生化實(shí)驗(yàn)講義

1、實(shí)驗(yàn)一 糖的顏色反應(yīng)及還原性檢驗(yàn)A. 莫氏試驗(yàn)一、目的掌握莫氏（Molisch）試驗(yàn)鑒定糖的原理和方法。二、原理糖經(jīng)濃無機(jī)酸（濃硫酸、濃鹽酸）脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，后者在濃無機(jī)酸作用下，能與-萘酚生成紫紅色縮合物。利用這一性質(zhì)可以鑒定糖。三、實(shí)驗(yàn)器材棉花或?yàn)V紙；吸管1.0ml（×5）、2ml（×1）；試管1.5cm×15cm（×5）；容量瓶50ml（×5）；燒杯50ml（×5）；棕色瓶50ml（×5）；玻璃棒多根、電爐（配石棉網(wǎng)）多個(gè)。四、實(shí)驗(yàn)試劑莫氏試劑：稱取-萘酚2.5g，溶于95乙醇并稀釋至50ml。此試劑需新鮮配

2、制，并貯于棕色試劑瓶中。1蔗糖溶液：稱取蔗糖0.5g，溶于蒸餾水并定容至50ml。1葡萄糖溶液：稱取葡萄糖0.5g，溶于蒸餾水并定容至50ml。1果糖溶液：稱取果糖0.5g，溶于蒸餾水并定容至50ml。1淀粉溶液：將0.5g可溶性淀粉與少量冷蒸餾水混和成薄漿狀物，然后緩緩傾入沸蒸餾水中，邊加邊攪，最后以沸蒸餾水稀釋至50ml。五、操作于5支試管中，分別加入1葡萄糖溶液、1蔗糖溶液、1果糖溶液與1淀粉溶液1 mL和少許纖維素（棉花或?yàn)V紙少量浸在1ml水中），然后各加莫氏試劑23滴，搖勻，將試管傾斜，沿管壁慢慢加入濃硫酸1.5ml（切勿振搖?。?，硫酸層沉于試管底部與糖溶液分成兩層，觀察液面交界處有

3、無紫紅色環(huán)出現(xiàn)。注意：一些非糖物質(zhì)（如糠醛、糖醛酸等）亦呈陽性反應(yīng)。此外，樣液中如含高濃度有機(jī)化合物，將因濃硫酸的焦化作用，而出現(xiàn)紅色，故試樣濃度不宜過高。亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替-萘酚，麝香草酚的優(yōu)點(diǎn)是溶液比較穩(wěn)定，且靈敏度與萘酚一樣。B. 塞氏試驗(yàn)一、目的掌握塞氏（Seliwanoff）試驗(yàn)鑒定酮糖的原理和方法。二、原理酮糖在濃酸的作用下，脫水生成5-羥甲基糠醛，后者與間苯二酚作用，呈紅色反應(yīng)；有時(shí)亦同時(shí)產(chǎn)生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鮮紅色溶液。三、實(shí)驗(yàn)器材1 吸管0.5ml（×3）、5.0ml（×1）。2 試管1.5cm×15cm（×3

4、）3 水浴鍋。四、實(shí)驗(yàn)試劑1 塞氏試劑：溶50mg間苯二酚于100ml鹽酸中VH2O：V(HCl)=2：1，臨用時(shí)配制。2 1蔗糖溶液：同試驗(yàn)A。3 1葡萄糖溶液：同試驗(yàn)A。4 1果糖溶液：同試驗(yàn)A。五、操作于3支試管中分別加入1葡萄糖溶液、1蔗糖溶液、1果糖溶液各0.5ml，各加塞氏試劑2.5ml，搖勻，同時(shí)置沸水浴中，比較各管顏色變化及紅色出現(xiàn)的先后次序。六、問答題1、分別寫出兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行分析。1葡萄糖溶液1蔗糖溶液1果糖溶液1淀粉溶液纖維素莫氏試劑濃硫酸塞氏試劑C糖的還原性檢驗(yàn)一、目的和要求了解鑒定還原糖的方法及其原理。二、原理在堿性溶液中，具有自由醛基或酮基糖能將金屬離子（

