斑馬魚胚胎發(fā)育時期

1、斑馬魚胚胎發(fā)育的分期斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 CHARLES B. KIMMEL, WILLIAM W. BALLARD, SETH R. KIMMEL等 原著 俄勒岡大學神經(jīng)生物學學院；達特茅斯學院生物系 黃萬旭 譯 浙江大學生命科學學院 摘要：我們對斑馬魚（zebranfish, Danio rerio）胚胎發(fā)育的分期作了一系列的闡述。我們定義了胚胎發(fā)育的七段時期 （period） 合子（zygote） 、 卵裂 （cleavage） 、 囊胚 （blastula） 、 原腸 （gastrula） 、分節(jié)（segmentation） 、咽囊（pharyngula） ，以及孵化期（hatchin

2、g period） 。這一劃分強調(diào)了發(fā)生于受精后頭3天的主要發(fā)育過程中的變化情況，同時我們也回顧了發(fā)生于每一時期的諸如形態(tài)發(fā)生及其他主要事件。時期的下一劃分單位是分期（stage） 。各分期都有名稱，而非標號，反映了分期序列的靈活性和持續(xù)演變過程，因為我們從這一物種中還能得到更多。各分期的命名是基于用解剖立體顯微鏡（dissecting stereomicroscope）觀察活體胚胎所容易觀察到的形態(tài)學特征為依據(jù)的，同時也充分利用了活體胚胎的透明性，這一性質(zhì)使我們可以用組合顯微鏡（compound microscope）和Nomarski干涉相差照明（Nomarski interference

3、 contrast illumination）觀察到即使很深層的結(jié)構(gòu)。顯微照相（photomicro- graphs）和組合顯微描圖（composite camera lucida line drawings）則以圖片刻畫了每一分期。此外還有一些圖像則顯示了發(fā)育過程中一些可用作分期輔助標志的顯著特征。 關(guān)鍵詞：斑馬魚，形態(tài)發(fā)生，胚胎發(fā)生，合子，卵裂，囊胚，原腸，分節(jié)，咽囊，孵化 目目 錄錄 概 述 . 1 全文組織結(jié)構(gòu) . 1 步 驟 . 3 溫度與標準發(fā)育時間 . 8 合子期（0-0.75h） . 9 卵裂期（0.75-2.25h） . 9 囊胚期（2.25-5.25h） . 12 原腸期

4、(5.25-10h) . 16 體節(jié)期（10-24h） . 21 咽囊期（24-48h） . 33 孵化期（48-72h） . 42 早幼期 . 48 謝 辭 . 48 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 1 概概 述述 分期為發(fā)育研究提供了準確度。這是因為不同的胚胎即使在同一群體中一起生長，其發(fā)育亦有不同程度的差異，我們已看到在斑馬魚發(fā)育過程中出現(xiàn)的不同步性。體外同時受精產(chǎn)生的胚胎，孵育于溫度合適的稀疏環(huán)境（28.5，5-10個胚胎/ml），最早期即出現(xiàn)不同步性，并隨時間延續(xù)愈加顯著。通過對比顯示，不同群體中的差異比同一群體中的更大。基因差異能部分說明而不能完全解決這一問題，因為即使來自同一斑馬魚克隆系的

5、胚胎其發(fā)育亦有不同步性。 就不同胚胎而言，通過形態(tài)學標準分期可部分解決這一問題。例如，頭部的原始三叉神經(jīng)感受神經(jīng)元（primary trigeminal sensory neurons）和軀干的原始運動神經(jīng)元（primary motoneurons）都是在體節(jié)連續(xù)沿體軸出現(xiàn)這段時期內(nèi)開始軸突發(fā)生的。 通過體節(jié)數(shù)目分期比通過受精后逝去的時間分期能更準確地預(yù)測這些神經(jīng)元在發(fā)育過程中的位置。 參照分期序列來記錄實驗?zāi)芴峁┖芎玫姆绞酱_保實驗的再現(xiàn)性，并允許隨后加入新的觀察結(jié)果和數(shù)據(jù)。一系列基于形態(tài)學的劃分同時也有利于交流，“18-體節(jié)胚胎”比“受精后18小時胚胎”這一稱謂含有更豐富的意義，尤其在交叉物

6、種比對中。 以往的斑馬魚發(fā)育分期盡管不如目前的完善，也相當準確地反映了頭一天的胚胎發(fā)育，并提供了多組有用的圖片（Hisaokaand Battle, 1958; Hisaoka and Firlit, 1960）。Warga 和 Kimmel （1990）簡要地描述了囊胚期和原腸期。 本系列分期的先前版本見于已出版和發(fā)行的 斑馬魚手冊（The Zebrafish Book，Westerfield,1994）一書。新版做了細微的修正和補充，更新版本可以電子版形式在http:/zfish. 獲得。 表1. 早期發(fā)育的各時期 時期時期 h 描述描述 合子 0 新受精的卵子完成首

7、個合子細胞周期 卵裂 0.75 細胞周期2至7快速同步發(fā)生 囊胚 2.25 快速間時同步（metasynchronous）細胞周期（8，9）在原腸中期轉(zhuǎn)變中變?yōu)檠娱L的異步（asynchronous）周期；隨后外包（epiboly）開始 原腸 5.25 內(nèi)卷（involution）、聚合(convergence)和延伸（extension）等形態(tài)學運動形成上、下胚層和胚軸；持續(xù)到外包運動結(jié)束 分節(jié) 10 體節(jié)、原始咽弓和神經(jīng)原節(jié)（neuromeres）發(fā)育；原始器官發(fā)生；開始運動；尾部出現(xiàn) 咽囊 24 種系期（phylotypic-stage）胚胎；體軸由先前繞卵黃囊的彎曲狀態(tài)開始伸直；循環(huán)系統(tǒng)

8、、色素沉著和鰭開始發(fā)育 孵化 48 原始器官系統(tǒng)完成快速形態(tài)發(fā)生；軟骨在頭和鰭中發(fā)育；陸續(xù)開始孵化 早幼 72 鰾膨脹；覓食及積極的躲避行為 全文組織結(jié)構(gòu)全文組織結(jié)構(gòu) 我們命名了每一分期，而不是像其他序列那樣使用數(shù)字編碼，因為命名的分期更為靈活且易于記憶和識別。分期的定義不是一個瞬間的時刻點，而只是一個用以近似定位連續(xù)發(fā)育過程中一小段時間的手段。有了分期命名，我們就可以很容易地加入所知細節(jié)，或是為了某一特定的研究在序列中插入一個新的分期，而無需求助于諸如小數(shù)、負數(shù)、正數(shù)這類令人生厭的工具。例如：我們現(xiàn)在描述了一個5-，隨后又描述了一個14-，但一項特定的研究可能要用到其間的8個分期（6-體節(jié)，

