鴨β-防御素9（avbd9）單克隆抗體的制備及鑒定（可編輯）

1、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，年，第卷，第期,研究資源鴨一防御素單克隆抗體的制備及鑒定李子瑞邵昱昊韓宗璽劉曉麗劉勝旺馬得瑩東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所,哈爾濱；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾 濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，哈爾濱通訊作者，.摘 要本研究旨在制備抗鴨一防御素蛋白的單克隆抗體。首先 用 載體表達(dá)的鴨蛋白做抗原免疫周齡雌性/小鼠，免疫 次，每次間隔，融合前加強(qiáng)免疫次。然后將鴨 基因亞克隆到原核表達(dá)載體的和雙酶 切位點(diǎn)上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 ，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌一株，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、鐮柱純化后做檢測(cè)原。用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和 相結(jié)合的方法進(jìn)行篩選及鑒定，經(jīng) 次亞克隆后得到株單抗，命名

2、為。結(jié)果表明：重組.？ 蛋白大小為，與預(yù)期大小一致，并能被抗？陽(yáng)性血清識(shí)別。單抗在 一.空載體蛋白、蛋白、？蛋白、.蛋白中能夠特異性識(shí)別 蛋白。其亞類(lèi)鑒定重鏈為,輕鏈為鏈。本研究獲得了株鴨 蛋白的 單克隆抗體，單抗 的特異性良好，可用于對(duì)鴨 蛋口的生物學(xué)功能及 活性作進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞 鴨，。，單克隆抗體?,;,:,?,/ / 一 一?肋一?,?,?-基金項(xiàng)耳：本研究rti國(guó)家自然科學(xué)基金資助收稿日期：.接受日期：.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)。 刪，？，一？，禽抗菌肽屬一防御素類(lèi)，為防御素三大亞類(lèi)結(jié)果與分析、和之一,在禽的先天性免疫和獲得性免疫中.鑒定均發(fā)揮重要作用,具有廣譜的抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和免

3、疫增強(qiáng)作用。其分子中氨基酸殘基數(shù)量為 和酶切質(zhì) 粒, 個(gè).，。禽一防御素的主要回收大小為目的片段亞克隆到原 核表達(dá)載體分子特征為含有 個(gè)半胱氨酸殘基組成的三對(duì)二硫中，經(jīng)和酶 切圖鑒定止確后，得到的重組質(zhì)粒為。鍵,分別在一、 一和一處配對(duì)連接形成，富含精氨重組蛋白的表達(dá)和純化 具有親水性和親脂性、特征性片層結(jié)構(gòu)馬得瑩將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到中，經(jīng)等，。迄今為止，已從雞，；在°c誘導(dǎo)表達(dá),？結(jié)果顯示: 在;，；，；處可見(jiàn) 條比較明顯的蛋白帶，與預(yù)測(cè)蛋白帶 的，,;，；大小一致。結(jié)果表明：重組蛋白可以與，、火雞，；，本研究制各的抗鴨 的陽(yáng)性血清反應(yīng),而與空、鴕鳥(niǎo)，；，； 載體不反應(yīng)圖。，

4、、企鵝，以及鴨等禽類(lèi)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 多種禽一防御素。目前，在鴨陽(yáng)性雜交瘤 細(xì)胞篩選結(jié)果體內(nèi)只發(fā)現(xiàn)了個(gè)防御素，分別為鴨廖以純化的.蛋白為檢測(cè)抗文艷等,、鴨廖文艷等，和鴨原，雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，圖和間王瑞琴等，。重組鴨蛋 白廖文接 圖方法進(jìn)行篩選，最終得到株穩(wěn)定分艷等，對(duì)多種細(xì)菌有抗菌活性。鴨基泌的雜交瘤細(xì)胞株,命名為。因在不同口齡鴨組織屮都有表達(dá)，特別是在消化系的亞類(lèi)鑒定統(tǒng)與免疫系統(tǒng)中廣泛分布，并且隨著日齡的增長(zhǎng)，其表達(dá)范圍越廣。鴨 基因在鴨免疫器官中按亞類(lèi)鑒定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行單抗的廣泛表達(dá)顯示，該小分子多肽 在體內(nèi)除了抗菌作的亞類(lèi)鑒定，結(jié)果顯示其重鏈為，輕鏈為鏈。用外，在先天性免疫方面也發(fā)揮重要作

