微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識ppt課件

1、1.目目 錄錄v一、一、微生物基本介紹微生物基本介紹v二、二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基v三、三、菌種菌種v四、四、微生物限度檢查法微生物限度檢查法2一、微生物基本介紹1、微生物的定義、微生物的定義微生物是一些形體微小，以單細胞或簡單多細胞、甚至是沒有細胞結(jié)構(gòu)的形式存在的低等生物的統(tǒng)稱。2、微生物的分類、微生物的分類微生物的主要分類單位：域、界、門、綱、目、科、屬、種、變種、亞種（小種）、型、菌株（品系）“種種”是最本的分類單位，例：大腸埃希菌3一、微生物基本介紹3、微生物的特點、微生物的特點v體形微??；v結(jié)構(gòu)簡單；v生長繁殖快；v種類繁多，分布廣，適應(yīng)性強。v包括：細菌、酵母菌、霉菌、放線菌、立克次氏體、

2、支原體和病毒等。4一、微生物基本介紹4、微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)、微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)v4.1細菌細菌v4.2真菌（包括酵母菌和霉菌）真菌（包括酵母菌和霉菌）5一、微生物基本介紹5、微生物與我們、微生物與我們v每張人民幣帶細菌：900萬個；v人體體表及體內(nèi)存在大量的微生物；v皮膚表面：平均10萬個細菌/平方厘米；v口腔“細菌種類超過500種；v腸道：微生物總量達100萬億；6一、微生物基本介紹 （未清洗的未清洗的手）手） （涼水洗的手）涼水洗的手） （洗潔精洗后的洗潔精洗后的手）手） （洗潔精洗后，消毒劑消毒的手）洗潔精洗后，消毒劑消毒的手）7二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)基的制備v培養(yǎng)基的配制： 按

3、處方配制，使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基8二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基配制時注意：配制時注意：v不得使用結(jié)塊或顏色發(fā)生改變的脫水培養(yǎng)基；v常用的溶劑是純化水、蒸餾水，避免使用自來水，因其中含有氯等抗菌物質(zhì)；v脫水型培養(yǎng)基應(yīng)完全溶解于水中，再分裝滅菌；v加熱助溶，注意不要過度加熱；v如需要添加其它組分，加入后應(yīng)充分混勻；v配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器；v配制培養(yǎng)基一般要在1小時內(nèi)完成，如果室溫高，配制時間過長，易使培養(yǎng)基受污染；9二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌v已配制好的培養(yǎng)基最好盡快滅菌；v一般培養(yǎng)基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽菌，通常是12115分鐘；v濕熱滅菌必須嚴格控制滅

4、菌溫度和時間，不可重復(fù)高溫滅菌；v高壓蒸汽滅菌鍋在使用時，內(nèi)置物品不能太多，不要堆積形成死角。v要定期對壓力表等進行檢定，檢定周期一般為半年；v定期對滅菌效果進行檢驗，可采用生物指示菌法、化學(xué)變色紙片（如濕熱滅菌指示條）等進行驗證。10二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基3、培養(yǎng)基的貯藏、培養(yǎng)基的貯藏v貯藏注意：v滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)迅速取出，避免長時間保存在滅菌鍋內(nèi)，造成過度滅菌；v培養(yǎng)基保存前應(yīng)標上名稱和制備日期（或到期日期）；v瓊脂培養(yǎng)基不得在0或0以下存放；v瓊脂平板最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如置冰箱保存，不超過一周；11二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基4、培養(yǎng)的再融化方式、培養(yǎng)的再融化方式v水浴加熱v微波爐注意：v固體培養(yǎng)基滅菌后的再