9、7-體節(jié)等等），此時我們可以立刻明白其含義（而不必再行描述）。我們強調(diào)的是，這里不作描述并不意味將其排斥于分期之外。 全文組織結(jié)構(gòu) 2 表2. 胚胎發(fā)育的分期a 分期分期 h HB 描述描述 合子期 1-細胞 0 1，2 胞質(zhì)流向動物極，形成胚盤 卵裂期 2-細胞 0.75 3 部分卵裂 4-細胞 1 4 22排列的卵裂球 8-細胞 1.25 5 24排列的卵裂球 16-細胞 1.5 6 44排列的卵裂球 32-細胞 1.75 7 規(guī)則的2層卵裂球，有時48排列 64-細胞 2 8 規(guī)則的3層卵裂球 囊胚期 128-細胞 2.25 9 5層卵裂球；卵裂面不規(guī)則 256-細胞 2.5 7層卵裂球

10、 512-細胞 2.75 9層卵裂球；NO：YSL形成 1k-細胞 3 10 11層卵裂球；NO：單排YSL核；卵裂細胞周期輕度不同步 高囊胚 3.33 11層卵裂球；胚盤開始變平；NO：2排YSL核；分裂不同步 橢形 3.66 11 胚盤變平產(chǎn)生橢球形；NO：多排YSL核 球形 4 12 球形；胚盤與卵黃之間為水平邊界 穹頂 4.33 13 仍為球形；當外包開始時，卵黃細胞向動物極頂起 30%-外包 4.66 14 胚層如倒置杯狀不均一增厚；邊緣達動植物極距離30% 原腸期 50%-外包 5.25 胚層厚度仍不均一 胚環(huán) 5.66 胚環(huán)在動物極可見；50%-外包 胚盾 6 15 胚盾在動物極

11、可見；50%-外包 75%-外包 8 16 背側(cè)明顯增厚；可見上下胚層和排泄（evacuation）區(qū) 90%-外包 9 腦原基增厚；脊索原基從節(jié)板分離 尾芽 10 17 尾芽顯著；脊索原基從神經(jīng)突（neural keel）分離；早期小膨出（polster）；神經(jīng)突前側(cè)出現(xiàn)中間矢狀溝；100%-外包 體節(jié)期 1-體節(jié) 10.33 第一體節(jié)溝 5-體節(jié) 11.66 18 小膨出顯著；視囊，Kuperffer囊 14-體節(jié) 16 19 EL=0.9mm；眼基板；腦神經(jīng)元，V形軀干體節(jié)；NO：前腎導管 20-體節(jié) 19 20 EL=1.4mm；0.5YE/YB1；YB/HD=2;早期觸碰反射和簡單的

12、應(yīng)激運動；視網(wǎng)膜色素沉著；背側(cè)條帶達12體節(jié)；弱循環(huán)；主動脈至尾端一半；主靜脈編織；淺胸鰭芽；直尾；NO：尾端細胞退化；第1大動脈弓血液循環(huán) 原基-25 36 EL=2.7mm；HTA=75；OVL=1；PF(H/W)=3/4；早期運動；尾部色素沉著，背部條紋加深；強循環(huán)；單一大動脈弓對；主靜脈達尾部3/4； NO：PF頂端上胚層緣 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 3 高胸鰭 42 EL=2.9mm；HTA=55；1/2OVL1；YE/YB=1.5;YB/HD1.3;PF(H/W)=1；去絨膜胚胎游動后背上位靜息；YE仍為錐形；PF頂端上胚層緣顯著；早期側(cè)帶；完整的背側(cè)帶；黃素細胞僅見頭部；虹膜色素細胞

13、僅見視網(wǎng)膜；心包顯著；NO：心腔；血管段；顎弓和舌弓；前腸發(fā)育；嗅覺纖毛；耳囊壁增厚 孵化期 長胸鰭 48 EL=3.1mm；HTA=45；OVL=1/2；PF(H/W)=2；背上位靜息；YE開始變細，PF突出；背腹側(cè)條紋匯于尾部；側(cè)帶約6個黑素細胞；視網(wǎng)膜上虹膜色素細胞豐富；頭部顯著黃色；NO：循環(huán)見于2-4大動脈弓及血管段；嗅覺纖毛擺動；半規(guī)管（semicircular canal）；神經(jīng)丘（neuromast） 胸鰭 60 EL=3.3mm；HTA=35；運動迅速難以分辨；YR變細融入YB；側(cè)帶約10個黑素細胞；PF變平成鰭形，有明顯的循環(huán)；視網(wǎng)膜虹膜色素細胞環(huán)加深；虹膜色素細胞出現(xiàn)于背

14、側(cè)；NO：PF軟骨和角質(zhì)鰭條（actinotrichia） ；腸道；耳囊分2腔；早期頜軟骨；循環(huán)于5-6大動脈弓；口仍小，開于腹側(cè)眼中線 突口 72 EL=3.5mm；HTA=25；寬口突出于眼前方；虹膜色素細胞出現(xiàn)于卵黃帶；虹膜色素細胞覆蓋眼部一半；背部黃色與頭部色調(diào)同；NO：腮裂和腮絲芽基；腮弓1-5軟骨；鰓蓋覆住1-2腮弓；匙骨（cleithrum） a EL：胚體長度；PF：胸鰭；HB：Hisaoka 和 Battle (1958)斑馬魚分期大致序列（一直到HB分期20大致準確）；HD：背側(cè)觀頭部直徑；NO：Nomarski optics；H/W：高/寬；YB：卵黃球；YE：卵黃延伸部

15、；YSL：卵黃合胞體層；HTA：頭-肢角；OVL：耳囊長度 為從更廣的視角觀察發(fā)育過程，我們將數(shù)個分期歸為一組，形成更長的時間段稱為時期（表1），并在文中總結(jié)了發(fā)生在這些時期內(nèi)的主要事件。術(shù)語表中定義了一些特定的術(shù)語，文中黑體字強調(diào)的術(shù)語在分期中是重要的。表2對各個分期作了簡要的描述，而圖1則展示了相應(yīng)的草圖。我們可以利用這些資料大致定位我們所感興趣的一個分期，然后盡可能在文中和其他圖中找到更多細節(jié)。 步步 驟驟 分期分期 我們可以通過使用立體顯微鏡觀察活體胚胎來大致確定發(fā)育分期，通常用透射光（而非反射或入射光）以及高放大倍數(shù)（約50）。在體節(jié)期尾部伸長，如果胚胎仍處于絨膜（chorion）內(nèi)