5、用。因此，進(jìn)討論步開(kāi)展鴨在蛋白質(zhì)水平的研究具有極為重要的意義。目前為止，禽防御素的研究與檢測(cè)防御索的生物學(xué)效應(yīng)展示了其在畜牧業(yè)、疾病還僅停留在轉(zhuǎn)錄水平上，檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性都治療等領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景，因此有望成為-種新不是很高,而且檢測(cè)手段也相當(dāng)繁瑣。因此,需耍尋型的抗生素。由于天然防御素在生物體內(nèi)表達(dá)量有找一種靈敏度高，準(zhǔn)確性好，特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。限,直接提取遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足需要。通過(guò)基因工程手段獲單克隆抗體的制備無(wú)疑是最好的選擇。而關(guān)于鴨得防御素是目前最為有效途徑。以抗菌肽基因的克蛋白的單抗制 備國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到報(bào)道。本隆為基礎(chǔ),選擇合適的表達(dá)宿主，可以通過(guò)基因重組研究用一 載體表達(dá)的鴨 蛋白

6、做抗的方法體外大量表達(dá)抗菌肽馬得瑩等，。由于 原，免疫周齡雌性/小鼠。用禽防御素分子量小，抗原決定簇少，直接免疫小鼠很載體表達(dá)的鴨蛋白經(jīng)銀柱純化后做檢測(cè)難以產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使用原核表達(dá)并經(jīng)過(guò)純化的重原。采用常規(guī)的單克隆抗體制備技術(shù)制備抗鴨組蛋白作為免疫原，能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體分蛋白的單克隆 抗體，通過(guò)間接和泌能力，解決了防御素免疫受限的問(wèn)題。本研究利用 方法篩選得 到了一株針對(duì)鴨了大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的標(biāo)簽的重組蛋白做抗的單克隆抗體。原免疫/小鼠，由于標(biāo)簽相對(duì)于防御素鴨防御素 單克隆抗休的制備及鑒定？、？和雙酶切鑒定圖鴨單克隆抗體特異性鑒定產(chǎn)物:/雙酶切產(chǎn)物:蛋白；：？蛋白；：一？蛋白；：蛋白；

7、：蛋白;蛋白；：蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ？：一 一 ;:?;q . q /:重組蛋白的與檢測(cè)結(jié)果重組蛋白的 鑒定：空載體 圖單克隆抗體 的 特異性鑒定；：誘導(dǎo)前；：純化的重組蛋白；：誘導(dǎo)后蛋白：和對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).制的株單克隆抗體在鴨、鴨、雞/.;:中能特異性識(shí)別鴨，所以該單抗所；：；：一 ？；： 針對(duì)的抗原決定簇極有可能是鴨 所特有的。【:高質(zhì)量的防御素單克隆抗體的制備對(duì)防御素生物學(xué)活性的研究和建立鑒定方法具有深遠(yuǎn)意義。不僅為芻較大，容易產(chǎn)生針對(duì)標(biāo)簽的抗體，因此，將鴨建立檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)天然、建立親和層基因克隆到原核表達(dá)載體一中，將此析純化方法以及研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子對(duì)鴨且蛋白作為篩選的檢測(cè)原,這