5、銅、鉍、汞、銀等）還原，糖本身被氧化成酸類化合物。斐林試劑和班乃德試劑均為含Cu的堿性溶液,還原糖被還原成紅色或黃色的Cu2O。此法常用作還原糖的定性或定量測定。三、材料與儀器吸管1ml（×5），2ml（×1）；試管1.5×15cm；水浴鍋四、試劑斐林試劑（液）：稱取15g硫酸銅(CuSO4·5H2O)及0.05g次甲基藍(lán)，溶于水中并稀釋至1000ml。斐林試劑（液）：堿性酒石酸銅乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉及75g氫氧化鈉，溶于水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至1000ml，貯存于橡膠塞玻璃瓶內(nèi)。班乃德試劑：取無水硫酸銅1.74g溶于10

6、0ml熱水中，冷卻后稀釋至150ml；取檸檬酸鈉173g，無水Na2CO3 100g和600ml水共熱，溶解后冷卻并加水至850ml，然后將150mlCuSO4溶液倒入混合即成。此試劑可長期使用。淀粉溶液 %蔗糖溶液%葡萄糖溶液五、操作1、于支試管中各加入斐林試劑和液ml,混勻,分別加入%葡萄糖、%蔗糖和%淀粉溶液ml，置沸水浴中加熱數(shù)分鐘,冷卻,觀察各試管的變化.2、另取支試管,分別加入%葡萄糖、%蔗糖和%淀粉溶液ml,然后每管加入班乃德試劑ml,置沸水浴中加熱數(shù)分鐘,取出冷卻,和上面結(jié)果比較.六.思考題斐林反應(yīng)與班乃德反應(yīng)都發(fā)生了什么化學(xué)變化?實(shí)驗(yàn)二 卵磷脂的提取和鑒定一、目的和要求掌握卵

7、磷脂的提取方法及其鑒定方法。二、原理卵磷脂在腦、神經(jīng)組織、肝、腎上腺和紅細(xì)胞中含量較多。卵磷脂易溶于乙醇、乙醚等脂溶劑，可利用此溶劑提取。新提取的卵磷脂為白色蠟狀物，與空氣接觸后因所含不飽和脂肪酸被氧化而成黃褐色，卵磷脂中的膽堿基在堿性溶液中可分解成三甲胺，具有特殊的魚腥味，可鑒別。三、試劑和器材（一）試劑1.雞蛋卵黃2.95%乙醇3.10%NaOH溶液（二）器材1.燒杯 2.漏斗3.蒸發(fā)皿 4.水浴鍋 5.試管 6.量筒四、操作步驟1.提取：于小燒杯內(nèi)置蛋黃2g，加入熱95%乙醇15mL，邊加邊攪，冷卻，過濾，如濾液混濁，需重濾直到完全透明。將濾液置蒸發(fā)皿內(nèi)，蒸氣浴上蒸干，殘留物即卵磷脂。2

8、.鑒定：取提取的卵磷脂少許，置試管內(nèi)加 10%NaOH溶液2mL，水浴加熱，是否產(chǎn)生魚腥味。另取一些卵磷脂溶于1mL乙醇中，添加12mL丙酮，觀察變化。五、思考題1.卵磷脂的主要生理功能有哪些?2.工業(yè)用大豆卵磷脂是如何制備的?3. 卵磷脂在食品工業(yè)的應(yīng)用有哪些?實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的特殊顏色反應(yīng)及其原理2、掌握幾種常用鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 對蛋白質(zhì)及氨基酸的雙縮脲反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、黃色反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng)、偶氮反應(yīng)、醋酸鉛反應(yīng)等顏色及沉淀反應(yīng)進(jìn)行定性確定。三、實(shí)驗(yàn)操作（一） 雙縮脲反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)尿素加熱到180左右時(shí)，兩個(gè)分子

9、的尿素縮合可放出一個(gè)分子氨后形成雙縮脲，雙縮脲在堿性溶液中與銅離子結(jié)合生成復(fù)雜的紅色配合物，此呈色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有多個(gè)肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，故能呈此反應(yīng)，而形成紫紅色或藍(lán)紫色的配合物。此反應(yīng)常用作蛋白質(zhì)的定性或定量的測定。2、試劑(1)尿素(2)10%NaOH溶液(3)1%CuSO4溶液(4)蛋白質(zhì)溶液：將雞蛋清用蒸餾水稀釋1020倍，3層紗布過濾，濾液冷藏備用。3、操作（1）取少許結(jié)晶尿素放在干燥試管，微火加熱，則尿素開始熔化，并形成雙縮脲，釋放的氨可用濕潤的紅色石蕊試紙鑒定。待熔融的尿素開始硬化，試管內(nèi)有白色固體出現(xiàn)，停止加熱，讓試管緩慢冷卻。然后加10% Na

