Folin-酚試劑法測蛋白質(zhì)含量

1、實(shí)驗(yàn)1-3蛋白質(zhì)的定量測定（Folin-酚試劑法）一、實(shí)驗(yàn)原理1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)Folin-酚試劑法，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還 原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)；1951年，Lowry對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加 堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。Foli n-酚試劑法主要包括兩步：第一步雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液中，雙縮脲（H2NOC NH CONH2）能與Cu2+作用，形成紫色或紫紅色的絡(luò) 合物，這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個(gè)肽鍵,因此有雙縮脲反應(yīng)。即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅

2、色的蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物。第二步Folin-酚顯色反應(yīng)Foli n-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán) 色反應(yīng)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸（Tyr ），故有此顯色反 應(yīng)。即蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo) 準(zhǔn)液比色即可求出樣品中蛋白質(zhì)的含量。另外，可以根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品 中蛋白質(zhì)的含量。二、實(shí)驗(yàn)材料（一）樣品健康人血清（稀釋300倍）（二）試劑1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200

3、g/ml）準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白粉末50.0mg,用0.1mol/L NaOH溶液潤濕溶解，加蒸餾水到250ml。2 堿性硫酸銅溶液 堿溶液：Na2CO3 2g 溶于 100ml 0.1mol/L NaOH 中。 硫酸銅溶液：CuSO4?5HO 0.5g溶于100ml 35mmol/L（1%）酒石酸鉀鈉中。使用前將與按50:1混合即成堿性硫酸銅溶液。使用時(shí)新鮮配制。3. Folin-酚試劑在2L磨口回流裝置內(nèi)加鎢酸鈉（N&WO4望H2O） 100g,鉬酸鈉（Na2MoO4辺H2O） 25g,蒸餾水700ml, 14.68mol/L （85%）磷酸50ml，濃鹽酸100ml，充分混合后用小

4、火回流10h。冷卻后，再加硫酸鋰（Li 2SO4?H2O） 150g,水50ml，數(shù)滴（23滴）液體溴（也可用30%出。2 68滴代替），然后開口沸騰15mi n,驅(qū)除過量的溴（因溴氣甚毒，這一步應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行）， 冷卻后加水至1000ml，過濾，溶液呈黃色（如帶綠色則不能用），保存于棕色瓶中置冷暗處 備用（如配制時(shí)間較長，試劑轉(zhuǎn)呈綠色），可再加液體溴數(shù)滴，煮沸15min，若能恢復(fù)原有的 黃色或金黃色仍可繼續(xù)使用）。（三）儀器及器材1. V-1100分光光度計(jì)2 恒溫水浴箱3 .試管6支、試管架4. 加樣槍、加樣槍架5. 坐標(biāo)紙三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）操作步驟1.反應(yīng)取6支試管編號(hào)，按下表加入試劑

5、，混勻。體系設(shè)空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管試劑（ml）置1 23456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液一0.20.40.60.8樣品液一一0.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.52 .雙縮 向各管內(nèi)分別加入堿性硫酸銅溶液 2ml，混勻，室溫放置10min 脲反應(yīng)a. 當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng) 發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞 之前。b. 每管重復(fù)測三次A500值，求平 均值用于繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。3. Folin-再加入Folin-酚試劑0.20ml, 2s內(nèi)迅速混 酚反應(yīng) 勻a! 40°C水浴10min后，冷卻至室溫。4 .比色 以500n

6、m波長比色，用1號(hào)管作空白， 測定讀取各管吸光度值A(chǔ)500b。（二）注意事項(xiàng)1 干擾物質(zhì)此法是在 Foli n-酚法的基礎(chǔ)上引入雙縮脲試劑，因此凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，如 -CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，如 Tris緩沖劑以及蔗糖， 硫酸銨，巰基化合物均可干擾 Foli n-酚反應(yīng)。此外，所測的蛋白質(zhì)樣品中，若含有酚類及檸 檬酸，均對(duì)此反應(yīng)有干擾作用。而濃度較低的尿素（約0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%）,乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）對(duì)顯色 無影響，這些物質(zhì)在所測樣品中含量較

7、高時(shí)，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨， 則需增加碳酸鈉一氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉一氫氧化鈉濃度12倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。2 控制時(shí)間因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。即第1支試管加入2.0ml堿性硫酸銅試劑后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入2.0ml堿性硫酸銅試劑， 2分鐘后加第3支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20ml Folin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20ml Folin-酚試劑，2分 鐘后加第3支試管，以此類推。40°C水

8、浴10min，冷卻后，每一分鐘測定一管吸光值。四、結(jié)果與討論（一）結(jié)果1 數(shù)據(jù)記錄按照下表記錄各管在500nm波長測得的吸光度值。測定次數(shù)各管吸光度值A(chǔ)50023456123各管平均值A(chǔ) 5002 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（1）選擇合適的坐標(biāo)紙（2）畫坐標(biāo)軸：以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)。（3）根據(jù)測得的數(shù)據(jù)描點(diǎn)（4）連線：根據(jù)所描點(diǎn)的分布情況，作過原點(diǎn)的直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn) 點(diǎn)的平均變動(dòng)情況，因此該線不需全部通過各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布 在曲線或直線兩側(cè)。（5）求實(shí)驗(yàn)結(jié)果3 結(jié)果計(jì)算根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量 然后乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)（g/ml）。血清蛋白濃度 eg/ml）=:樣品蛋白質(zhì)濃度&X300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為 6