腫瘤細(xì)胞耐藥性與Keap1Nrf2P62的研究進(jìn)展

1、腫瘤細(xì)胞耐藥性與Keap1/Nrf2/P62的研究進(jìn)展【摘要】腫瘤細(xì)胞耐藥性是導(dǎo)致化療失敗及愈后不良的重要原因。在腫瘤治療中，化療藥物作用于腫瘤細(xì)胞， Keapl/Nrf2通路上調(diào), Nrf2及其介導(dǎo)的下游二相抗毒酶表達(dá)增高，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥性升高的重要機(jī)制。近年來(lái)有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為自噬通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗從而產(chǎn)生耐藥性。P62參與調(diào)節(jié)Keapl-Nrf2通路，影響了Keapl的基礎(chǔ)水平和Nrf2的基本活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥都具有重要意義。本文對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性與P62/Keapl/Nrf2通路的相互作用和分子機(jī)制進(jìn)行綜述?！娟P(guān)鍵詞】 Keap1；Nrf2； P62；自噬；腫瘤細(xì)胞耐藥性腫瘤嚴(yán)重

2、影響著人類健康，目前人類已知的癌癥種類已經(jīng)超過(guò)200多種。通常情況下，化療對(duì)于大多數(shù)癌癥患者能取得較好療效，但少數(shù)患者會(huì)走向難以治愈的耐藥階段，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性仍是目前腫瘤治療中面臨的一大難題。在反復(fù)多次使用化療藥物后，少數(shù)腫瘤細(xì)胞能抵抗化療藥物的殺傷作用而存活下來(lái)并不斷增殖，導(dǎo)致患者腫瘤復(fù)發(fā)，這嚴(yán)重影響了癌癥患者的生存質(zhì)量。腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)高氧化應(yīng)激(ROS)的內(nèi)環(huán)境，抗氧化能力會(huì)得以提升并可導(dǎo)致其耐藥性增強(qiáng)。因此，研究腫瘤細(xì)胞適應(yīng)這種氧化應(yīng)激的相關(guān)機(jī)制，有助于尋找克服腫瘤耐藥的途徑。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是腫瘤化療失敗的關(guān)鍵因素。腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物的耐受性分為先天性耐藥和獲得性耐藥。先天性

3、耐藥是指腫瘤細(xì)胞在未接觸藥物時(shí)，耐受相關(guān)因子就已存在腫瘤細(xì)胞內(nèi)；獲得性耐藥則是接觸藥物后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路代償性反應(yīng)，某些基因或其表達(dá)發(fā)生改變，使得化療效果降低。腫瘤產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制多而復(fù)雜，包括凋亡抵抗、細(xì)胞內(nèi)藥物泵出增強(qiáng)、核酸損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、P糖蛋白（P-gp）表達(dá)增加、多藥耐藥相關(guān)基因（Mdr）的表達(dá)增多以及活性氧(ROS)水平升高等。1. 腫瘤耐藥性與ROSROS是有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱，主要包括超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫和單線態(tài)氧等，ROS能作為信號(hào)分子參與對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控1。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和惡化過(guò)程中，許多內(nèi)源和外源性

4、機(jī)制參與其中：腫瘤基因的激活、線粒體功能失常以及代謝異常等腫瘤細(xì)胞內(nèi)部因素均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的升高。最近，有學(xué)者指出細(xì)胞內(nèi)ROS水平輕度增高，能降低細(xì)胞內(nèi)P-gp的水平；而大量ROS能引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而增加Mdr的表達(dá)，進(jìn)一步增加P-gP的產(chǎn)生，腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性狀。在腫瘤細(xì)胞中，致癌基因一方面增加 ROS 的產(chǎn)生，當(dāng)處于持續(xù)高水平的ROS誘導(dǎo)狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞提高自身氧化應(yīng)激水平從而獲得ROS抵抗性，促腫瘤細(xì)胞存活，產(chǎn)生耐藥性，以此來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；另一方面刺激一些ROS 清除酶的表達(dá)發(fā)揮抗氧化機(jī)制，來(lái)最大程度上降低氧化損傷。通過(guò)激活 ROS 清除的酶系統(tǒng)來(lái)抵抗 ROS

