),進行分析.第六步:Acquisition:標本獲取.顯示點圖,以便查看標本獲取情況第七步: Analysis:結(jié)果分析.顯示點圖,以便查看自動分析過程.第八步: Lab Report:做實驗室報告,顯示每個標本的各管結(jié)果.注:可以點擊Manual Gate,此時可以更改點圖大小,更改坐標軸.按照需要,調(diào)整淋巴細胞門或Attractors.第九步: Phys Report:做醫(yī)生報告,顯示每個標本的結(jié)果及正常值范圍.第十步:Summary:總結(jié).對當次MultiSET的所有標本的結(jié)果做總結(jié).5.7 SimulSET軟件使用5.8 HLA-B27軟件使用 HLA-B27自動軟件是BD公司的一個全自動獲取分析軟件。它是專門用來分析人類白細胞抗原B-27基因表達及否。軟件可以自動設(shè)門找到CD3+的T細胞群，并分析B27基因是否表達（表達即為陽性結(jié)果，反之即為陰性）。HLA-B27軟