5、融化只允許一次v融化的培養(yǎng)基應(yīng)置于4550的水浴中，不得超過8小時12二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基5、培養(yǎng)基的性能評估、培養(yǎng)基的性能評估v所有購回的、配制好的培養(yǎng)基均應(yīng)進行質(zhì)量控制試驗（培養(yǎng)基適應(yīng)性檢查）v理化指標（P55）v微生物學(xué)指標（P55）13三、三、菌種菌種1、分類（概念）：、分類（概念）：標 準 菌 株由國內(nèi)或國際菌種保藏機構(gòu)保藏的標準儲備菌株由標準菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物商業(yè)派生菌株由供應(yīng)商提供的所有特性與標準菌株等效的菌株工 作 菌 株由標準儲備菌株以傳代得到的培養(yǎng)物14三、三、菌種菌種注意：注意：v標準儲備菌株、工作菌株都應(yīng)進行純度和特性確認v工作菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種收藏

6、機構(gòu)獲得的標準菌株為第0代）v“1代”是指將活的培養(yǎng)物接種到微生物生長的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。v實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、保存、確認試驗及銷毀的記錄。15三、三、菌種菌種標準菌株：v凍干粉（圖P63）v甘油凍存管（圖P64）16三、三、菌種菌種菌種保藏機構(gòu)：菌種保藏機構(gòu)：vCMCC 中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心vGIMCC 廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心vATCC 美國典型菌種保藏中心例： CMCC （B） 26003菌種保藏機構(gòu) 細菌 菌種編號（金黃葡萄球菌）17三、三、菌種菌種2、菌種的鑒定、菌種的鑒定 金黃色葡萄菌金黃色葡萄菌 CMCC (B) 26003 v

7、甘露醇平板上劃線分純，典型菌落 為黃色圓形突起，表面濕潤光滑；v革蘭氏染色：陽性，球菌。v血漿凝固霉酶實驗：陽性18三、三、菌種菌種銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 CMCC (B) 10104 v溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上劃線分純，典型菌落呈扁平，無定形、周邊擴散，表面濕灰白色，周圍有藍綠色素擴散。v氧化酶實驗：陽性v綠膿菌素：陽性v革蘭氏染色：陰性，桿菌；19三、三、菌種菌種白色念珠菌白色念珠菌 CMCC (B) 98001 v沙氏葡萄糖瓊脂平板上劃線分純，典型菌落乳白色，表面光滑有濃酵母氣味。v革蘭氏染色：陽性，菌體大，球菌。v芽管試驗：陽性20三、三、菌種菌種3、菌種的保藏、菌種的保藏A：甘

8、油冷凍管保藏法v保藏溫度：3080； 保藏菌種有效期：12年v優(yōu)點：保存期較長，反復(fù)傳代導(dǎo)致菌種變異的風(fēng)險較??；v缺點：操作相對復(fù)雜，成本較高。B：斜面低溫保藏法v保藏溫度4左右，保藏時間13個月，但銅綠假單胞菌不宜用本法保存。v優(yōu)點：操作簡便，成本低，比較容易掌握；v缺點：保存期比較短，反復(fù)傳代有引起變異的可能。 保藏溫度保藏溫度保藏保藏有效期有效期優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點甘油冷凍甘油冷凍管管保藏保藏法法-308012年保存期較長，反復(fù)傳代導(dǎo)致菌種變異的風(fēng)險較小操作相對復(fù)雜，成本較高斜面斜面低溫低溫保藏保藏法法4左右13個月 操作簡便，成本低，比較容易掌握保存期比較短，反復(fù)傳代有引 起變異的可能；銅

9、綠假單胞菌不宜用本法保存。21三、三、菌種菌種4、菌種的使用和銷毀、菌種的使用和銷毀v過期菌種應(yīng)及時銷毀，銷毀時應(yīng)經(jīng)12130分鐘的生物滅活處理。22四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法1、定義、定義v微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。2、檢查項目、檢查項目v定量檢查細菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)v定性檢查控制菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌）v檢驗環(huán)境：與無菌檢查相同23四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法3、檢驗量、檢驗量v指一次檢驗用量；10g或10ml，膜劑為100cm2，貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。4、供試液的制備、供試