10、OH溶液 1 ml和1% CuSO4 23滴，混勻后觀察顏色的變化。（2）另取一試管，加蛋白質(zhì)溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO4 23滴，振蕩后將出現(xiàn)的紫紅色與雙縮脲反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色相對比。（二） 茚三酮反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)原理除脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮作用生成黃色物質(zhì)外，所有-氨基酸與茚三酮發(fā)生反應(yīng)生成紫紅色物質(zhì)，最終形成藍(lán)紫色化合物。11500000濃度的氨基酸水溶液即能發(fā)生反應(yīng)而顯色。反應(yīng)的適宜pH為57。此反應(yīng)目前廣泛地應(yīng)用于氨基酸定量測定。2、試劑蛋白質(zhì)溶液 （同前）；0.5% 甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液3、操作取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液各1 ml，再

11、各加0.5 ml 0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴加熱23分鐘，觀察顏色變化。（三） 蛋白黃色反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，這類蛋白質(zhì)可被濃硝酸硝化生成黃色的硝基苯的衍生物。該物質(zhì)在酸性環(huán)境中呈黃色，在堿性環(huán)境中轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S色的硝醌酸鈉。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有芳香族氨基酸，因此都有黃色反應(yīng)。皮膚、毛發(fā)、指甲等遇濃HNO3變黃即發(fā)生此類黃色反應(yīng)結(jié)果。2、試劑(1)蛋白質(zhì)溶液（同前）；(2)頭發(fā)；(3)指甲屑；(4)0.5%苯酚溶液；(5)0.3%酪氨酸溶液；(6)10%NaOH溶液；(7)濃硝酸（=1.42克/毫升）3、操作取5支試管編號后分別按

12、下表-1所示加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，若有反應(yīng)慢者可放置微火（或水浴中）加熱，待各管均先后出現(xiàn)黃色后，于室溫逐滴加入10%NaOH溶液直至堿性，觀察顏色變化。表1 試驗(yàn)編號管 號12345材料加入蛋白質(zhì)溶液（4滴）指甲屑（少許）頭發(fā)（少許）苯酚（4滴）酪氨酸（4滴）濃硝酸2滴2 ml2 ml4滴2滴現(xiàn) 象注意：向蛋白質(zhì)溶液中加濃硝酸時(shí)，所出現(xiàn)的白色沉淀是強(qiáng)酸使蛋白質(zhì)發(fā)生變性所致。（四） 乙醛酸反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)原理含有吲哚基的色氨酸在濃硫酸存在下與乙醛酸（CHOCOOH）縮合，形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。此反應(yīng)機(jī)理尚不清楚，可能是由一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合而成的。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)

13、。2、試劑(1)蛋白質(zhì)溶液（同前）。(2)0.03%色氨酸溶液。(3)冰醋酸（一般含有乙醛酸雜質(zhì)，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。(4)濃硫酸（分析純）。3、操作：取2支試管，分別加入蛋白質(zhì)溶液及色氨酸各2滴，再加濃冰醋酸約12毫升，混勻，傾斜試管慢慢地沿管各加濃硫酸1毫升，使之兩相重疊，靜置5分鐘后則兩相界面處出現(xiàn)紫紅色環(huán)，若效果不明顯可在水浴加熱。（五） 偶氮反應(yīng) 1、實(shí)驗(yàn)原理偶氮化合物與酚核或咪唑環(huán)結(jié)合產(chǎn)生有色物質(zhì)，酪氨酸和組氨酸與之反應(yīng)則應(yīng)產(chǎn)物分別為橙紅色和櫻紅色。含有酪氨酸和組氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。應(yīng)當(dāng)指出，組胺、酪胺、腎上腺素和膽色素分子也能發(fā)生此反應(yīng)而顯色。2、試劑：(1)蛋白質(zhì)溶液