16、，尾部最終將環(huán)繞驅(qū)干和頭部，以致不易觀察。此時，我們必須將胚胎移出絨膜，可以使用5號鑷子（forceps）手工移去，也可用蛋白溶解酶（proteolytic enzyme）處理。咽囊晚期，一旦受到觸碰，胚胎（如已去除絨膜）會反射性游走，這種情況下，可用0.003%三卡因（tricaine）以麻醉之。反復(fù)麻醉和沖洗會嚴重阻滯隨后的發(fā)育，雖然看起來似乎輕微。 Nomarski光學系統(tǒng)光學系統(tǒng) 裝有Nomarski微分干涉相差光學系統(tǒng)和倍率15至40的物鏡的組合顯微鏡能揭示活體標本更多的細節(jié)，利于精確分期。例如，Nomarski光學系統(tǒng)可在囊胚期和體節(jié)期實現(xiàn)最精確的細胞和體節(jié)計數(shù)。此外，“原基”期（

17、”prim” stages）指后側(cè)線原基（primordium of the posterior lateral line）這一結(jié)構(gòu)的位置， 我們必須利用Nomarski光學系統(tǒng)以準確確定大部分咽囊期的一些分期。 將胚胎麻醉、 去除絨膜，并置于橋接蓋玻片之間以利于觀察和隨后的恢復(fù)。步 驟 4 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 5 步 驟 6 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 7 圖 1. 斑馬魚胚胎發(fā)育各分期顯微掃描圖。早期動物極位于頂端，后來前緣成為頂端，例外的是原腸胚的胚環(huán)和胚盾期在其側(cè)面觀的圖片下顯示了相應(yīng)的動物極（AP）觀圖片。卵裂期和囊胚期圖片為正面觀。胚盾期后為胚胎左側(cè)觀，但在胚盾出現(xiàn)前并不能確切地分辨哪

18、一面是左側(cè)。 這里忽略色素沉著。 箭頭指示了以下分期判定的一些關(guān)鍵特征：1k-細胞期：YSL細胞核；穹頂期：隆起的卵黃合胞體；胚環(huán)期：胚環(huán)；胚盾期：胚盾； 75%外包期：Brachet裂縫；90%外包期：胚層外圍包裹卵黃；尾芽期：小膨出；3-：第3體節(jié)；6-：眼原基（上方箭頭）、Kuperffer囊（下方箭頭）；10-：耳基板；21-：晶狀體原基；原基-6期：后側(cè)線原基（背側(cè)觀）、孵化腺（卵黃球上）；原基-16期：心臟；高胸鰭期：胸鰭芽。比例尺=250m 溫度與標準發(fā)育時間 8 對活體胚胎進行分期總是比將其致死和固定后再分期要好。 例如在伸直和孵化期間的分期需要對頭部大小和卵黃質(zhì)量進行對比，而

19、固定期間會造成不同程度的收縮而破壞了正常的關(guān)系。然而，如果保存良好，我們可以利用其他標準相對可靠地對固定或完全包埋的胚胎進行分期，但切割后則不易分期。 成像成像 所附圖片均為活體胚胎， 后期為麻醉處理。 原始圖片被制作為彩色幻燈片 （柯達 Ektachrome 160T DX），而黑白插圖由中間底片復(fù)制而成。彩色幻燈片可付費向作者索取。顯示整個胚胎的低倍圖像由Zeiss STEMI立體顯微鏡獲得：將胚胎置于凹槽載片的標準介質(zhì)中，而不需要蓋玻片，介質(zhì)中含有1.5-3%甲基纖維素（methyl cellulose）以利于預(yù)期定位。顯示部分胚胎的高倍圖像由Nomarski光學系統(tǒng)（通常配合Zeiss

20、 40浸水物鏡）攝得，使用Zeiss UEM組合顯微鏡。將胚胎包埋于蓋玻片之間，有時加1%瓊脂以固定。 溫溫度與標準發(fā)育時間度與標準發(fā)育時間 我們將分期信息轉(zhuǎn)換為“標準發(fā)育時間”，用字母h表示，定義為在28.5這一適宜溫度孵育下受精后的小時數(shù)。孵育在其它溫度下會改變發(fā)育速度，而這在特定研究中可能會有用。例如，使兩個胚胎在某一時間達到不同的分期以作異時移植。對孵育于不同溫度下的胚胎進行對比須謹慎進行，因為不能保證當溫度變化時胚胎所有特性均隨發(fā)育速度作同步變化。然而，若是將胚胎保存在25-33范圍內(nèi)，其發(fā)育似乎正常，超出這一范圍溫度作長時間孵育將出現(xiàn)異常。圖2顯示了在極值點的發(fā)育速率， 圖右側(cè)的說

21、明提供了一個簡單的公式可用以估算出這一范圍內(nèi)的任一溫度下胚胎發(fā)育所能達到的某一分期。 圖 2 . 孵育于25和33的胚胎孵育速度。A：尾芽期，B：突口期。縱軸為 28.5標準溫度下孵育的分期?？梢韵胂?，28.5下的發(fā)育曲線為通過原點的直線，斜率 1.0。注意到 25和 33下的發(fā)育曲線均為直線，且斜率在兩圖中幾乎相同。因此發(fā)育速度隨孵育溫度而變化，可用以下公式估算任一溫度下達 到 某 分 期 所 需 發(fā) 育 時 間 ： HT =h/(0.055T-0.57). HT為 T 溫度下的發(fā)育時間，h 是在 28.5下達到某分期所需時間（見表 1）。分期縮寫分期縮寫：c: cell, d: dome,

22、 s: shield, b: bud; s: somite, p: prim, hp: high-pec, lp: long-pec, pf: pec-fin, pm: protruding-mouth. 方法方法：對自然產(chǎn)卵形成的胚胎進行觀察，分 3 組，每組 20-30個胚胎，孵育于 150ml 大燒杯。用多項指標確定分期，并確保取出觀察的胚胎與保留在燒瓶中的無發(fā)育差異。因為吹打、去絨膜、麻醉等處理會顯著阻滯發(fā)育，如此處理的胚胎比長胸鰭期的對照組晚 2-6 小時。 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 9 合子期（合子期（0-0.75h） 新受精的卵子直至其第一次卵裂發(fā)生，稱合子期（圖3），約受精后40分

23、鐘。受精時形成的合子直徑約0.7mm。 合子期只含有一個分期， 但其間也發(fā)生很多變化， 可以很容易劃分這一時期 （見Hisaoka and Battle,1958）。 合子期的分期合子期的分期 1-細胞期（細胞期（0 h）.絨膜膨脹并脫離新受精的卵子（圖3A）。受精同時也活化胞質(zhì)運動，約10分鐘內(nèi)很容易看到。非卵黃胞質(zhì)開始向動物極流動，促使胚盤和卵黃顆粒豐富的植物極胞質(zhì)分離（圖3B）。這一分離在卵裂早期仍在繼續(xù)。 圖 3 . 合子期。A：受精后數(shù)分鐘，絨膜膨脹。B：受精后約10分鐘，動物極朝上的去絨膜合子。非卵黃胞質(zhì)開始分離進入動物極。比例尺=250m 卵裂期（卵裂期（0.75-2.25h）

