生物實驗報告-坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本制備

1、坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的制備和神經(jīng)干動作電位的觀察與傳導(dǎo)速度的測定1、 實驗?zāi)康模?.學(xué)習(xí)蛙類動物雙毀髓的實驗方法。2.學(xué)習(xí)并掌握坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的制備方法。3.觀察蛙坐骨神經(jīng)干復(fù)合動作電位的基本波形，并了解其產(chǎn)生的原理。4.學(xué)習(xí)蛙和蟾蜍離體神經(jīng)干上神經(jīng)沖動傳導(dǎo)速度的方法和原理。2、 實驗材料：1.實驗對象：蟾蜍2.實驗器材：常規(guī)手術(shù)器械（粗剪刀、手術(shù)剪、眼科剪、手術(shù)鑷、眼科鑷）蛙板、蛙釘、探針、鋅銅弓、玻璃分針、培養(yǎng)皿、任氏液、滴管、手術(shù)線、PC機(jī)、信號采集處理系統(tǒng)、神經(jīng)屏蔽盒等。3、 實驗原理： 神經(jīng)干在受到有效刺激以后可以產(chǎn)生復(fù)合動作電位，標(biāo)志著神經(jīng)發(fā)生興奮。如果在離體神經(jīng)干的一段施加刺

2、激，從另一端引導(dǎo)傳來的神興奮沖動，可以記錄出雙相電位，加入在引導(dǎo)的兩個電極之間將神經(jīng)干麻醉或損傷，阻斷其興奮傳導(dǎo)能力，這時候記錄出的動作電位就成為單相電位。神經(jīng)細(xì)胞的動作電位是以全或無的方式產(chǎn)生的。但是，復(fù)合動作電位的幅值在一定刺激強(qiáng)度下是隨刺激強(qiáng)度的增加而增大的。如果在遠(yuǎn)離刺激點的不同距離處分別引導(dǎo)離體神經(jīng)干動作電位，兩引導(dǎo)點之間的距離為m，在兩引導(dǎo)點分別引導(dǎo)出的動作電位的時相差為s。即可按照公式v=m/s來計算出興奮的傳導(dǎo)速度。蛙類的坐骨神經(jīng)干屬于混合性神經(jīng)，其中包含有粗細(xì)不等的各種纖維，其直徑一般為3-29um,其中直徑最粗的有髓纖維為A類纖維，傳導(dǎo)速度在正常室溫下為35-40 m/s。

3、神經(jīng)每興奮一次極其在興奮以后的回復(fù)過程中，其興奮性都要經(jīng)歷一次周期性的變化，其全過程依次包括絕對不應(yīng)期、相對不應(yīng)期、超常期和低常期4個時期。為了測定坐骨神經(jīng)在發(fā)生一次興奮以后興奮性所發(fā)生的周期性變化，首先要給神經(jīng)施加一個條件性刺激引起神經(jīng)興奮，然后在前一興奮及其恢復(fù)過程不同時相再施加一個測試性刺激，用于檢查神經(jīng)的興奮閾值和所引起的動作電位的幅度，以判定神經(jīng)興奮性的變化。四、實驗方法及步驟：1、坐骨神經(jīng)干標(biāo)本制備（1） 破壞腦與脊髓： 取蛙一只，用自來水沖洗干凈，左手持蛙，用食指下壓其吻部，拇指按壓在其骶髂關(guān)節(jié)下方，使其頭盡量前俯，右手持探針沿兩眼之間中線向后方輕劃，至觸及頭頸部正中的凹陷處，即

4、為枕骨大孔的位置。用探針在凹陷處垂直刺入枕骨大孔，再將其針尖轉(zhuǎn)向前刺入顱腔，左右攪動探針，徹底搗毀腦組織；然后緩慢地把探針退至枕骨大孔處，將其轉(zhuǎn)向后方，與脊柱平行捻動探針使其刺入整個椎管，徹底搗毀脊髓。徹底搗毀脊髓時，可看到動物后肢突然蹬直，然后癱軟。（2）剪去軀干上部及內(nèi)臟 在骶髂關(guān)節(jié)前1 cm處用金冠剪（粗剪）剪斷脊柱（可在下肢前端）。沿脊柱切口向下剪開兩側(cè)腹部皮膚至恥骨處，將頭、前肢、內(nèi)臟及腹部軟組織全部剪掉，放于污物盤，只保留下端脊柱和下肢。在腹側(cè)脊柱兩旁可看到腰骶神經(jīng)叢。注意切勿觸及或損傷坐骨神經(jīng)。（3） 剝后肢皮膚 左手持鑷子夾住脊髓斷端，右手捏住斷端邊緣，剝掉全部后肢皮膚。注意不

