酶與蛋白質(zhì)工程-劉

1、名詞解釋：1、 一級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序。是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)，并由基因上遺傳密碼的排列順序決定。2、 二級(jí)結(jié)構(gòu)：一段連續(xù)的肽單位借助于氫鍵，排列成的具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。包括-螺旋、-折疊、回折、環(huán)肽鏈、無規(guī)則卷曲等。是多肽鏈主鏈區(qū)域的規(guī)則結(jié)構(gòu)，不涉及側(cè)鏈構(gòu)象和與多肽鏈其他部分的關(guān)系3、 結(jié)構(gòu)域：二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)模體以特定的方式組織連接，在蛋白質(zhì)分子中形成2個(gè)或多個(gè)在空間上可以明顯區(qū)分的三級(jí)折疊實(shí)體。4、 -螺旋兩親性：-螺旋一側(cè)主要分布著親水（極性）氨基酸殘基，而在另一側(cè)主要集中疏水殘基，所以具有兩親性。5、 三級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步盤曲或折

2、疊形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。是多肽鏈上所有原子包括主鏈和殘基的側(cè)鏈在三維空間中的分布6、 分子伴侶：是一種引導(dǎo)蛋白質(zhì)正確組裝、折疊的蛋白，但不構(gòu)成被介導(dǎo)蛋白質(zhì)的組成7、 第二遺傳密碼：氨基酸順序與蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)之間存在著的對(duì)應(yīng)關(guān)系稱為第二遺傳密碼或折疊密碼8、 同源蛋白質(zhì)：在不同生物體中具有相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱為同源蛋白質(zhì)9、 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)：為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設(shè)計(jì)方案10、 Scaffold設(shè)計(jì)：即框架設(shè)計(jì)，是指對(duì)蛋白質(zhì)分子的立體設(shè)計(jì)11、 定點(diǎn)突變：一般是知道要突變位點(diǎn)的情況下，應(yīng)用PCR方法通過引物將突變引入DNA分子從而改變氨基酸序列。12、 定向進(jìn)化：采用隨機(jī)的基

3、因突變或基因重組技術(shù)與定向的突變體篩選方法相結(jié)合的分子進(jìn)化技術(shù)。13、 內(nèi)含肽：在蛋白質(zhì)成熟過程中被剪切掉的一段框內(nèi)融合于前體蛋白的氨基酸序列。14、 融合蛋白標(biāo)簽：用于重組蛋白質(zhì)的純化，目的蛋白質(zhì)的檢測(cè)和定向固定等應(yīng)用的一類蛋白質(zhì)或多肽，作為構(gòu)建融合蛋白的標(biāo)簽15、 易錯(cuò)PCR：一種利用PCR技術(shù)簡(jiǎn)便快速在DNA序列中隨機(jī)制造突變的方法，其基本原理是通過改變正常PCR反應(yīng)體系中某些組分的數(shù)量或質(zhì)量，隨機(jī)引入錯(cuò)誤堿基從而創(chuàng)造序列多樣性的DNA序列文庫(kù)。16、 DNA shuffling：DNA改造，單個(gè)基因或一組相關(guān)基因經(jīng)酶切產(chǎn)生一系列隨機(jī)大小的DNA片段的隨機(jī)突變方法。17、 硫酸銨分級(jí)沉淀

4、：由于不同的蛋白質(zhì)沉淀所需要的鹽離子濃度不同，因此通過調(diào)節(jié)硫酸銨的濃度可使不同的蛋白質(zhì)分階段沉淀下來，這就是硫酸銨分級(jí)沉淀18、 分子篩層析：是以多孔性凝膠材料為支持物，根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同，導(dǎo)致阻滯作用不同而先后流出支持物，從而達(dá)到分離純化目的的一種層析方法。19、 親和層析：利用蛋白質(zhì)與配體專一性識(shí)別并結(jié)合的特性而分離蛋白質(zhì)的一種層析方法。20、 電泳（EP）：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極運(yùn)動(dòng)，稱為電泳21、 噬菌體表面展示技術(shù)：是將目的基因克隆在絲狀噬菌體衣殼蛋白的基因中，使外源基因產(chǎn)物與衣殼蛋白融合，伸展在噬菌體表面，用來直接檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物活性的一種基因表達(dá)篩選技術(shù)22