24、首次卵裂形成的兩個細胞，或稱卵裂球在間隔15分鐘后分開（圖4，5）。胞質(zhì)分裂為部分分裂，只是在胚盤底部不完全切開，卵裂球仍通過胞質(zhì)橋結(jié)構(gòu)相連。這一時期的6次卵裂通常按規(guī)則的方向方向發(fā)生，因而我們可以通過卵裂球的排列知道其數(shù)目，而不必一一計數(shù)。 這一時期和下一時期的早期都可用Nomarski光鏡劃分每細胞周期以實現(xiàn)精確分期。 胚盤中所有細胞都同時或近似同時地完成細胞周期。約在細胞周期的前半部分，即細胞間期，細胞核存在且可見，核形態(tài)也發(fā)生系統(tǒng)性變化（見下，圖10）。每個早間期細胞核都是球形的，晚間期為類球體，其后隨細胞進入有絲分裂，核逐漸變?yōu)闄E球體，直至有絲分裂前期消失。橢球體的長軸指示了隨后卵裂

25、的取向。有絲分裂期的染色體很難看到。近有絲分裂晚期，在胞質(zhì)分裂之前，卵裂球形狀變得更圓。 卵裂期的分期卵裂期的分期 2-細胞期（細胞期（3/4 h）.結(jié)束第一個合子細胞周期的首次卵裂形成的卵裂溝是垂直的，一直到32-細胞期都是如此。 卵裂溝在近動物極形成， 迅速向植物極伸長， 只經(jīng)過胚盤區(qū)域而不經(jīng)過卵黃區(qū)域 （圖4A） 。在近于胚盤底部，卵裂溝變?yōu)樗椒较?，以Wilson（1889）最早描述的黑鱸（sea bass）那種方式切割胚盤，但仍只是部分與底下的卵黃區(qū)域分開。形成的兩個卵裂球體積相同，似乎不易相互區(qū)分。 隨后的幾次分裂嚴格按第一次分裂的方向進行，然而最終的身體對稱軸（即背腹軸和前后軸）

26、似乎并不能完全由卵裂方向決定（Kimmel and Warga, 1987; Abdelilah等, 1994; Helde 等, 1994），而有些報道則認為可以（Strehlow and Gilbert, 1993; Strehlow等, 1994）。 卵裂期（0.75-2.25h） 10 4-細胞期（細胞期（1 h）.兩個卵裂球不完全裂開（圖4B），裂平面以合適角度穿過動物極和第一次卵裂面。因而第三細胞周期開始于22排列的4個卵裂球。從動物極看（見圖6）胚盤呈橢球體，而第二次卵裂面是沿長軸方向的。 圖 4 . 卵裂期胚胎。除B外均為正面觀，B顯示的是胚胎在動-植物極的扭曲，約偏離正面45

27、 。 A :2-細胞期（0.75 h）；B：4-細胞期（1 h）；C：8-細胞期（1.25 h）；D：16-細胞期(1.5 h)；E：32-細胞期（1.75 h）；F：64-細胞期（2 h）。比例尺=250m 圖 5 . 受精后（在 28.5） ，卵裂球數(shù)目隨時間變化的理想曲線，此段時間卵裂發(fā)生較為同步，在第 10 細胞周期的囊胚中期轉(zhuǎn)變之前。 圖 6. 動物極觀， 前 5 次卵裂平面示意圖。 外圈為卵黃，A 內(nèi)部橢圓為未分裂的胚盤。B-F 為連續(xù)的卵裂，奇數(shù)次卵裂沿短軸切割胚盤，偶數(shù)次卵裂沿長軸切割胚盤。引自 Kimmel 等 (1991)，經(jīng) Wiley & Sons 子公司W(wǎng)il

28、ey-Liss John Inc 惠允。 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 11 8-細胞期（細胞期（1.25 h）.卵裂發(fā)生于第3細胞周期結(jié)束，仍為不完全卵裂。兩個獨立的卵裂面與第1次卵裂面平行，將胚盤切割為24排列的卵裂球。由于去絨膜胚胎通常側(cè)躺于培養(yǎng)皿，其4-細胞面（而非2-細胞面）正對觀察者。此“正面”觀（Kimmel and Law, 1985a）沿奇數(shù)卵裂面（卵裂溝1和3可見，圖7）。一直到囊胚晚期去絨膜胚胎總傾向于以此方向平展開，圖1第一部分（到高囊胚期）、圖4（4B除外）和圖7均為此“正面”觀所得。 16-細胞期（細胞期（1.5 h）.第4組卵裂同樣沿兩個面進行，均與第2次卵裂面平行，產(chǎn)生

29、44排列的細胞，須小心與8-細胞期鑒別，因為其正面觀很相似（圖4C,D）。 第一次出現(xiàn)部分細胞完全與其他細胞分離，這些細胞是位于最中心處的4個卵裂球。此四分體在圖6E中完全被其他細胞包繞。全分裂發(fā)生于近16-細胞期末，因為此次卵裂溝先從胚盤中心底部切開，再向外圍延伸。實際上，作底部切開的卵裂溝并未到達外圍，包圍此四細胞的12個細胞（稱外圍卵裂球）仍與卵黃細胞通過胞質(zhì)橋相連（Kimmel and Law, 1985a）。此分期之后直到囊胚中期，每次卵裂均能完全或大部分分離非外圍卵裂細胞，仍不能完全分離外圍卵裂細胞。 32-細胞期（細胞期（1.75 h）.第5細胞周期結(jié)束時的卵裂通常發(fā)生于四個平行

30、面，而不是位于第1和3卵裂面之間兩個平面。然而此時，斜向卵裂溝很明顯。通常32細胞呈48排列，但除規(guī)則排列之外，不規(guī)則圖 7. 卵裂期正面觀顯微掃描示意圖，顯示從 4-細胞期一直到 64-細胞期卵裂球的世系關(guān)系。各卵裂球根據(jù)期世系標號，同時也指出其位置。每一標號代表胚胎中的兩個細胞，其中一個在圖中可見，而另一個須將胚胎沿動-植物極軸旋轉(zhuǎn) 180才可看到（比如，此處在 4-細胞期只顯示 2 個細胞） 。 在 4-細胞期， 細胞 L 處于第 1 次卵裂面左側(cè)，細胞 R 處于右側(cè)（因此，這里的標號 L和 R 并非指未來胚體的左右側(cè)；見正文） 。細胞 L 分裂產(chǎn)生L1（更靠近動物極）和 L2。L1分裂