5、 的生成是腫瘤細(xì)胞抵抗氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要機(jī)制2。腫瘤細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的平衡機(jī)制會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路發(fā)揮促細(xì)胞存活作用，并進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生3，包括自噬、Keap1/Nrf2通路、Hif-1、硫氧還蛋白和 GSH 抗氧化系統(tǒng)等。例如，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子 HIF-1來(lái)應(yīng)對(duì) ROS 應(yīng)激，增加糖酵解，促進(jìn)細(xì)胞的存活4?；熕幬镒饔?，腫瘤細(xì)胞ROS升高導(dǎo)致錯(cuò)折疊蛋白堆積引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)激，腫瘤細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)自噬降解錯(cuò)折疊蛋白，使得腫瘤細(xì)胞存活并產(chǎn)生耐藥性5。在順鉑耐藥的卵巢癌SKOV3 DDP細(xì)胞中, Keap1/Nrf2/自噬通過(guò)誘導(dǎo)下游相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而避免

6、了ROS刺激引起的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞存活，獲得耐藥性6。因此，保持 ROS 的相對(duì)平衡對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存十分關(guān)鍵,同時(shí)也表明破壞這種平衡機(jī)制可以成為治療腫瘤的一個(gè)好方法。2.腫瘤耐藥性與Keap1/Nrf2通路Keap1/Nrf2通路是細(xì)胞內(nèi)防御氧化清除 ROS 的一個(gè)重要機(jī)制7。人體通常會(huì)暴露在各種ROS刺激的氧化應(yīng)激環(huán)境中，持續(xù)的氧化應(yīng)激會(huì)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)：脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的損傷等，這些氧化損傷會(huì)誘發(fā)人體產(chǎn)生炎癥、心血管疾病、神經(jīng)變性性疾病甚至癌變8。細(xì)胞內(nèi)參與抗氧化反應(yīng)調(diào)節(jié)有三個(gè)主要細(xì)胞成分:Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1 (Keap1), 核因子NF-F2相關(guān)因子2 (Nrf2), 抗

7、氧化反應(yīng)原件 (ARE)9。Keap1的N末端BTB區(qū)是E3泛素連接酶的作用底物，可致使Nrf2泛素化并最終被E3泛素連接酶降解。Keap1的C末端是DGR區(qū)，連接肌動(dòng)蛋白，對(duì)Nrf2起錨定作用。Nrf2包含Neh1-Neh7七個(gè)功能區(qū)，位于Nrf2 C末端是七個(gè)亮氨酸拉鏈組成的亮氨酸拉鏈（bZIP），有助于其與ARE的連接；N末端的Neh2區(qū)包含七個(gè)賴氨酸殘基，負(fù)責(zé)和Keap1上C末端的Kelch區(qū)結(jié)合并錨定在肌動(dòng)蛋白骨架上10。Keap1/Nrf2/ARE通路調(diào)節(jié)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激，保持細(xì)胞維持在相對(duì)平衡狀態(tài)，Nrf2為 ARE介導(dǎo)基因表達(dá)的主要調(diào)控者，Keap1也被稱為INrf2,對(duì)Nrf

8、2發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用11。Keap1/Nrf2/ARE通過(guò)上調(diào)下游各種細(xì)胞保護(hù)性二項(xiàng)抗毒酶來(lái)發(fā)揮最終的抗氧化作用，因?yàn)檫@些二項(xiàng)抗毒酶有相對(duì)較長(zhǎng)的半衰期，如GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、醌氧化還原酶-1（ NQO1），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx），血紅素加氧酶-1（HO-1），谷氨酸-半胱氨酸連接酶（GCL）等12。Nrf2和它的胞質(zhì)接頭蛋白Keap1則是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者。在面對(duì)外界應(yīng)激壓力時(shí)，細(xì)胞自我解毒以維持自身內(nèi)環(huán)境的能力就顯得尤其重要13。在正常情況下，Keap1將Nrf2固定在胞質(zhì)的肌絲上，聯(lián)合泛素化連接酶將Nrf2

9、水解；一旦細(xì)胞受到親電子或氧化物攻擊，Keap1就會(huì)釋放Nrf2入核，穩(wěn)定的Nrf2進(jìn)入核內(nèi)與ARE原件結(jié)合，從而激活下游GAPDH、GCLC、NQO1、HO-1等一系列二項(xiàng)解毒酶的表達(dá)14。Keap1是如何釋放Nrf2的具體機(jī)制還沒(méi)有定論：1）Keap1與蛋白酶體泛素化連接酶連接，通過(guò)調(diào)節(jié)泛素化連接酶決定是否釋放Nrf2 15。2）親電子物質(zhì)作用，Keap1與泛素化連接酶分離，使Nrf2不能被泛素化水解，Nrf2增多16。3）在人體受到親電子或氧化物攻擊時(shí)，Keap1中第27個(gè)半胱氨酸中的兩個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基可能作為次反應(yīng)的關(guān)鍵感應(yīng)部位調(diào)節(jié)Nrf2的表達(dá)，Nrf2會(huì)上調(diào)二項(xiàng)抗毒酶的表達(dá)。