5、、 酵母表面展示技術(shù)：將外源靶蛋白基因(外源蛋白)與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，利用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面的機(jī)制使靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。23、 蛋白質(zhì)芯片：也叫蛋白質(zhì)微陣列，是將大量蛋白質(zhì)有規(guī)則地固定到某種介質(zhì)載體上，利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、酶與底物、蛋白質(zhì)與其他小分子之間的相互作用檢測(cè)分析蛋白質(zhì)的一種芯片。24、 表面等離子體共振（SPR）：是表面等離子體在金屬和電介質(zhì)的交界面上形成的一電荷層，在電磁波的作用下，表面等離子體發(fā)生共振的現(xiàn)象。25、 蛋白質(zhì)組：指基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其存在方式。26、 蛋白質(zhì)組學(xué)：定量檢測(cè)蛋白質(zhì)水平上的基因表達(dá)，從而揭示生物學(xué)行為以及基因

6、表達(dá)調(diào)控機(jī)制的學(xué)科27、 蛋白質(zhì)組豐度：某種蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)組中的相對(duì)含量28、 激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）： 激光捕獲顯微切割是一項(xiàng)在顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類型細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞的原位技術(shù)。29、 抗體工程：是通過對(duì)抗體分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究，有計(jì)劃地對(duì)抗體蛋白序列進(jìn)行改造，改善抗體某些功能的技術(shù)。30、 免疫毒素：一種運(yùn)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)將毒素肽與對(duì)靶細(xì)胞具有高度特異性的抗體連接起來而形成的融合蛋白。31、 多克隆抗體：因?yàn)榭乖晕镔|(zhì)具有多種抗原決定簇，所以刺激機(jī)體產(chǎn)生了多種B細(xì)胞克隆針對(duì)不同抗原決定簇產(chǎn)生的混合抗體，并合成分泌各抗體到血清和體液中，這種用體內(nèi)免疫法所獲得的免疫

7、血清為多克隆抗體。32、 單克隆抗體：由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體33、 基因工程抗體：又稱重組抗體，利用基因重組技術(shù)對(duì)編碼抗體的基因按不同需求進(jìn)行加工改造和重新裝配，引入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，由其表達(dá)生產(chǎn)出的預(yù)期的抗體分子。問答：1. 蛋白質(zhì)工程與基因工程的聯(lián)系和區(qū)別?；蚬こ淌且訢NA雙螺旋分子結(jié)構(gòu)為理論基礎(chǔ)，以DNA體外操作作為技術(shù)基礎(chǔ)，按人們意愿改造基因，轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)產(chǎn)生人們期望的產(chǎn)物或新遺傳性狀的生物。蛋白質(zhì)工程師從DNA水平改變基因入手，通過基因重組技術(shù)改造蛋白質(zhì)或設(shè)計(jì)合成具有特定功能的新蛋白；也就是說蛋白質(zhì)工程是依賴于基因工程獲得蛋白產(chǎn)物

8、，基因工程又為蛋白質(zhì)工程提供基因克隆，表達(dá)、突變及活性檢測(cè)等關(guān)鍵技術(shù)。2. 什么是蛋白質(zhì)構(gòu)象病？其發(fā)病原因是什么？由于蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象改變而產(chǎn)生的異常的疾病稱為構(gòu)象病。由于組織中特定蛋白質(zhì)發(fā)生了構(gòu)象改變，進(jìn)而聚集并產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致生物學(xué)功能喪失，出現(xiàn)組織器官的病理性改變的一類疾病。3. 維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力有哪些？分別說明。 疏水效應(yīng)：是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)方面起重要作用； 氫鍵：酰氨基與羰基之間常常形成氫鍵使肽鏈產(chǎn)生-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)； 范德華力：包括吸引力和斥力兩種相互作用，具有加和性，對(duì)球蛋白的穩(wěn)定性有一定的作用； 共價(jià)交聯(lián)：如二硫鍵，同樣有助于某些球蛋白的