31、產(chǎn)生 L11（更靠近動物極）和 L12，如此等等。對于 64-細胞期，深層細胞沒有繪出。 引 自Kimmel and Law (1985a)，經(jīng)由 Academic Press惠允。 囊胚期（2.25-5.25h） 12 排列也很常見。側(cè)面觀，在外圍和動物極之間?？梢婋p層細胞。這是因為胚盤平面彎曲，外圍細胞更近于植物極，其中的部分細胞排到了靠近動物極的非外圍細胞之前。 64-細胞期（細胞期（2 h）.第6次細胞周期結(jié)束時的卵裂是水平的，所以從動物極看細胞排列和32-細胞期很相似，只是正進入第7次細胞周期的卵裂球體積較小。側(cè)面觀，細胞堆疊明顯變高（圖1，4F，7）。第一次出現(xiàn)部分細胞完全覆蓋其他

32、細胞。被覆蓋的細胞（或稱深層細胞）都是由32-細胞期的4個中心細胞中每個分裂產(chǎn)生的兩個子細胞中的一個構(gòu)成；而另一個則仍處于表面，形成胚盤的最上層此時稱包被層（the enveloping layer , EVL）。與此同時，每個外圍細胞的水平卵裂也產(chǎn)生兩個EVL細胞，所以64-細胞期正面觀似有三層EVL細胞（圖7）。 囊胚期（囊胚期（2.25-5.25h） 囊胚期指從128-細胞期或第8次合子細胞分裂開始形成球形胚盤直到第14次卵裂開始原腸期為止這一段時期。此期有很多重要事件發(fā)生：胚胎進入囊胚中期轉(zhuǎn)變（midblastula transition, MBT）、卵黃合胞體層（the yolk s

33、yncytial layer, YSL）形成、外包（epiboly）開始。外包將一直持續(xù)到原腸期。 此期用“實囊胚”（ “stereoblastula”）稱之可能更準確，因為這一術(shù)語意味著胚胎還沒有形成囊胚腔（blastocoele），而事實正是如此（圖8），僅在胚盤深層細胞之間存在不規(guī)則的間隙。卵裂取向不確定，比卵裂期亦更不規(guī)則。此后卵裂產(chǎn)生的子細胞從整齊的細胞面伸出，不論從側(cè)面還是從頂面觀都是如此，因而確定此期分期用細胞大小判斷比用細胞位置判斷更為有效。從動物極觀，胚盤呈輕度橢球形（尤在早期）。 圖 8 . 囊胚期胚胎正面觀。 A： 256-細胞期 （2.5h） ； B： 高囊胚期 （3.

34、3h） ； C： 高囊胚期和橢形期之間的轉(zhuǎn)變 （3.5h） ；D：橢形期和球形期之間的轉(zhuǎn)變（3.8h）；E：穹頂期（4.3h）；F：30%-外包期（4.7h）。比例尺=250m 囊胚早期細胞繼續(xù)同步分裂，和之前節(jié)奏相同（圖5，9）。更準確的說，囊胚早期的分裂為間時同步，因為有絲分裂并不完全同時發(fā)生，相反，在每個細胞周期末期，一條波線穿過胚盤，近動物極細胞最先進入波線，外圍細胞最后進入。波線一般斜穿胚盤，以致從正面觀可見波線沿胚盤長軸穿過細胞野。 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 13 細胞周期延長標志著囊胚中期轉(zhuǎn)變（MBT）的開始（圖9A）。并非所有細胞周期都同時延長或延長相同程度（圖9B）。MBT開始后

35、的任意時刻，一些細胞處于間期，可用Nomarski光鏡很容易看到細胞核（圖10A,D），而另一些細胞處于有絲分裂期（無核，圖10C,E），因而形態(tài)學上可明顯看到不同步性。MBT開始于第10次細胞周期（512-細胞期），比爪蟾（Newport and Kirshner, 1982a,b）早兩個細胞周期，然而MBT的一些性質(zhì)以及如何控制開始，在兩物種間相同（Kane and Kimmel, 1993）。隨間期延長，細胞可以移動，RNA合成增加。 時滯分析（time-lapse analysis）顯示MBT開始后深部細胞在其長的間期內(nèi)可動，其運動似無方向性，至少表面上如此。 囊胚早期的外圍細胞層則有

36、所不同。 它們緊挨著卵黃細胞排列并在整個卵裂期都與之通過胞質(zhì)相連。從第10細胞間期開始（Kimmel and Law,1985b），外圍細胞經(jīng)歷了一次塌陷，其細胞質(zhì)和細胞核均留在與其緊密相連的卵黃細胞質(zhì)中。因此形成卵黃合胞體層（卵黃合胞體層（yolk syncytial layer , YSL），這一結(jié)構(gòu)用Nomarski光鏡可明顯看到，對分期也很重要（圖10）。YSL形成后，原先在胚盤第二層的EVL細胞成為最外層。它們看起來和先前的最外層相似，但有一個重要的不同點在于此時的外圍細胞是非合胞體的：這也是第一次出現(xiàn)所有卵裂球均不與其它細胞通過胞質(zhì)橋相連，除了那些新分裂仍短時間相連的子細胞對之外。

37、 雖然YSL正好在MBT期間形成， 但二者的調(diào)節(jié)機制似相互獨立。 MBT獨自依賴于核-質(zhì)比 （nuclear- cytoplasmic ratio , Kane, 1991） 。 YSL的核在囊胚中期繼續(xù)進行有絲分裂， 但核分裂并不伴隨胞質(zhì)分裂，卵黃細胞仍不分裂并仍保持合胞體。 由于在胚盤， 囊胚中期YSL分裂周期延長， 但又并非延長同樣多，YSL核繼續(xù)進行間時同步分裂，并非不同步。約3個細胞周期之后，在外包開始同時，YSL分裂突然中止(Kane et al., 1992; 另見 Trinkaus, 1992)。YSL核開始增大，可能表示其正在活躍地轉(zhuǎn)錄RNA。 YSL是硬骨魚（teleost

38、s）特有的結(jié)構(gòu)，可能為胚外器官，對胚體無直接貢獻。起先YSL以窄環(huán)包繞胚盤邊緣 （圖10） ， 但很快 （兩個細胞周期內(nèi)） 其延伸到胚盤底部， 形成完全的 “內(nèi)在” 合胞體 （“internal syncytium, the I-YSL）并一直持續(xù)到整個胚胎發(fā)生。I-YSL在胚胎細胞及其卵黃儲備之間的位置上，推測其可能發(fā)揮滋養(yǎng)作用。相應(yīng)的另一部分，E-YSL，在外包期間暫時性位于胚盤邊緣的“外部”。實際上，對硬骨魚類的克鯉魚（Fundulus）的研究顯示，E-YSL這一區(qū)域在外包過程中有重要促進作用（Trinkaus, 1984）。 外包（外包（epiboly）始于囊胚晚期（Solnica-K