10、氧化物質(zhì)通過(guò)與Keap1半胱氨酸殘基反應(yīng)，從而激活Nrf2通路17。Nrf2水平的上調(diào)促進(jìn)癌癥細(xì)胞的存活，從而有助于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性18。Adam Lister等認(rèn)為，可以通過(guò)藥理學(xué)水平控制Nrf2的水平和活性，以此來(lái)控制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及化療敏感性19。簡(jiǎn)而言之，腫瘤細(xì)胞為了抵抗化療藥物的攻擊，其Keapl-Nrf2通路多處于過(guò)度激活狀態(tài)，高表達(dá)的Nrf2被認(rèn)為是腫瘤耐藥的標(biāo)志。3.腫瘤細(xì)胞耐藥性與自噬3.1 自噬自噬是細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏或能量代謝障礙的情況下，一種通過(guò)降解代謝細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)折疊或錯(cuò)聚集的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來(lái)維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程20。P62/SQSTEM1偶聯(lián)于微管相關(guān)蛋白輕鏈3（

11、LC3-II），作為一種調(diào)節(jié)因子參與自噬體的構(gòu)成，在自噬的中、晚期被降解21，細(xì)胞內(nèi)整體p62水平的表達(dá)與自噬活性存在負(fù)相關(guān)。在自噬開(kāi)始階段，細(xì)胞將自身的蛋白質(zhì)，細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)包裹進(jìn)自噬小體內(nèi)，這些自噬體通過(guò)與溶酶體結(jié)合，發(fā)育成成熟的自噬溶酶體將錨定的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等結(jié)合溶酶體水解酶水解，來(lái)維持細(xì)胞自身代謝平衡。自噬被認(rèn)為是II型細(xì)胞死亡，也叫細(xì)胞非程序性死亡來(lái)區(qū)別于細(xì)胞凋亡。與細(xì)胞凋亡不同，在大多數(shù)情況下，細(xì)胞自噬是通過(guò)適應(yīng)外部環(huán)境變化從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞存活作用22 。當(dāng)外界環(huán)境施加壓力，例如：化療、放療等情況引起的代謝性DNA損傷，自噬被激活，導(dǎo)致細(xì)胞的生存或死亡23 。近來(lái)有大量研究數(shù)據(jù)表

12、明自噬在腫瘤發(fā)生過(guò)程中存在雙面性：一方面，細(xì)胞被誘導(dǎo)的自噬可減輕細(xì)胞代謝壓力，來(lái)保護(hù)細(xì)胞基因組的完整，從而產(chǎn)生耐藥性，也就是促腫瘤細(xì)胞生存作用24, 25；另一方面，自噬性死亡也可能是凋亡耐受的腫瘤細(xì)胞的一種死亡方式26 27。未來(lái)，自噬在逆轉(zhuǎn)腫瘤腦藥性研究中可能成為重要靶點(diǎn)。3.2 自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性自噬在化療過(guò)程中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，這也是化療失敗以及腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因28?？拱┲委煛⒓?xì)菌感染以及ROS引起氧化損傷均與蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊有關(guān)，錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜聚集，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)激，若這些錯(cuò)折疊蛋白被蛋白酶體或自噬降解，則細(xì)胞存活產(chǎn)生耐藥性。但如果持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得不到緩解，

13、則誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力，發(fā)揮抗癌作用，細(xì)胞凋亡2930 。p62蛋白作為泛素化蛋白自噬性降解的接收器或適配器，可以在順鉑刺激人卵巢癌HOCCs細(xì)胞的過(guò)程中，和泛素化蛋白或蛋白聚合物結(jié)合，再將它們定位到自噬小體中，通過(guò)自噬降解錯(cuò)折疊蛋白從而避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡30。大量研究表明，抑制自噬，會(huì)使耐藥腫瘤細(xì)胞恢復(fù)對(duì)化療藥物的敏感性22 ，例如：敲除LC3會(huì)使耐藥細(xì)胞恢復(fù)其對(duì)曲妥珠單抗的敏感性31；在食管癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中，抑制自噬會(huì)提高細(xì)胞對(duì)順鉑和5-氟尿嘧啶等化療藥物的化療敏感性32, 33；在慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞中，甲磺酸伊馬替尼通過(guò)抑制自噬而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用34；敲除p62后，可

