葫蘆科植物未授粉子房培育單倍體探究進(jìn)展

1、葫蘆科植物未授粉子房培育單倍體探究進(jìn)摘要：綜述了近年來(lái)葫蘆科植物未授粉子房培養(yǎng)單倍 體狀況，及葫蘆科植物未授粉子房培養(yǎng)的取材、基因型、溫 度、激素等幾個(gè)因素影響的研究進(jìn)展，進(jìn)而對(duì)其當(dāng)前問(wèn)題及 前景進(jìn)行了探討。關(guān)鍵詞：葫蘆科；未授粉子房；單倍體染色體加倍能快速純化單倍體植株育種材料，縮短育種 年限，且使單倍體材料能在當(dāng)代即表現(xiàn)出顯隱性基因型性 狀，在育種方面發(fā)揮著重要作用，在遺傳學(xué)研究及基因圖譜 構(gòu)建等方面也具有重要的意義。葫蘆科(cucurbitaceae) 植物分布在中國(guó)的有130多個(gè)種，其中甜瓜、黃瓜、南瓜、 葫蘆、西瓜等都具有很髙的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其品種改良具有極大 潛力。在自然界中葫蘆科植物

2、自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低1 ,而長(zhǎng)期的研究結(jié)果表明，通過(guò)花藥和小胞子培養(yǎng)在葫 蘆科植物中得到單倍體的幾率很小，但通過(guò)葫蘆科植物雌核 發(fā)育(gynogenesis)途徑進(jìn)行單倍體研究是一條重要途徑。 雌核發(fā)育是指離體條件下由未授粉胚囊產(chǎn)生單倍體胚和植 株的過(guò)程2。雌核發(fā)育培育單倍體主要有2種方式：一種 是讓精子入卵后，保證精核不與卵核融合而退化，刺激卵核 分裂發(fā)育為胚，這種方式主要通過(guò)輻射處理花粉授粉后將雌 核離體培養(yǎng)；另一種是對(duì)未授粉子房或胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)， 誘導(dǎo)雌核發(fā)育。本文著重對(duì)未授粉子房培養(yǎng)研究狀況及影響 因素作出簡(jiǎn)要概述。1葫蘆科植物雌花未授粉胚珠離體培養(yǎng)單倍體研究概未授粉胚珠離體培養(yǎng)

3、是一種簡(jiǎn)單有效的加速植物快速 純化的方法，而且為研究孤雌生殖或無(wú)配子生殖的細(xì)胞胚胎 學(xué)提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系。1985年，chamboner等3首次在西葫蘆中采用未授粉 胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體和二倍體的植株ometwally等 4, 5對(duì)西葫蘆品種eskandarani 花前1 d的雌花，通過(guò) 低溫誘導(dǎo)和含不同濃度2, 4-d的ms培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，成功 獲得了西葫蘆單倍體植株。隨后國(guó)內(nèi)學(xué)者陳學(xué)軍等6、謝 冰等7分別在西葫蘆中得到胚囊植株并馴化成功。劉栓桃 等8利用9個(gè)不同基因型的西葫蘆材料，研究了激素、取 樣時(shí)間和基因型3個(gè)因素對(duì)西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)的影 響。南瓜子房未授粉子房培養(yǎng)試驗(yàn)19

4、88年獲得初始成功9。 shalaby 10在 metwally 等4的基礎(chǔ)上采用 1 mg/l 2, 4_d 和kinetin培養(yǎng)基對(duì)基因型、雌花位置、溫度和蔗糖濃度4 個(gè)因素進(jìn)行研究并獲得了南瓜單倍體植株。黃瓜的未授粉子房離體培養(yǎng)研究始于1996年，但起始效果不佳lljogemes等12將黃瓜子房放置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上，在不同溫度下熱激并暗處理25 d,隨后轉(zhuǎn)移到再生培 養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，熱激處理通過(guò)優(yōu)化雌配偶體發(fā)育 提高雌核再生頻率。并通過(guò)組織觀察發(fā)現(xiàn)雌性配子體的單倍 體誘導(dǎo)的最佳時(shí)期為胚囊形成階段。國(guó)內(nèi)隨后也對(duì)黃瓜基因 型、取樣時(shí)期、激素及處理溫度對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)進(jìn)行了探討 1316