39、rezel and Driever, 1994），是YSL和胚盤變薄延伸覆蓋卵黃細胞的過程。就正如向頭上戴一頂滑雪帽一般，最終在原腸期結(jié)束時將卵黃完全吞入。在這一形圖 9. 囊胚中期轉(zhuǎn)變過程中細胞周期的延長和同步性的減弱，開始于第 10 合子周期（512-細胞期） 。A 中不同的標點表示從三種不同的胚胎中收集的數(shù)據(jù)； B中的分布表示一種胚胎中單個細胞周期的延長。 引自Kane and Kimmel (1993)，經(jīng)Company of biologists Ltd. 惠允。 囊胚期（2.25-5.25h） 14 態(tài)發(fā)生運動的早期，胚盤高度變薄，從高高隆起的細胞堆疊（圖8B）變?yōu)閹缀跬缓穸鹊谋?/p>

40、狀多層細胞（圖8F）。最內(nèi)部的細胞向外移動達到表層，標志外包運動完成，內(nèi)部細胞逐步運動過程中隨機與表層細胞混合（Wilson et a1.,1993）。這些所謂的激進插入者（Keller, 1980）引起積極的細胞重組也是早期外包運動的驅(qū)動力之一。插入細胞并未驅(qū)動深層細胞進入包被層（EVL），EVL仍是獨立的單層（Kimmel et al., 1990b）。此外，外圍深層細胞其融合程度遠比中心細胞輕（Helde et al., 1994），如圖8所示，外包開始前，細胞堆積很厚。外圍細胞融合的相對不足對相應(yīng)的早期發(fā)育建立意義重大，這是因為中胚層將從這些非融合的外圍深層細胞開始（參見下文命運圖，圖

41、14）。假定標示中胚層的事件如同爪蟾中似乎出現(xiàn)的那樣始于外包之前， 那么外圍深層細胞群在外包期間相對融合不足可能在維持不同細胞“規(guī)格”（Kimmel et al., 1991）或特征中有重要作用。 圖 10 . 卵黃合胞體層（YSL）的形成，由Nomarski光鏡觀察所得。A：第10細胞周期間期的外圍卵裂球（512-細胞期，箭頭指示其細胞核）。B：當細胞進入有絲分裂期，核消失，特殊的是無胞質(zhì)分裂，核分裂產(chǎn)生的一對子細胞核在第11細胞周期間期再次出現(xiàn)于胞質(zhì)中。在每一間期早期核均為球形（C），隨后，在再一次進入有絲分裂期之前，核變大呈橄欖球形（D）。YSL核在有絲分裂期再次消失（E：第11次有絲分

42、裂，注意到間期細胞核只在胚層細胞中出現(xiàn)，而不是在YSL中，意味著胚層和YSL已不再同步），間期又再次出現(xiàn)（F：第12細胞周期間期），如此經(jīng)過數(shù)個有絲分裂周期，總是位于公共的合胞體內(nèi)。引自Kimmel and Law (1985b)，經(jīng)Academic Press惠允。比例尺=50m 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 15 在激進插入發(fā)生的同時卵黃細胞也發(fā)生明顯的形態(tài)變化，I-YSL表面向動物極膨出或是“隆起”，這一變化是外包開始最明顯的標志（圖8E），同時也大大增加了I-YSL與胚盤內(nèi)表面的接觸面積。卵黃細胞由于隆起而占據(jù)了深層細胞因激進插入而空出的區(qū)域，同時也對深層細胞的外移施加了驅(qū)動力。不論外包運動的

43、結(jié)果如何，它都很明顯同時包括了胚盤和卵黃細胞的運動，并且迅速發(fā)生。在隨后的數(shù)小時內(nèi)，隨外包的繼續(xù)，E-YSL也繼續(xù)前行，穿過卵黃直達依附其上的細胞前方。至少在克鯉魚，橋粒（desmosome）有助于將E-YSL和EVL邊緣連接起來（Betchaku and Trinkaus, 1978），而不斷伸展的YSL似乎將EVL丟在了后邊。 外包似乎有賴于功能微管 （Strahle and Jesuthasan, 1993） 并可能受控于早期作用的合子基因 （Kane, 1991）。目前已知最早表達的基因編碼位于局部的推定轉(zhuǎn)錄因子（putative transcription factors）并在囊胚晚

44、期表達（如notail基因，Schulte-Merker et al., 1992；goosecoid基因，Stachel et al., 1993；snaill基因，Thisse et al., 1993）。 在囊胚期EVL也發(fā)生變化。在卵裂期結(jié)束時EVL細胞數(shù)比深層細胞數(shù)多，但隨著連續(xù)分裂EVL細胞數(shù)目大增，EVL變平、變薄，明顯延伸最終形成密封的更難看到的上皮單層。囊胚晚期，EVL細胞周期比深層細胞周期更長，并表現(xiàn)出更少的同步性。同時EVL細胞也有了世系限制，其細胞分裂產(chǎn)生的子細胞總在EVL內(nèi)。但其發(fā)育潛能在囊胚晚期似并未受到限制，如將其逐個移至深層細胞，其子代將獲得新的分化方向。 囊胚

45、期的分期囊胚期的分期 128-細胞期（細胞期（2.25 h）.第8細胞周期始于128個細胞排列成高的細胞堆疊，位于卵黃細胞之上，呈緊密半球形。與早先卵裂不同，這一結(jié)束64-細胞期的卵裂溝很不規(guī)則，以至于此后幾無例外無法從細胞位置推斷其祖系。然而我們?nèi)匀豢梢耘卸硞?cè)面觀是對應(yīng)于先前的奇數(shù)次卵裂面（正面觀，見前文）還是偶數(shù)次卵裂面，因為胚體仍和4-細胞期描述的那樣為橢球形。從正面觀，EVL細胞在動物極和外圍之間排列成約5個不規(guī)則的層。 256-細胞期（細胞期（2. 5 h）.第8組卵裂結(jié)束時的正面觀（圖8A）顯示EVL細胞形成7個不規(guī)則的層。在第細胞間期，EVL細胞高度變薄，深層細胞數(shù)目大大超過了