14、（同前）；(2)0.3%組氨酸溶液；(3)0.3%酪氨酸溶液；(4)20%NaOH溶液；(5)重氮試劑溶液A：5克亞硝酸鈉溶于1000毫升水中。溶液B：溶解5克-氨基苯磺酸于1000毫升水中，溶解后再加入5毫升濃硫酸。A、B液分別存在密閉瓶中，用時(shí)以等體積混合。3、操作：取3支試管分別加入0.3%組氨酸、酪氨酸、蛋白質(zhì)溶液，各45滴，再分別加重氮試劑A、B各10滴，振搖，混勻，取后向3支試管分別加入20%NaOH溶液23滴，觀察各試管中有色物質(zhì)的生成，若水浴加熱效果更明顯。（六）、醋酸鉛反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)原理多數(shù)蛋白質(zhì)分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿作用下可分解產(chǎn)生硫化鈉

15、。硫化鈉與醋酸鉛反應(yīng)生成黑色的硫化鉛沉淀，若加入濃鹽酸則有硫化氫氣體產(chǎn)生。2、試劑(1)未稀釋的雞蛋清。(2)10%的NaOH溶液(3)1.5%Pb(Ac)2溶液（醋酸鉛溶液）(4)濃鹽酸(5)醋酸鉛試紙(將濾紙條浸入醋酸鉛溶液中，濕透后取出，100烘干即可)3、操作：向試管中先加入1.5% Pb(Ac)2溶液約1毫升，再慢慢滴加10%的NaOH溶液，邊加邊振搖，直到產(chǎn)生的沉淀溶解為止。此時(shí)再向試管內(nèi)加蛋白質(zhì)溶液56滴，混勻。置酒精燈上加熱1分鐘，溶液變黑，小心加入濃鹽酸約2毫升，黑色褪去，嗅其味，將濕潤醋酸鉛試紙置于管口，觀察其顏色的變化。實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)一、目的1熟悉蛋白質(zhì)的沉淀反

16、應(yīng)。2進(jìn)一步掌握蛋白質(zhì)的有關(guān)性質(zhì)。二、原理多數(shù)蛋白質(zhì)是親水膠體，當(dāng)其穩(wěn)定因素被破壞或與某些試劑結(jié)合成不溶解的鹽后，即產(chǎn)生沉淀。三、實(shí)驗(yàn)器材1試管1.5cm×15cm（×7）。2吸管5.0ml(×2)、2.0ml(×2)、1.0ml(×1)。3吸濾瓶500ml(×1)。4布氏漏斗。四、實(shí)驗(yàn)試劑1蛋白質(zhì)試液：見實(shí)驗(yàn)二十三卵清蛋白液。2硫酸銨晶體：如果晶體太大，最好研碎。3飽和硫酸銨溶液：蒸餾水100ml加硫酸銨至飽和。495%乙醇。5結(jié)晶氯化鈉。61%醋酸鉛：1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml。75%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀釋至1

17、00ml。81%硫酸銅溶液：見實(shí)驗(yàn)二十三。9飽和苦味酸溶液。101%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸餾水稀釋至100ml。五、操作A、蛋白質(zhì)鹽析作用向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽至一定濃度，蛋白質(zhì)即沉淀析出，這種作用稱為鹽析。操作方法：1取蛋白質(zhì)溶液5ml，加入等量飽和硫酸銨溶液（此時(shí)硫酸銨的濃度為50%飽和），微微搖動試管，使溶液混合靜置數(shù)分鐘，球蛋白即析出（如無沉淀可再加少許飽和硫酸銨）。2將上述混合液過濾，濾液中加硫酸銨粉末，至不再溶解，析出的即為清蛋白。再加水稀釋，觀察沉淀是否溶解。注意（1）應(yīng)該先加蛋白質(zhì)溶液，然后加飽和硫酸銨溶液。（2）固體硫酸銨若加到過飽和則有結(jié)晶析出，勿與蛋白質(zhì)沉淀混淆。B

18、、乙醇沉淀蛋白質(zhì)乙醇為脫水劑，能破壞蛋白質(zhì)膠體的水化層而使其沉淀析出。操作方法取蛋白質(zhì)溶液1ml，加晶體NaCl少許（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混勻。觀察有無沉淀析出。C、重金屬鹽析沉淀蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)與重金屬離子（如Cu2+、Ag+、Hg2+等）結(jié)合成不溶性鹽類而沉淀。操作方法取試管2支各加蛋白質(zhì)溶液2ml，一管內(nèi)滴加1%醋酸鉛溶液，另一管內(nèi)加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。D、生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物稱為生物堿（或植物堿）。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。生物堿試劑能和蛋白質(zhì)結(jié)合生成

