CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞知識講解

1、Ca Cl 2 法制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的CaCl2 法制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗原理處于對數(shù)生長期的細(xì)菌經(jīng)CaCl2 處理后接受外源 DNA 的能力顯著增加。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA 的狀態(tài)叫感受態(tài)。在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob 基因，因此不能自行完成從一個細(xì)胞到另一個細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)，以攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化（ Transformation ）是將外源 DNA 分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基

2、因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體（R-,M-），它可以容忍外源DNA 分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源 DNA 分子進入的感受態(tài)細(xì)胞（Compenent cells ）。進入受體細(xì)胞的 DNA 分子通過復(fù)制、表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（ Transformant ，即帶有異源 DNA 分子

3、的受體細(xì)胞）。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl)法， RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但 CaCl2 法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15% 的無菌甘油于 -70 保存（半年），因此CaCl2 法使用更廣泛。主要試劑(1)0.1mol/L CaCl2 溶液(2)LB 液體培養(yǎng)基(3)30% 甘油： 30mL 甘油溶于 100mL 蒸餾水，高壓滅菌。主要設(shè)備(1) 超凈工作臺(2) 冷凍離心機(3) 恒溫?fù)u床(4) 70冰箱(5)10mL 移液管(6) 吸耳球(7)1mL 、 200

4、 L移液槍（配套槍頭）(8)50mL 離心管(9)1.5mL 離心管實驗材料(1) 大腸桿菌 DH5（R-， M-， Amp- ）實驗步驟（一）受體菌的培養(yǎng)(1) 從 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5 單菌落，接種于 35mL LB 液體培養(yǎng)基中， 37下振蕩培養(yǎng)過夜（ 12h 左右）。(2) 將該菌種懸液以 1:100 的比例接種，取 250 L菌液轉(zhuǎn)接到 25mL LB 液體培養(yǎng)基中， 37振蕩培養(yǎng) 23h 至 OD600 0.5 左右。（二）感受態(tài)細(xì)胞的制備（注意：以下操作在超凈工作臺完成。）(1) 將菌液轉(zhuǎn)入 50mL 離心管中，冰上放置 10min 。(2) 在 4

5、下， 4000r/min 離心 10min 。棄去上清，將管倒置 1min 以便培養(yǎng)液流盡。(3) 用冰上預(yù)冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30min 。(4)0 4 4000r/min 離心 10min ，棄去上清，加入2mL 預(yù)冷的 0.1mol/L 的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置（務(wù)必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鮮感受態(tài)細(xì)胞的制備）（三）感受態(tài)細(xì)胞的分裝與凍存(1) 在 2mL 制備好的感受態(tài)細(xì)胞中加入2mL30% 甘油（即 1:1 體積，甘油終濃度 15% ）。(2) 將此感受態(tài)細(xì)胞分裝成每份 200 L (1.5mL

6、dorf管) ，液氮速凍，快速轉(zhuǎn)入 -70冰箱保存。（如果沒有液氮，可以將分裝的感受態(tài)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)入 -70 冰箱保存。）注意事項 、細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度最好從 -70 或 -20 甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已 經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4 的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107 個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600 控制。對 TG1 菌株， OD600 為 0 5 時，細(xì)胞密度在 5×107 個/ml 左右。（應(yīng)注意 OD600 值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。 此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制 -修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。、試劑的質(zhì)量所用的 CaCl2 等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于 4。、防止雜菌和雜DNA的污染整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最