5、,并獲得了純合的黃瓜材料。ficcadenti等17首次在甜瓜中采用未授粉胚珠離體 培養(yǎng)技術(shù)，其選擇了 2個(gè)常規(guī)材料和1個(gè)f1代雜交種進(jìn)行 培養(yǎng)并獲得再生胚。隨后lotfi等18也對(duì)甜瓜進(jìn)行了未授 粉胚珠離體培養(yǎng)。malik等19對(duì)不同溫度和幾種不同激素 對(duì)甜瓜未授粉子房培養(yǎng)效果進(jìn)行研究，采用ssr分析證實(shí)獲 得的雙單倍體植株為純合雙單倍體，并通過(guò)ssr標(biāo)記證實(shí)這 些獲得的雙單倍體為純合的雌配子的再生胚。以上這些研究結(jié)果表明，未授粉子房培養(yǎng)技術(shù)在葫蘆科 植物育種及科學(xué)研究中的重要地位受到越來(lái)越多研究者的 重視。而其復(fù)雜的影響因素對(duì)建立高效穩(wěn)定的技術(shù)體系有著 嚴(yán)重阻礙，因此探討其最佳的培養(yǎng)條件對(duì)

6、該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用有 著重要意義。以下對(duì)其影響因素相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行概述。2未授粉葫蘆科植物胚胎發(fā)生影響因素2. 1取材狀況許多研究結(jié)果表明，試驗(yàn)材料的播種時(shí)期、雌花的發(fā)育 時(shí)期及雌花的部位等對(duì)胚胎離體培養(yǎng)中的胚誘導(dǎo)頻率都有 著重要的影響。陳學(xué)軍等6通過(guò)對(duì)西葫蘆開花前3d,當(dāng)日 和開花后2d未授粉子房分別進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)率分 別為10.5%, 14.2%和4. 4%,表明開花當(dāng)日子房離體培養(yǎng)效 率最高。謝冰等7通過(guò)西葫蘆不同開花時(shí)期取材試驗(yàn)證實(shí) 開花前1 d和開花當(dāng)日胚珠誘導(dǎo)頻率最高，秋播材料誘導(dǎo)頻 率較夏播和春播的高。shalabyelo對(duì)2個(gè)南瓜giad和raad 的f1代的第一節(jié)雌花、第

7、二節(jié)雌花和第三節(jié)雌花分別進(jìn)行 未授粉胚珠離體培養(yǎng)研究后發(fā)現(xiàn)，第二節(jié)雌花胚誘導(dǎo)和成苗 效果最佳。劉栓桃等8對(duì)9種基因型西葫蘆材料進(jìn)行不同 開花時(shí)期取材試驗(yàn)，結(jié)果顯示，除1個(gè)材料沒能得到再生植 株外，其他均表現(xiàn)為開花當(dāng)天的胚珠最適合誘導(dǎo)培養(yǎng)，再生 植株產(chǎn)率表現(xiàn)最高。2.2基因型ficcadenti 等17對(duì) 2 個(gè)甜瓜品種(reticulatus, inodorus)及其雜交種進(jìn)行了未授粉雌花子房培養(yǎng)，結(jié)果顯 示，reticulatus出胚率最高。shalaby10對(duì)12種不同基 因型南瓜品種的未授粉雌花子房培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，raad fl代材料 表現(xiàn)最佳，胚誘導(dǎo)率為48. 4%,每皿成苗15株。劉栓桃等

8、8 對(duì)9個(gè)不同基因型西葫蘆材料的未授粉胚珠誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)， 再生植株產(chǎn)率最高的能達(dá)到33. 33%,而最低的僅為2. 67%o 陳小鵬等14對(duì)3個(gè)黃瓜品種未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)試驗(yàn) 結(jié)果表明，黃瓜基因型對(duì)雌核發(fā)育也有著重要影響。以上這 些結(jié)果表明，基因型在甜瓜、南瓜、西葫蘆等葫蘆科植物的 雌核發(fā)育中有著重要作用。2.3溫度預(yù)處理溫度處理極有可能促進(jìn)雌核發(fā)育由正常配子發(fā)育 (gametophytic development ) 轉(zhuǎn)換成腐生途徑 (saprophytic pathway),從而導(dǎo)致單倍體胚形成10。kwack等9研究表明，南瓜在51條件下預(yù)處理2 d能提高 胚胎的發(fā)生幾率o g e

9、mes等12將黃瓜子房放置于誘導(dǎo)培養(yǎng) 基(induetion media containing thidiazuron)上，分別 在24, 28, 35£環(huán)境下暗處理25 d；隨后轉(zhuǎn)移到再生培 養(yǎng)基 (rege nera tio n media a -naphthaleneace ti c acid a nd 6-benzylaminopurine),結(jié)果表明，熱激處理通過(guò)優(yōu)化雌配 偶體發(fā)育提高雌核再生頻率。其中35*胚胎再生效果最好，其胚胎發(fā)生頻率為18.4%,植株再生頻率為7. 1%o shalaby 10將南瓜queen fl代分別放置在4°c和32°c下