19、沉淀，可能因蛋白質(zhì)和生物堿含有相似的含氮基團(tuán)之故。操作方法取試管2支各加2ml蛋白質(zhì)溶液及1%醋酸溶液45滴，向一管中加5%鞣酸溶液數(shù)滴，另一管內(nèi)加苦味酸溶液數(shù)滴，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)五 醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離蛋白質(zhì)的原理和方法 二、實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在pH值小于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為正離子，在電場中向陰極移動；在pH值大于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場中向陽極移動。血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)，它們所具有的可解離基團(tuán)不同，在同一pH的溶液中，所帶凈電荷不同，故可利用電泳法將它們分離。血清中含有白蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等

20、，各種蛋白質(zhì)由于氨基酸祖墳、立體構(gòu)象、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場中遷移速度不同。由表可知，血清中5種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的緩沖液中，它們都電離成負(fù)離子，在電場中向陽極移動。 在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量與結(jié)合的燃染料量成正比，故可將蛋白質(zhì)區(qū)帶剪下，分別用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下來，進(jìn)行比色，測定其相對含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計(jì)掃描，測定其相對含量。 腎病、彌漫性肝損害、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性炎癥、妊娠等都可以使白蛋白下降。腎病時(shí)1、2、球蛋白升高，-球蛋白降低。肝硬化時(shí)2、-球蛋白降低，而1、-球蛋白升高。

21、三、實(shí)驗(yàn)器材 1、醋酸纖維薄膜（2cm*8cm，厚度120m）2、人血清； 3、燒杯及培養(yǎng)皿 數(shù)只； 4、點(diǎn)樣器； 5、竹鑷子； 6、玻璃棒； 7、電吹風(fēng)； 8、試管 六只； 9、恒溫水浴鍋； 10、電泳槽； 11、直流穩(wěn)壓電泳儀； 12、7220型分光光度計(jì)； 13、剪刀 四、實(shí)驗(yàn)試劑 1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6)：取兩個(gè)大燒杯，分別稱取巴比妥鈉12.76g和巴比妥1.66g溶解于500ml蒸餾水中,混勻； 2、染色液：氨基黑10B 0.5g、甲醇（A.R.）、冰乙酸（A.R.）10ml、加蒸餾水40ml，混勻即可，可反復(fù)使用； 3、漂洗液：取乙醇45ml，冰醋酸5ml，加蒸餾水

22、50ml，混勻； 4、浸出液：0.4mol/L NaOH溶液； 5、透明液：取冰醋酸25ml、無水乙醇75ml，混勻。 五、實(shí)驗(yàn)操作 1、準(zhǔn)備和點(diǎn)樣 取一條醋酸纖維薄膜，浸入緩沖液中，完全浸透后，用鑷子輕輕取出，將薄膜無光澤的一面向上，平放在干凈濾紙上，再放一張干凈濾紙吸取多余的緩沖液； 用玻棒蘸取少量血清，涂在點(diǎn)樣器上，然后輕輕于距纖維薄膜一端1.5cm處接觸，樣品即呈一條狀突于纖維膜上。待血清透入膜內(nèi)，將薄膜平貼于已放在電泳槽上、并已浸透緩沖液的紗布上，點(diǎn)樣端為陰極； 2、電泳 接通電源，設(shè)定電泳電壓為100V，通電50分鐘； 3、染色.完畢，將薄膜浸于染色液中510分鐘，取出，用漂洗液漂

23、至背景無色（約45次），再浸于蒸餾水中。.實(shí)驗(yàn)六 酵母RNA的提取與鑒定一、目的掌握稀堿法提取酵母RNA的原理和方法二、原理酵母核酸中RNA含量較多，DNA則少于2。RNA可溶于堿性溶液，當(dāng)堿被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。用堿液提取的RNA有不同程度的降解。三、實(shí)驗(yàn)器材1、干酵母粉（市售）。2、鮮酵母（市售）。3、pH試紙（pH114）。4、電子天平。5、燒杯100mL(×1)。6、量筒50mL（×1）、10mL(×1)。7、抽濾瓶500mL(×1)。8、布氏漏斗10cm(×1)。9、吸管0.50mL（×1）、