5、要握住或接觸坐骨神經(jīng)。將全部皮膚剝除后，把標(biāo)本置于盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。將手和手術(shù)器械洗凈，以免皮膚分泌物、血液污染神經(jīng)標(biāo)本。（4） 分離兩腿 在任氏液里把標(biāo)本上的血跡沖洗干凈，用鑷子從背位夾住脊柱將標(biāo)本提起，剪去向上突出的骶骨（避開坐骨神經(jīng)），然后沿正中線用粗剪刀將脊柱分為兩半，再從恥骨聯(lián)合中央剪開兩后肢。將已分離的標(biāo)本浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。（5） 制備坐骨神經(jīng)標(biāo)本 取出一側(cè)下肢，用蛙釘固定于蛙板上，固定時要注意使坐骨神經(jīng)和腓腸肌朝上。先用玻璃分針沿脊柱側(cè)游離坐骨神經(jīng)，神經(jīng)干應(yīng)盡可能分離的長一些。要求上自脊髓附近的主干，下沿腓總神經(jīng)或脛神經(jīng)一直分離至踝關(guān)節(jié)附近止。坐骨神經(jīng)在膝關(guān)節(jié)后分為脛

6、神經(jīng)和腓神經(jīng)兩支，如要制備腓神經(jīng)，則在分叉的下端將脛神經(jīng)剪斷，膝關(guān)節(jié)附近的腓神經(jīng)表面有肌肉和筋膜覆蓋，仔細(xì)分離并沿腓腸肌溝一直下行分離至跟踺，然后將棉線用任氏液浸泡后，在脊髓側(cè)坐骨神經(jīng)起始處和跟腱處將神經(jīng)結(jié)扎，在結(jié)扎的外側(cè)將神經(jīng)干剪斷，制成坐骨神經(jīng)-腓神經(jīng)標(biāo)本。另外，也可保留脛神經(jīng)而將腓神經(jīng)剪斷，制成坐骨神經(jīng)-脛神經(jīng)標(biāo)本。將制備好的神經(jīng)干標(biāo)本浸于任氏液中數(shù)分鐘，待其興奮性穩(wěn)定后開始實驗。注意在分離過程中，應(yīng)把神經(jīng)周圍的結(jié)締組織去除干凈，并把神經(jīng)的細(xì)小分支剪斷，但要注意不要用金屬器械碰觸神經(jīng)，也不要對神經(jīng)過度牽拉。實驗期間應(yīng)不斷滴加任氏液使神經(jīng)保持濕潤。制備好的標(biāo)本應(yīng)如下： 圖1 坐骨神經(jīng)腓腸肌

7、標(biāo)本示意圖2、 神經(jīng)干動作電位的觀察（1）連接實驗裝置：將刺激電極連接刺激輸出，記錄電極連接到1通道和2通道，注意避免接觸不良或連接錯誤，注意地線的連接。（2）將神經(jīng)標(biāo)本置于神經(jīng)屏蔽盒的電極上 將神經(jīng)的近中樞端置于刺激電極上，外周端置于記錄電極上。（3）進(jìn)入生物信號采集處理系統(tǒng)，設(shè)置參數(shù)進(jìn)行測定。5、 實驗結(jié)果及討論：1. 神經(jīng)干動作電位：所測得蟾蜍坐骨神經(jīng)干復(fù)合動作電位圖如下，神經(jīng)干受刺激后，記錄的動作電位即為雙相動作電位。 圖1 蟾蜍神經(jīng)干復(fù)合電位2. 神經(jīng)干動作電位的傳導(dǎo)速度測定本實驗采用兩個通道同時記錄由兩對引導(dǎo)電極記錄下的動作電位來計算動作電位傳導(dǎo)速度。先分別測量從刺激偽跡到兩個動作電位起始點的時間，設(shè)上線為t1，下線為t2，求出t2-t1的時間差值。然后再測量標(biāo)本屏蔽盒中兩對引導(dǎo)電極起始電極之間的距離d，則神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)速度Vd/(t2-t1)。通過實驗，我們測得t1=1.9ms，t2=2.2ms，d=1cm，V33.33m/s。相比標(biāo)準(zhǔn)值（35-40）來說偏低，可能因為神經(jīng)纖維放置時間過長，不夠濕潤而使傳導(dǎo)速度下降。六、注意事項：1、在制備標(biāo)本時，避免過度牽拉神經(jīng)，不可用手或金屬器械觸碰神經(jīng)干。