9、天然構(gòu)象的穩(wěn)定； 離子相互作用：帶有相反電荷的側(cè)鏈之間的離子相互作用也能幫助穩(wěn)定球蛋白的結(jié)構(gòu)，但作用很微弱； 配位鍵：兩個(gè)原子之間由單方面提供共用電子對(duì)形成的共價(jià)鍵稱為配位鍵，金屬離子往往以配位鍵與蛋白質(zhì)連接，參與蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成與維持。4. 試述蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的程序（請(qǐng)輔以圖說明）。設(shè)計(jì)目標(biāo) 檢測(cè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)修正設(shè)計(jì)建立結(jié)構(gòu)模型獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息分析序列合成 首先通過生物信息學(xué)對(duì)所研究對(duì)象的結(jié)構(gòu)和功能信息進(jìn)行收集分析，建立研究對(duì)象的結(jié)構(gòu)模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究，對(duì)其功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究和預(yù)測(cè)，然后提出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改造的設(shè)計(jì)方案，再通過基因工程改造得到設(shè)計(jì)產(chǎn)物，并通過相關(guān)

10、試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行修正設(shè)計(jì)，往往要經(jīng)過幾次這樣的循環(huán)才能成功。5. 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)原則是怎樣的？1）-螺旋的設(shè)計(jì)原則 選擇傾向于形成-螺旋的氨基酸 設(shè)計(jì)兩親性的-螺旋時(shí)，為使結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)親水面和一個(gè)疏水面，疏水性氨基酸殘基應(yīng)按照3或4的間隔排列 為穩(wěn)定-螺旋，常常在N端加一個(gè)N帽，在C端加一個(gè)C帽 設(shè)計(jì)-螺旋時(shí)，常使帶正電荷的氨基酸殘基靠近C端，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基靠近N端，形成一個(gè)N端指向C端的偶極矩2）-折疊的設(shè)計(jì)原則選擇折疊片傾向性較大的氨基酸殘基使親水性殘基和疏水性殘基相間排列3）轉(zhuǎn)角的設(shè)計(jì)原則 選擇合適的轉(zhuǎn)角類型6. 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的種類有哪些？它們各自有哪

11、些特點(diǎn)？1、 定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾法：“小改”，通過定點(diǎn)突變技術(shù)或盒式替換技術(shù)有目的地改變幾個(gè)氨基酸殘基或化學(xué)修飾；2、 拼接組裝設(shè)計(jì)法：“中改”，對(duì)來源于不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行剪裁、拼接、組裝，獲得具有新特點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子，又稱“分子剪裁”；3、 從頭設(shè)計(jì)全新蛋白質(zhì)：“大改”，從設(shè)計(jì)氨基酸序列結(jié)構(gòu)開始進(jìn)行全新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)，即從頭設(shè)計(jì)一個(gè)全新的自然界不存在的蛋白質(zhì)，使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期功能。7. 簡(jiǎn)述酶分子的修飾方法有那些？ 金屬離子置換修飾；大分子結(jié)合修飾，側(cè)鏈基團(tuán)修飾，肽鏈有限水解修飾，核苷酸鏈剪切修飾，氨基酸置換修飾，核苷酸置換修飾，物理修飾8. 為什么要發(fā)展基因融合技術(shù)？利用基因融

12、合技術(shù)可獲得由不同功能的蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白基因融合技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)： 通過與一特異性蛋白質(zhì)或其特異的結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，可使表達(dá)產(chǎn)物得到有效的回收、純化； 通過與具有不同功能的蛋白質(zhì)融合，產(chǎn)生新的多功能蛋白； 與報(bào)告分子應(yīng)用于蛋白定位及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物； 可以穩(wěn)定表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)率，避免目的產(chǎn)物被快速降解； 通過與特定的蛋白質(zhì)形成融合蛋白，可以防止包涵體的產(chǎn)生； 通過與特定的肽段進(jìn)行融合表達(dá)，可以將表達(dá)的外源蛋白定向地定位在宿主的不同區(qū)位； 是獲得蛋白的可靠和可重復(fù)性的方法；9. 重疊延伸PCR技術(shù)引入突變位點(diǎn)的原理是怎樣的（請(qǐng)輔以圖說明）？該方法必須在特定的待突變位點(diǎn)和上下游分別設(shè)計(jì)引