10、液的制備v根據(jù)供試品的理化特性與生物特性，采取適宜的方法制備供試液；v供試液制備若需加溫時，應(yīng)均勻加熱，且溫度不超過45。24四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法制備原則：v簡便、快速！v供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。25四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法供試品分類供試品分類液體供試品固體、半固體或黏稠性供試品需用特殊供試液制備方法的供試品v非水溶性供試品v膜劑供試品v腸溶及結(jié)腸制劑供試品v氣霧劑、噴霧劑供試品v貼膏劑供試品v具抑菌活性的供試品：具抑菌活性的供試品：培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法 26四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法5、方法驗證

11、、方法驗證v5.1驗證菌株驗證菌株v大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉v5.2計數(shù)方法的驗證計數(shù)方法的驗證v當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。v若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。27四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法v薄膜過濾法計數(shù)時：取規(guī)定量的供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。v測定所加的試驗菌數(shù)（50100cfu）v取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)

12、v用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入50100cfu試驗菌，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。28四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法驗證驗證方法方法：驗證試驗至少應(yīng)進行3次獨立的平行試驗，并分別計算試驗菌每次試驗的回收率不低于70%，若任一次試驗中試驗組的菌回收低于70%，應(yīng)采取適宜的方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行進行方法驗證。29四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法5.3控制菌檢查法驗證控制菌檢查法驗證v當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查。v采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌（1

13、0100cfu）應(yīng)加在最后一次沖洗液中，依法操作。v若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；v若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用相應(yīng)方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。30四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法5.4細菌、霉菌及酵母菌檢查細菌、霉菌及酵母菌檢查v檢查檢查方法：方法：平皿法和薄膜過濾法v按按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)檢查檢查31四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法菌落菌落報告規(guī)則報告規(guī)則：細菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu；霉菌宜選取平均菌落小于10

14、0cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告（即兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。32四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法菌落報告菌落報告規(guī)則示例規(guī)則示例各稀釋級（供試液各稀釋級（供試液1ml/皿）平均菌落計數(shù)皿）平均菌落計數(shù)（cfu）菌數(shù)報告數(shù)菌數(shù)報告數(shù)（cfu/ml.g）原液1：10（-1）1：102（-2）1：103（-3）16482640242064864003不可計4206464000400.5010050010060001070001例：菌數(shù)報告規(guī)則表例：菌數(shù)報告規(guī)則表133四、微生物限度檢

15、查法四、微生物限度檢查法5.4.2薄膜過濾法薄膜過濾法濾膜孔徑不大于0.45m，直徑一般為50mm，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量不超過100ml，總沖洗量不得超過1000ml。v貼膜貼膜 菌面朝上于相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。v陰性陰性對照試驗對照試驗（不得有菌生長）v菌落報告規(guī)則菌落報告規(guī)則 每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu，若濾膜上無菌生長，以1乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。34四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法5.5控制菌檢查控制菌檢查供供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進行，增菌培養(yǎng)基的試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進行，增菌培養(yǎng)基的

16、實際用量同控制菌檢查方法的驗證實際用量同控制菌檢查方法的驗證。v陽性陽性對照試驗：對照試驗：加菌量為10100cfu，陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。v陰性陰性對照試驗：對照試驗：取稀釋液10ml代替供試液，陰性對照應(yīng)無菌生長。v按照不同的給藥途徑，必檢的控制菌不同按照不同的給藥途徑，必檢的控制菌不同。35四、微生物限度檢查法四、微生物限度檢查法不同給藥途徑制劑應(yīng)檢控制菌匯總不同給藥途徑制劑應(yīng)檢控制菌匯總藥品給藥途徑藥品給藥途徑應(yīng)檢控制菌應(yīng)檢控制菌說明說明局部給藥制劑局部給藥制劑金黃色葡萄球菌所有制劑所有制劑銅綠假單胞菌白色念珠菌陰道給藥陰道給藥口服制劑口服制劑大腸埃希菌所有品種所有品種大腸菌群含中藥原藥粉、含中藥原藥粉、沙門菌含動物組織（提取物）含動物組織（提取物）給藥給藥多途徑給藥制劑多