46、EVL細胞數(shù)目。第9次卵裂也是最后一次高度同步或間時同步的分裂。 512-細胞期（細胞期（2. 75 h）.此期開始囊胚中期轉(zhuǎn)變；細胞周期在后幾次分裂中不斷延長（圖9A）。正面觀，在動物極和外圍之間有9個不規(guī)則的層。在此期的后半部尤其在正準備進入第10次有絲分裂時，外圍細胞（第一層EVL細胞）失去其連接卵黃細胞的底部邊界（圖10A,B）。這一形態(tài)學變化預(yù)示著YSL形成的開始；外圍細胞在第10次有絲分裂后特異性地不進行胞質(zhì)分裂。第10次卵裂相當同步，以致我們在1分鐘左右的時間里仍能看到所有細胞（包括卵黃細胞）都處于有絲分裂期（即無間期細胞核，圖10C），512-細胞期是可能發(fā)生此類情況的最后一個

47、細胞周期。 1 k-細胞期（細胞期（3 h）.我們?？煽吹結(jié)SL形狀不規(guī)則并將共約20細胞核包含在圍繞胚盤邊緣的單一環(huán)中（圖10D）。第10次卵裂后的細胞數(shù)少于1024，因為在前一分期第一層（最外層）EVL細胞被并入了YSL。此外，還因為YSL的形成方式，此期組成第一層YSL的細胞是前一分期第二層YSL細胞的子細胞。 在某些胚胎，YSL經(jīng)由兩個細胞周期才形成，其開始時間可能早于也可能晚于1 k-細胞期。 YSL約有11層細胞。第11組有絲分裂的發(fā)生猶如波線穿過胚盤，這也是最后一次發(fā)生此種情況。在此期間，第一次可以看到許多細胞與其它細胞不同步，一些由間期細胞核，一些則沒有。 高囊胚期（高囊胚期（

48、3.25 h）.此期標志著胚盤“高聳”于卵黃細胞之上的終結(jié)（圖8B,C）。在外圍細胞和YSL相遇處仍有一緊縮的環(huán)，或稱縊痕?？梢酝ㄟ^胚盤細胞和YSL細胞核的外形和數(shù)目來區(qū)別高囊胚期與其前面的分期。側(cè)面觀可見在外圍和動物極之間有至少11層EVL細胞。在整個高囊胚期胚盤的任一區(qū)域總有一些細胞處于間期，而另一些細胞則處于有絲分裂期。大部分胚盤細胞已完成第12次合子細胞周期，而有一些在此期已完成第13個合子細胞周期。 YSL仍是薄的環(huán)形，但其外周輪廓更為平滑。YSL細胞核在其第2次分裂（第11次卵裂）時再次原腸期 (5.25-10h) 16 出現(xiàn)，通常仍都處于胚盤邊緣之外，并相互包裹得更緊密（圖10F

49、）。 橢形期（橢形期（3.66 h）.隨著胚盤向卵黃的壓縮，動-植物極軸變短?？梢韵胂?，這是由于表面持續(xù)增加的張力引起的。自從1-細胞期非卵黃細胞質(zhì)升高開始形成的胚盤外圍縊痕在此期減弱（圖8C）直至消失。最終從側(cè)面觀胚盤變?yōu)檩喞交臋E球形，因而此期被稱為橢形期。此時，卵裂高度不同步，其中許多處于第12或13次細胞周期。EVL此時極薄，須用Nomarski光鏡仔細觀察才能看到。 YSL在胚盤底部伸展開，同時也與胚盤分離。在此期間，YSL核形成數(shù)排，其中一些細胞核永久地留在了I-YSL。 球形期（球形期（4 h）.動-植物極軸的持續(xù)縮短使得囊胚晚期變?yōu)槠交慕蝮w。其整體形狀在此后數(shù)小時內(nèi)略有變

50、化，很好地進入了原腸期，而細胞重排比以往任何發(fā)育階段都要快?？赏ㄟ^對胚盤下部和卵黃細胞上部的I-YSL深層平面聚焦，根據(jù)其形狀區(qū)分球形期與其后的穹頂期，在前者該平面是平的或近于平的（圖8D）。 此期大部分胚盤細胞處在第13次細胞周期， 在EVL,此期尤其長， 以至于EVL中很少發(fā)生有絲分裂。E-YSL通常比前期明顯變薄，大部分YSL細胞核是內(nèi)在的。YSL發(fā)生最后一次核分裂。通常，去絨膜胚胎動物極開始豎起，而不是像先前那樣倒在一邊。 穹頂期（穹頂期（4.33 h）.I-YSL表面深入胚盤，開始向動物極隆起（圖8E）。這一發(fā)生于卵黃細胞和胚盤界面的顯著而快速的變化是外包運動開始的確切信號。EVL細

51、胞處在較長的第13細胞周期，而許多深層細胞已進入第14細胞周期。E-YSL開始變窄（Solnica-Krezel and Driever, 1994）。YSL細胞核處于有絲分裂后期，也就是說，與穹頂期前的有絲分裂期相比，此時的細胞核總是可見的，它們開始變大，很容易看到。 30%-外包期（外包期（4.66 h）.外包運動，包括卵黃細胞的隆起，產(chǎn)生所謂的胚層（胚層（blastoderm），厚度幾乎一致（圖8F）。此時的胚層包括高度平坦的EVL單層（須用Nomarski光鏡嚴格聚焦于胚層表面，否則不易見）和約4層細胞厚的深層細胞多層（deep cell multilayer , DEL）。 胚層包被

52、卵黃的程度提供了極有用的分期指標。我們定義外包百分率（外包百分率（percent-epiboly）指從此期開始直至外包結(jié)束胚層所包被卵黃的程度。覆蓋百分率（percent-coverage）可能會更準確地表達這一意思，但外包百分率著重于過程，且使用更為廣泛。因此，30%-外包時，是指沿動-植物極軸估計，胚層邊緣達動-植物極距離的30%。 此期許多胚胎的胚層厚度并不嚴格一致。由于囊胚繞動-植物極旋轉(zhuǎn)，從側(cè)面觀察將會看到其邊緣某一區(qū)域明顯比其它地方薄而平。 這一區(qū)域?qū)l(fā)育為胚胎背側(cè) （Schmitz and Campos-Ortega, 1994） 。用低倍Nomarski光鏡最容易觀察到這一不對

53、稱性。然而要完全確定背側(cè)尚需等到胚盾期（6 h）。 原腸期原腸期 (5.25-10h) 外包運動的繼續(xù)， 以及形態(tài)發(fā)生細胞的內(nèi)卷 （involution） 、 集合 （convergence） 和延伸 （extension）運動的發(fā)生，產(chǎn)生了原始胚層和胚軸。 內(nèi)卷運動的開始意味著原腸期的開始，目前可以說是發(fā)生于50%-外包時（圖11A）。結(jié)果在達到50%-外包后的數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)了一個增厚的外圍區(qū)域，稱作胚環(huán)（胚環(huán)（germ ring），幾乎與此同時完全包圍了囊胚邊緣（圖11B，及C箭頭所指）。隨后集合運動幾乎同樣快速地沿胚環(huán)產(chǎn)生一個局部的堆積，稱胚盾（胚盾（embryonic shield ,