24、1.0mL(×2)、2.0mL(×2)、5.0mL(×1)。10、離心機(jī)4000r/min。四、實(shí)驗(yàn)試劑1、0.2氫氧化鈉溶液：2gNaOH溶于蒸餾水并稀釋至1000mL。2、乙酸（A .R） 3、95乙醇4、無水乙醚（A. R）5、氨水（A. R）6、10硫酸溶液：濃硫酸（比重1.84）10mL，緩緩傾于水中，稀釋至100mL。7、5硝酸銀溶液：5g AgNO3溶于蒸餾水并稀釋至100mL,存于棕色瓶中.8、苔黑酚-三氯化鐵試劑:將100mg苔黑酚溶于100mL濃鹽酸中,再加入100mg FeCl3·6H2O，臨用時(shí)配制。五、操作1、RNA的提取稱取8

25、g干酵母粉于100mL燒杯中, 加入0.2%NaOH溶液40mL,沸水浴加熱30min, 經(jīng)常攪拌. 冷卻,加入乙酸數(shù)滴,使提取液呈酸性(pH56,用石蕊試紙?jiān)囍?, 離心1015min(4000r/min). 取上清液, 加入2倍體積的95%乙醇, 邊加邊攪. 加畢, 靜置, 待完全沉淀, 過濾. 濾渣先用95%乙醇洗2次(每次約10mL), 繼而用無水乙醚洗2次(每次10mL),洗滌時(shí)可用細(xì)玻璃棒小心攪動沉淀。 乙醚濾干后, 濾渣即為粗RNA, 可作鑒定和測定含量用。2、鑒定取上述RNA約0.5g, 加10%硫酸液5mL, 于三角瓶中,沸水浴上加熱水解20min左右， 將RNA水解.(1)

26、 取水解液0.5 mL, 加苔黑酚-三氯化鐵試劑1mL, 加熱至沸1min, 觀察顏色變化.(2) 水解液2 mL, 加氨水2 mL及5%硝酸銀溶液1 mL, 觀察是否產(chǎn)生絮狀的嘌呤銀化合物.(3) 磷的鑒定 取水解液2ml，加入5滴濃硝酸和1ml 鉬酸銨溶液，沸水浴加熱23min，可見黃色的磷鉬銨沉淀生成。實(shí)驗(yàn)七 發(fā)酵過程中的中間產(chǎn)物的鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)在無氧條件下，葡萄糖的氧化作用。2.掌握檢測代謝中間物存在的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理在酵母菌中，葡萄糖經(jīng)一系列反應(yīng)首先產(chǎn)生丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?，后者接受NADH2中的2H而還原為乙醇，即生醇發(fā)酵。在正常情況下，代謝中

27、間物丙酮酸、乙醛存在的量是不多的，為了證明它們作為反應(yīng)途徑的中間代謝物存在著，可向反應(yīng)體系中加入一些酶的抑制劑，在研究的條件下，抑制催化某一化合物轉(zhuǎn)變的酶?；蛘吒淖兩?xiàng)l件，使酶的活性降低；或者加入一種“誘獲劑”，使它與中間代謝物反應(yīng)后形成一種不能進(jìn)一步代謝的物質(zhì)等。在弱堿條件下，丙酮酸脫羧酸活性喪失。因此丙酮酸不能進(jìn)一步代謝而累積下來，它的存在可以通過與硝普酸鈉或2，4-二硝基苯肼反應(yīng)來證明。向反應(yīng)混合物中加入亞硫酸鈉，它可以“誘捕”乙醛，加入硝普酸鈉或哌啶后，藍(lán)色物質(zhì)的形成說明有乙醛的存在。三、試劑1）0.5mol/L的磷酸氫二鈉 7）5%的硝普酸鈉（使用前制備）2）磷酸二氫鉀溶液（0.5mol/L） 8）濃氨水3）酵母懸浮液：把1g鮮酵母塊溶于 9）硫酸銨10ml磷酸氫二鈉中（4冰箱保存） 10）亞硫酸鈉4）酵母懸浮液：把1g鮮酵母塊溶于 11）10%的氫氧化鈉10ml磷酸二氫鉀溶液中（4冰箱保存） 12）2，4-二硝基苯肼鹽酸飽和溶液（以5）酵母懸浮液：把1g鮮酵母塊溶于10ml 2mol/L的鹽酸配制）水中（4冰箱保存） 13）三氯乙酸（5%）6