8、樣有效的避免了假基因表達(dá)的影 響及調(diào)控提供了技術(shù)方法，同主的產(chǎn)生。時(shí)也能對(duì) 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與分布、蛋白質(zhì)結(jié)本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞融合前用/的一雜氮鳥(niǎo)構(gòu)與功能及其在免疫反應(yīng)中的應(yīng)答機(jī)制和體外抗菌令處理/,防止缺乏酶的細(xì)胞發(fā)牛逆jiff實(shí)驗(yàn)等諸多反面進(jìn)行分析。達(dá)到去除返祖細(xì)胞和曾強(qiáng)細(xì)胞對(duì)的敏感性 的。細(xì)胞融合時(shí)米用對(duì)細(xì)胞損靑較小且融合率 材料與方法 薔的 為融合劑，以利于細(xì)胞融合。材料濁合初期，為克服陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞系不穩(wěn)定的現(xiàn)我們及時(shí)對(duì)其進(jìn)行克隆化。菌株和質(zhì)粒載體:大腸桿菌、鴨、鴨、雞 在氨基酸組？和骨髓瘤細(xì)胞/由本實(shí)驗(yàn)室保存。 匕和似性很高，本研究用雜交瘤技術(shù)制備了抗鴨？廖文艷 等，.的單克隆抗體，特異性

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所研 廖文艷 等，,?。維素膜上。按 常規(guī)方法進(jìn)行 封閉過(guò)廖文艷等，重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。夜，一抗為鼠抗？蛋白的陽(yáng)性血實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物清,二抗為羊抗鼠。顯色試劑為。若干只雌性/小鼠周齡單克隆抗體的制備左右，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選及鑒定物中心供給。取骨髓瘤細(xì)胞/與經(jīng)過(guò)免疫的/小 工具酶與主要試劑鼠脾細(xì)胞按：混合,按常規(guī)細(xì)胞融合方法進(jìn)行融 聚合酶、核酸內(nèi)切酶和、合。以純化的.？為檢測(cè)原，用連接酶均購(gòu)自公司大連羊 和間接相結(jié)合的方法進(jìn)行篩選,抗鼠 酶標(biāo)結(jié)合物；抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒;弗陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)過(guò) 次克隆化，直到所有克隆化的細(xì)胞氏不完全佐劑和列氏完

10、全佐劑來(lái)口檢測(cè)陽(yáng)性率為，成功制備了穩(wěn)定分泌的公司美國(guó);鄰苯二胺、培養(yǎng)基、二氨基聯(lián)苯雜交瘤細(xì)胞株。胺、聚乙二醇、胎牛血清等購(gòu)自以一蛋白、蛋白、公司美國(guó)；原核表達(dá)載體一、蛋？蛋白、一蛋白、？白純化試劑盒為公司產(chǎn)品德國(guó)。蛋白和？蛋白動(dòng)物免疫進(jìn)行？電泳，電轉(zhuǎn)移至 膜上，以上述制備的單克隆抗體為一抗,二抗為標(biāo)記的羊抗鼠以純化后的蛋白作為抗原，顯色檢測(cè)。免疫/小鼠，經(jīng)過(guò) 次免疫，每次間隔，以蛋片、蛋白、第一次免疫為抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合，一蛋白、一 蛋白、？第二和第三次抗原與等體積的弗氏不完全佐劑混蛋白和？蛋白合,免疫劑量為每只小鼠，免疫部位為皮下多進(jìn)行？電泳，割膠純化后孔包點(diǎn)注射。進(jìn)行融合前加強(qiáng)

11、免疫一次，用抗原直接被過(guò)夜，按 常規(guī)方法進(jìn)行。一抗:雜交瘤細(xì)腹腔注射，劑量為每只。胞培養(yǎng)上清，二抗:加一羊抗鼠，顯色:加鄰重組質(zhì)粒構(gòu)建爪二胺 底物顯色，終止讀數(shù):加入/,讀取各孔值。和酶切？質(zhì)粒，單克隆抗體腹水的制備回收大小為目的片段，同時(shí)將一空載體用同樣的酶處理，將回收的片段連接到一在接種雜交瘤細(xì)胞的 前天，先給經(jīng)產(chǎn)的載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞。采用已設(shè)/小鼠腹腔注射 弗氏不完全佐劑/只。計(jì)好的表達(dá)引物廖文艷等，以次日腹腔注射分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞 個(gè)/只，質(zhì)粒為模板,對(duì) 提取的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，每只小鼠腹腔注射細(xì)胞懸液,待小鼠腹部明然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為顯膨大后，收集腹水,一只小鼠一