54、圖11D，及E箭頭所指）。在發(fā)生這些事件期間，外包暫時中止，但胚盾形成后外包又繼續(xù)。胚層邊緣沿卵黃細胞延伸直至將其完全包繞（圖11F-L）。其延伸近乎恒定速度進行，約每小時包繞卵黃細胞的15%，這也提供了大部分原腸期分期的有用指標（圖12）。 正因為囊胚期沒有囊胚腔，原腸期既沒有消化道（archenteron），也沒有胚孔（blastopore）。DEL細胞在胚層邊緣進行內(nèi)卷，因而發(fā)揮了胚孔的作用。內(nèi)卷通過將胚層向后折疊形成胚環(huán)。因此，胚環(huán)內(nèi)由兩個胚層：位于上方的稱上胚層（epiblast），在整個原腸期繼續(xù)給位于下方的下胚層（hypoblast）提供細胞。注意到上、下胚層這些術(shù)語可同樣描述鳥

55、類胚層結(jié)構(gòu)，但所命名的胚層在這兩種脊椎動物中似乎完全不同。 斑馬魚胚胎發(fā)育的分期 17 圖 11 . 原腸期發(fā)育。 除特別標注外均為左側(cè)觀， 前側(cè)朝上， 背側(cè)朝左。A： 50%-外包期 （5.25h） ； B： 胚環(huán)期 （5.7h） ；C：動物極觀胚環(huán)期，箭頭指示胚環(huán)，胚盾將發(fā)育于胚環(huán)右下方的平坦區(qū)域；D：胚盾期（6h），胚盾標志背側(cè)，是胚環(huán)左側(cè)增厚區(qū)域；E：動物極觀胚盾期，箭頭指示胚盾；F：70%-外包期（7.7h），左邊的胚層背側(cè)比右側(cè)的胚層腹側(cè)厚，前軸下胚層或脊索前板（prechordal plate，箭頭所示）延伸近動物極；G：70%-外包期腹側(cè)觀，但微向前側(cè)傾斜以顯示此時很明晰的軸下

56、胚層 （箭頭所示） 的脊索前板；H： 75%-外包期 （8h） ， 箭頭示腹側(cè)薄的排泄區(qū)；I： 80%-外包期 （8.4h）背側(cè)觀，箭頭示軸中胚層與中線邊界，近軸中胚層在其一側(cè)；J：90%-外包期（9h），在一些胚胎中可見尾芽（箭頭所示）；K：90%-外包期腹側(cè)觀，前側(cè)脊索前板（對比 G）增大為小膨出；L：尾芽期（10h），箭頭示小膨出，短箭頭示尾芽，尾芽腹側(cè)（即此圖左側(cè)）的顯著區(qū)域顯示外包結(jié)束時卵黃消失處。比例尺=250m原腸期 (5.25-10h) 18 作為形態(tài)發(fā)生運動，胚層邊緣的內(nèi)卷似乎很好地證明了一種硬骨魚玫瑰無須鲃（rosy barb）的發(fā)育在很多方面與斑馬魚極為相似（Wood a

57、nd Timmermans, 1988）。然而J.P Trinkaus 最近獲得了一些資料 （尚未發(fā)表） 證明克鯉魚的胚胎根本不發(fā)生內(nèi)卷， 相反， 近于表面的細胞獨自由表面向深部遷移，而不是以整個細胞層進行卷動。這一運動稱內(nèi)移運動（ingression），也可能在斑馬魚中發(fā)生（J. Shih and S.E. Fraser，尚未發(fā)表），這是用高分辨率的時滯分析對Wood和Timmermans曾觀察過的整個細胞野做進一步研究所得。 隨著細胞向內(nèi)運動，一條裂溝稱Brachet裂縫在Nomarski光鏡下開始變得可見（圖13），在橫斷面位于上下胚層之間。我們在75%-外包期的圖1中指出了這一裂縫的所

58、在，但用立體顯微鏡常不易定位（對比圖11和13）。正常情況下，胚層的細胞不會跨過Brachet裂縫進行融合（不過實驗條件下可能，見下文）。兩胚層內(nèi)的細胞以各自不同的方向進行流動。除背側(cè)區(qū)域（見下文），上胚層通常向外側(cè)流動，而達到外圍后又向內(nèi)運動進入下胚層。然后，作為下胚層細胞游離外圍（Warga and Kimmel, 1990）。原腸期結(jié)束時仍留在上胚層的細胞相當于最后的外胚層（ectoderm），將產(chǎn)生諸如表皮、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、 神經(jīng)嵴以及感受基板等組織。 而下胚層將產(chǎn)生中胚層 （mesoderm） 和內(nèi)胚層 （endoderm） ，Thisse等（1993）稱之為“內(nèi)中胚層”（“mesen

59、doderm”）。兩個名稱都強調(diào)了在原腸期的任一分期都不存在三個獨立的胚層，只有兩個。環(huán)繞大部分胚胎周圍的下胚層此時只有一兩層細胞厚（圖13），目前尚不知其何以分化成內(nèi)胚層和中胚層。 圖 13 . 原腸中期胚胎的背側(cè)胚層，75%-外包期，Nomarski光鏡。我們將胚胎植物極朝上，輕輕平放于兩蓋玻片之間，再聚焦，大致在動植物極中線處獲得此光學剖面圖。因而，此圖是沿胚軸觀察而得，中心為中線結(jié)構(gòu)。上面的細胞中胚層覆蓋下面的卵黃細胞。EVL在此期極薄，不可見（但在表面觀可見）。箭頭示上下胚層的顯著邊界Brachet裂縫。上胚層似為厚度幾乎均一的多層細胞，但實際上此時它可能正在形成單細胞層的假層上皮（

60、pseudostratified epithelium，Papan and Campos-Ortega, 1994）。下胚層夾在上胚層和YSL之間。遠離背中線（例如箭頭附近區(qū)域）近軸中胚層似為單層立方細胞。特別在中線區(qū)域Brachet裂縫較不明顯，軸下胚層增厚，可能包含不止一層細胞。隨后，軸下胚層將同時貢獻于中胚層（如脊索）和內(nèi)胚層。比例尺=50m圖 12. 外包期間胚層邊緣覆蓋卵黃前行的速率理想曲線（在28.5） 。外包百分率指的是被胚層覆蓋的胚胎（胚層加卵黃細胞）占整體的份額。 在 6.66h 之后， 其速率相對恒定，約為每小時外包15%。我們觀察了一起發(fā)育的多組胚胎（每組約 12 個）而獲得這些