10、預(yù)處理0, 4, 7, 12 d,結(jié)果顯示，4°c或32°c條件下都是4 d的處理效果最佳。diao等16對(duì)黃瓜的研究結(jié)果也 表明，在35"條件下熱激3 d的效果較2 d和4 d的好。此外在對(duì)葫蘆科植物子房進(jìn)行溫度刺激預(yù)處理的試驗(yàn) 中，也有些結(jié)果表明，熱激或冷激處理對(duì)雌核誘導(dǎo)成單倍體 有副作用。yang等20的研究結(jié)果表明，許多物種中冷激 處理對(duì)雌核培養(yǎng)具有副作用。metwally等4通過(guò)將開花前 1 d的西葫蘆(eskandarani)在4°c分別進(jìn)行2, 4, 8 d預(yù) 處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不進(jìn)行預(yù)處理的的材料具有最高的胚誘導(dǎo)率。2.4激素處理kwack等

11、9研究認(rèn)為，植物激素對(duì)南瓜的胚發(fā)生有著 重要作用。metwally等4在誘導(dǎo)西葫蘆未授粉胚胎分化時(shí) 分別使用濃度為0.1, 1, 5, 10 mg/l的2, 4-d,結(jié)果發(fā)現(xiàn) 1 mg/l和5 mg/l 2, 4-d處理的胚誘導(dǎo)率較高。malik等19在進(jìn)行甜瓜未授粉子房培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.04 mg/l和0.02 mg/l的tdz在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中顯著增加胚珠愈傷產(chǎn)生，胚誘導(dǎo) 率分別為46. 6%和65. 83%,而濃度為0. 6 mg/l的6-ba激素 顯著提高外植體再生率。diao等16認(rèn)為，tdz能促進(jìn)胚胎形成，以0. 04 mg/l的tdz效果最佳。而將agn03加到誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中對(duì)胚的誘導(dǎo)

12、并沒有顯著影響，但會(huì)縮短胚胎萌芽期和提 高胚胎形成數(shù)目，其選用的材料之間出胚率并無(wú)顯著差異。 謝冰等7將西葫蘆未授粉胚珠接種至含不同濃度2, 4-d, naa, ba 的 n6 培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 mg/l 2, 4-d+0. 5 mg/l naa+1 mg/l ba培養(yǎng)基上的胚狀體誘導(dǎo)頻率最高。劉栓桃等8通過(guò)對(duì)4個(gè)西葫蘆品種研究結(jié)果表明，在濃度為0. 5 mg/l naa和1. 0 mg/l的2, 4-d的培養(yǎng)基上再生植株產(chǎn)率最高，達(dá) 28. 33%o2.5瓊脂和蔗糖濃度陳學(xué)軍等6發(fā)現(xiàn)，西葫蘆胚珠愈傷組織誘導(dǎo)成苗階段, 蔗糖濃度為20 g/l的培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率最高，為15. 6%o sh

13、alaby 10在南瓜eskandrani胚珠誘導(dǎo)時(shí)使用30, 60, 90 g/l的蔗糖濃度梯度比較發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度為30 g/l時(shí)，胚珠 誘導(dǎo)效率最佳，而蔗糖濃度為90 g/l時(shí)，胚珠完全不能生 長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，在愈傷組織芽分化時(shí)可能需要較低的滲 透壓。此外，agn03是乙烯合成的抑制劑，mohiuddin等21 認(rèn)為，agn03影響愈傷組織的內(nèi)源激素代謝從而有利于葫蘆 科植物植株的再生。陳學(xué)軍等6研究發(fā)現(xiàn)n03-有利于不定 根的形成。韓麗華等22將甜瓜胚珠用不同濃度的硝酸銀進(jìn) 行處理，結(jié)果顯示在硝酸銀濃度為80 mg/l時(shí)出胚率最高， 為 0. 74%o3未授粉子房培養(yǎng)展望葫蘆科植物具有

14、很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，通過(guò)單倍體離體誘導(dǎo) 技術(shù)對(duì)葫蘆科植物的品質(zhì)、抗逆性、抗病害能力等進(jìn)行改良, 將會(huì)在葫蘆科植物的遺傳育種中開拓一條嶄新的途徑。自從 20世紀(jì)60年代利用未授粉子房培養(yǎng)單倍體獲得成功以來(lái) 23,自然界植物的單倍體育種技術(shù)也取得長(zhǎng)足的進(jìn)步。通 過(guò)未授粉子房培養(yǎng)單倍體的技術(shù)快速純化葫蘆科植物基因 型，加快育種進(jìn)度在葫蘆科植物育種中具有重要意義。當(dāng)前 通過(guò)未授粉子房培養(yǎng)單倍體的方式在育種中已經(jīng)取得了一 些進(jìn)步，但是當(dāng)前葫蘆科植物未授粉胚珠離體培養(yǎng)的過(guò)程中 仍存在許多復(fù)雜的影響因素導(dǎo)致其誘導(dǎo)率、成胚率、成苗率 較低等。因此通過(guò)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)提高誘導(dǎo)效率，建立穩(wěn)定 性好，重復(fù)性高的未授粉子房

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