14、恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性；自噬抑制劑3-MA作用于耐藥腫瘤細(xì)胞后，順鉑誘導(dǎo)的泛素化蛋白在耐藥腫瘤細(xì)胞中聚集，并且凋亡細(xì)胞數(shù)目增加30 。4.Keap1/Nrf2/P62與腫瘤耐藥的相關(guān)性P62作為自噬中的標(biāo)記蛋白，它綁定泛素化蛋白聚合物并將它們運(yùn)送到自噬體進(jìn)行自噬降解。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥的人卵巢癌SKOV3 DDP細(xì)胞中p62含量多于SKOV3細(xì)胞。并且，用H2O2作用于耐順鉑的SKOV3 DDP細(xì)胞后p62會(huì)被自噬降解；敲除p62后，順鉑耐藥的SKOV3細(xì)胞耐藥性被逆轉(zhuǎn)6，這提示p62對(duì)于耐藥性的形成有很重要的作用。順鉑耐藥細(xì)胞避免了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，是因?yàn)閜62有效地調(diào)節(jié)Kea

15、p1/Nrf2通路使得SKOV3細(xì)胞獲得順鉑耐藥性。P62作為一種多功能蛋白，直接與Keap1的相互作用，介導(dǎo)Keap1與泛素化合物以及自噬體連接從而自噬性降解，使Nrf2穩(wěn)定地在細(xì)胞核內(nèi)積累，從而激活下游一系列細(xì)胞保護(hù)性基因35 36。Fan, W.等認(rèn)為，在氧化應(yīng)激條件下，keap1-nrf2-p62復(fù)合物的形成對(duì)于清除泛素化聚合物很有必要37。有報(bào)道認(rèn)為，兩分子的Keap1是通過(guò)與一分子的nrf2上neh2區(qū)的DLG和ETGE兩個(gè)位點(diǎn)連接，且ETGE區(qū)的連接力強(qiáng)于DLG區(qū)。p62會(huì)競(jìng)爭(zhēng)keap1與nrf2連接弱的DLG位點(diǎn)，導(dǎo)致nrf2與keap1的解離38（如圖1所示）。但目前關(guān)于ke

16、ap1-nrf2-p62這一連接復(fù)合物仍然存在爭(zhēng)議，Jain, A.等則認(rèn)為keap1-p62連接的KIR位點(diǎn)與p62-LC3的LIR位點(diǎn)相似，這便造成keap1、LC3競(jìng)爭(zhēng)p6239。卵巢癌細(xì)胞中，Nrf2通過(guò)誘導(dǎo)自噬從而導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞耐藥、Nrf2高表達(dá)；并且下調(diào)Nrf2的表達(dá)后，自噬相關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)下降40。過(guò)表達(dá)的p62會(huì)引起Keap1自噬降解，然而過(guò)表達(dá)突變型的p62并不會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象41，這表明p62介導(dǎo)的Nrf2上調(diào)是依賴Keap1的。更進(jìn)一步的研究認(rèn)為p62的磷酸化，使得p62與Keap1的親和力增強(qiáng)，p62定位Keap1到自噬小體，介導(dǎo)Keap1自噬降解42，Nrf2釋放入核，從而導(dǎo)致Nrf2在核內(nèi)累積量增多43。也有科學(xué)家認(rèn)為Keap1的自噬性降解與它63位半胱氨酸磷酸化有關(guān)，通過(guò)磷酸化使Keap1與p62發(fā)生反應(yīng)，從而介導(dǎo)Keap1自噬性降解39。綜上所述，p62與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)Keap1，使Nrf2激活，并且p62又會(huì)啟動(dòng)ARE基因的表達(dá)，從而使Nrf2與ARE共同激活下游一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)；另一方面，Nrf2激活又會(huì)使p62高表達(dá)，因此這兩條途徑形成一個(gè)抗氧化反應(yīng)的正反饋循環(huán)42, 44。5.小結(jié)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制十分復(fù)雜?；熕幬镒饔媚艽龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)