13、物，引物A、B為上下游引物，分別與模板鏈互補(bǔ)，引物C、D為具有互補(bǔ)序列的突變引物，先以引物B、C在一定條件下進(jìn)行PCR，得產(chǎn)物BC，再以引物A、D進(jìn)行PCR得產(chǎn)物AD，混合這兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，以A、B為引物進(jìn)行PCR，即可得到帶突變點(diǎn)的DNA片段。10. 在大腸桿菌中影響外源基因表達(dá)的因素有哪些？如何在大腸桿菌實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)？啟動(dòng)子的強(qiáng)弱：較強(qiáng)的、能夠由一些簡(jiǎn)單并經(jīng)濟(jì)合算的方式誘導(dǎo)啟動(dòng)、控制的本底轉(zhuǎn)錄低的啟動(dòng)子，如T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄終止區(qū)：有效的轉(zhuǎn)錄終止子mRNA穩(wěn)定性：通常用非常強(qiáng)的啟動(dòng)子來彌補(bǔ)不穩(wěn)定的mRNA轉(zhuǎn)錄物密碼子偏好性：根據(jù)其表達(dá)所需的密碼子偏好性選擇相應(yīng)的載體，或?qū)d體進(jìn)行適當(dāng)修飾

14、表達(dá)定位：當(dāng)在細(xì)胞外周質(zhì)和外分泌表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，有利于目的蛋白的純化，減少細(xì)菌對(duì)其的降解，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；宿主選擇：選擇正確的宿主菌，對(duì)外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平會(huì)產(chǎn)生一定的影響；培養(yǎng)條件控制：大腸桿菌的蛋白質(zhì)產(chǎn)量可以通過高細(xì)胞密度培養(yǎng)系統(tǒng)而獲得顯著提高。11. 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)主要有哪些？各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？ 同基因工程制藥大題第十題 書 P4312. Western-blotting的主要實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟如何？通過特異性抗體對(duì)凝膠處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，然后通過分析著色位置和深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或生物組織中表達(dá)情況的信息。主要包括三個(gè)步驟：第一步：凝膠電泳；第二

15、步：轉(zhuǎn)膜，把凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移固定到薄膜上；第三步：抗原抗體顯色反應(yīng)。13. 離子交換層析分離純化蛋白質(zhì)的主要原理、實(shí)驗(yàn)步驟如何？蛋白質(zhì)在一定的pH下帶有電荷，不同的蛋白質(zhì)所帶的電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同，這樣，混合蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下，電荷吸引力作用小的蛋白質(zhì)先流過凝膠，大的后流出，從而將蛋白質(zhì)分離純化。主要有三大步驟：凝膠預(yù)處理；裝柱；平衡，上樣，洗脫，檢測(cè)和收集。14. 下圖是人G6PD蛋白的理化性質(zhì)信息圖，由圖中你能得到哪些信息？氨基酸總數(shù)相對(duì)分子總量等電點(diǎn)氨基酸組成及其比例酸性氨基酸數(shù)堿性氨基酸數(shù)原子組成及含量分子式總原子數(shù)15. 下圖是人b

16、eta-globin的理化性質(zhì)信息圖，由圖中你能得到哪些信息？16. 如何利用表面等離子體共振（SPR）儀研究蛋白質(zhì)相互作用？先在傳導(dǎo)膜上用配體進(jìn)行修飾，然后對(duì)溶液的待分析物的相互作用進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)樣品中的分子結(jié)合到傳感器表面時(shí)，表面的濃度變化導(dǎo)致了折射率的變化。這樣就可以檢測(cè)到SPR反應(yīng)，以反應(yīng)-時(shí)間做出傳感圖，這樣就提供了一個(gè)定量的測(cè)定分子間相互作用的方法。17. 如何利用蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（PMCA）設(shè)計(jì)一個(gè)靈敏的朊病毒（PrPsc）檢測(cè)方法？ 在動(dòng)物組織中提取出痕量的PrPsc和大量的PrPc，進(jìn)入PMCA循環(huán)的第一個(gè)階段，讓兩者共同培育，在外界條件下促使PrPc向PrPsc轉(zhuǎn)化

17、，形成PrPsc聚合體；第二階段用超聲波對(duì)樣品處理，以打碎PrPsc聚合體。使PrPsc “種子”數(shù)量得到增加，從而進(jìn)行PrPsc循環(huán)擴(kuò)增，使其達(dá)到常規(guī)方法能夠檢測(cè)到的程度。18. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)方法主要有哪些？雙向電泳技術(shù)、激光捕獲顯微切割技術(shù)；圖譜分析技術(shù)；生物質(zhì)譜技術(shù)；同位素親和標(biāo)簽；表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；熒光差異凝膠電泳；多維液相層析質(zhì)譜技術(shù)；19. 列舉并詳細(xì)說明三種研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。SPR技術(shù)：先在傳導(dǎo)膜上用配體進(jìn)行修飾，然后對(duì)溶液的待分析物的相互作用進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)樣品中的分子結(jié)合到傳感器表面時(shí)，表面的濃度變化導(dǎo)致了折射率的變化。這樣就可以檢測(cè)到SPR反應(yīng)，

18、以反應(yīng)-時(shí)間作出傳感圖，這樣就提供了一個(gè)定量的測(cè)定分子間相互作用的方法。酵母雙雜交技術(shù)：很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子具有兩個(gè)可分割開的結(jié)構(gòu)域，稱為DNA特異結(jié)合域BD和轉(zhuǎn)錄激活域AD，一個(gè)完整的表達(dá)需要同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。將兩個(gè)待測(cè)蛋白分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成融合蛋白，若兩個(gè)待測(cè)蛋白之間能發(fā)生相互作用，就可以通過待測(cè)蛋白的橋梁作用，使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起，從而激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)，這樣就可以檢測(cè)出蛋白質(zhì)的相互作用噬菌體展示技術(shù)：將外源蛋白與特定噬菌體衣殼蛋白融合并展示于噬菌體表面論述：1. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系是怎樣的？請(qǐng)?jiān)敿?xì)論述并舉例說明。蛋白質(zhì)的功能與其特定的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，

19、蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是其功能活性的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)變性時(shí)，由于空間構(gòu)象破壞，致使蛋白質(zhì)生物功能喪失，變性蛋白質(zhì)復(fù)性后，構(gòu)象復(fù)原，活性又能恢復(fù)。當(dāng)某些小分子物質(zhì)與某些蛋白質(zhì)的非催化部分特異性地結(jié)合，引起該蛋白的空間構(gòu)象改變，會(huì)使其生物活性升高或降低。如肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能：在肌紅蛋白中，作為輔基的血紅素非共價(jià)的結(jié)合在肌紅蛋白的疏水空穴中，通過配位鍵與肽鏈中的93位氨基酸殘疾結(jié)合，這對(duì)肌紅蛋白天然構(gòu)象的形成與穩(wěn)定起到顯著的作用。2. 引入基因突變的技術(shù)有哪些？請(qǐng)簡(jiǎn)述各技術(shù)原理。P763. 為了得到較純的G6PD（約59.3KD）蛋白，用于制作單克隆抗體，我們把G6PD基因構(gòu)建在pET-28a（已經(jīng)給出載體

20、圖譜）里，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)高效表達(dá)后，怎樣操作能達(dá)到目的？1.將大腸桿菌在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心除去LB培養(yǎng)液，收集菌體沉淀2.用蛋白質(zhì)提取緩沖液懸浮菌體，離心后收集菌體沉淀，再用蛋白質(zhì)提取緩沖液洗滌菌體一次，用少量的提取緩沖液懸浮菌體，冰浴條件下超聲破碎菌體，離心后上清液即為G6PD蛋白粗提取液3.將G6PD蛋白粗提取液裝入透析袋中濃縮，透析除去小分子雜質(zhì)4. 用鎳親和層析柱親和純化帶有His-Tag的G6PD蛋白，可獲得帶有His-Tag的G6PD蛋白5.加入凝血酶后，用鎳親和層析柱親和純化帶有His-Tag的G6PD蛋白，可獲得純的G6PD蛋白6.使用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分子量4. 為了得到較純的水稻條紋病毒NSvc2蛋白（約94KD）蛋白，用于制作單克隆抗體，我們把G6PD基因構(gòu)建在pGAPZaA載體（已經(jīng)給出載體圖譜）里，在釀酒酵母菌中誘導(dǎo)表達(dá)高效表達(dá)后，怎樣操作能達(dá)到目的？1.將釀酒酵母菌在液體YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心除去YPD培養(yǎng)液，收集菌體沉淀2.用蛋白質(zhì)提取緩沖液懸浮菌體，離心后收集菌體沉淀，再用蛋白質(zhì)提取緩沖液洗滌菌體一次，用少量的提取緩沖液懸浮菌體，用有機(jī)溶劑破碎菌體，離心后上清液即為NSvc2蛋白粗提取液3.將NSvc2蛋白粗提取液裝入透析袋中濃縮，透析除去小分子雜質(zhì)4. 用鎳親和層析柱親和純化帶有His-Tag的NSvc2蛋白，可獲得帶有His