真核生物三種rna聚合酶的特點

1、1 簡述其核生物三種rna聚合酶的特點?細胞內(nèi)定 位轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對活性對鵝膏草堿的敏感程度rna聚合酶i核仁rrna50%70%不敏感rna聚合酶ii核質(zhì)hnrna20%-40%敏感rna聚合酶iii核質(zhì)trna約10%存在物種 特異性下邊是詳細的rna聚合酶i的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是45srrna,經(jīng)剪接修飾后生成除5srrna 外的各種rrnao rrna與蛋白質(zhì)組成的核耕體是蛋h質(zhì)合成的場所。 rna聚合酶ii在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄牛成hnrna,經(jīng)剪接加工后定成的mrxa被 運送到胞質(zhì)中作為蛋白質(zhì)合成的模板。rna聚合酶iii的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是trna, 5srrna, snrna,其中snrna參與 rna的剪接。

2、2. 簡述乳糖操縱子的調(diào)控原理？答：答：（1）乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含z、y、 a三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖芹酶、透酶和半乳糖芹乙酰轉(zhuǎn)移 酶，此外還有一個操縱序列0,個啟動子p和一個調(diào)節(jié)基因i.（2）阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時，i基i大i編碼的阻遏 蛋白結(jié)合于操縱序列0處，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分 解乳糖的三種酶；有乳糖存在時，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變 構(gòu)，不能結(jié)合丁操縱序列，乳糖操縱子被誘導(dǎo)開放合成分解乳糖的 三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機制為可誘導(dǎo)的負調(diào)控。（3）cap的正調(diào)節(jié)：在啟動子上游有cap結(jié)合位點，當(dāng)大腸桿菌 從以葡糖糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變

3、為以乳糖為碳源的環(huán)境時，camp濃 度升高，與cap結(jié)合，使cap發(fā)主變構(gòu)，cap結(jié)合丁乳糖操縱子啟 動序列附近的cap結(jié)合位點，激活rna聚合酶活性，促進結(jié)構(gòu)基因 轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對乳糖操縱 子實行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。（4）協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的【基因編碼的阻遏蛋白的負調(diào)控 與cap的正調(diào)控兩種機制,互相協(xié)調(diào)、互相制約。3. 簡述dna聚合酶和dna連接酶在dna復(fù)制中的作用？答：dna聚合酶（dna polymerase）是細胞復(fù)制dna的重要作用酶。dna聚合酶，以dna為復(fù)制模板，從將dna由5'端點開始復(fù)制 到3'端的酶

4、。dna聚合酶的寶要活性是催化dna的合成（在具備模板、引物、 dntp等的情況下）及其相輔的活性。其核細胞有5種dna聚合酶，分別為dna聚合酶a （定位丁胞 核，參與復(fù)制引發(fā)具5-3外切酶活性），0 （定位于核內(nèi)，參與 修復(fù)，具5-3外切酶活性），y （定位丁-線粒休，參與線粒體復(fù) 制具53和35外切活性），6 （定位核，參與復(fù)制，具有3 5和5-3外切活性），£ （定位于核，參與損傷修復(fù)，具有3-5 和5-3外切活性）。原核細胞有3種dna聚合酶，都與dna鏈的延長有關(guān)。dna聚合 酶i是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈dna的延長；dna聚介酶ii 則與低分子脫氧核昔酸鏈的延長冇關(guān)

5、；dna聚介酶111在細胞中存 在的數(shù)目不多，是促進dna鏈延長的主要酶。dna連接酶是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的，最初是在大腸 桿菌細胞中發(fā)現(xiàn)的"它是一種封閉dna鏈上缺口酶，借助atp或 nad水解提供的能量催化dna鏈的5' -p04與另一 dna鏈的3* -011 生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的 （t4dna連接酶除外），而且必須是兩條緊鄰dna鏈才能被dna連接 酶催化成磷酸二酯鍵"dna連接酶在大腸桿菌細胞中約有300個分 子，和d¥a聚合酶【的分子數(shù)相近，這也是比較合理的現(xiàn)象。因為 da連接酶的主要功能就是在d

6、ma聚合酶i催化聚合，填滿雙鏈dna 上的單鏈間隙后封閉dna雙鏈上的缺口。這在dna復(fù)制、修復(fù)和重 組中起若重要的作丿ij,連接酶有缺陷的突變株不能進行dna復(fù)制、 修復(fù)和重組。4. 簡述真核生物基因時空表達的&義？答：所仃牛物的基因表達都具仃嚴格的規(guī)律性，即表現(xiàn)為時間特異 性和空間特異性?；虮磉_的時間特界性是指某一特定基因的表達按一定的時間順 序發(fā)生。如編碼屮胎蛋白的基因在胎兒肝細胞中活躍表達，因此介 成人量的屮胎蛋白。在成年后該基因的表達水平很低，兒乎檢測不 到atp。但是，當(dāng)肝細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化形成肝癌細胞時，編碼atp的基 因又重新被激活，大量的ai屮被合成?？臻g特界性是指多細胞

7、生物個體在某一特定生長發(fā)育階段，同一基 因在不同的組織器官表達不同。在多細胞生物個體某一發(fā)育、生長 階段，同一基因產(chǎn)物在不同的組織器官表達水平是不樣的。在個 體生長、發(fā)育過程中，一種基因產(chǎn)物在個體的不同組織或器官表達, 即在個體的不同空間出現(xiàn)，這就是基因表達的空間特異性。5. 已知一個編碼蛋白質(zhì)的cdna序列，如何才能得到相應(yīng)的蛋白 質(zhì)？1、從基因文庫或cdna文庫中分離h的棊因或通過per擴增得到忖 的基因;2、體外構(gòu)建重組dna分子，選擇合適的克隆載體如pbv220, 用限制型內(nèi)切陋分別加丁外源基因與載體dna,再用t4dna連接酗 連接外源基因與載體dna,構(gòu)建出重組質(zhì)粒dna分子;3、

8、重組質(zhì) 粒dma導(dǎo)入宿主細胞：制備感受態(tài)大腸桿菌宿主細胞dh5 a ,將重 組題分子導(dǎo)入宿主細胞，涂布在含有amp的lb固體平板上，37°c 培養(yǎng)；4、挑選單菌落，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，如 果陋切產(chǎn)物的人小為2. 7kb左右，則通過測序確認序列的正確性；5、表達：將所得陽性克隆在30°c培養(yǎng)適當(dāng)時間，使得菌密度較高 以后，升溫42°c誘導(dǎo)基因的表達，2、3小時以后，離心收集菌體， 用sds-page檢測忖的基因的表達；6、純化：破細胞后用適當(dāng)?shù)姆?法純化出目的蛋白。6. 結(jié)合你的課題，舉例說明你的碩士階段可能會用到的3種分了 生物學(xué)技術(shù)（如果研究領(lǐng)域不

9、涉及分子生物學(xué)技術(shù)，可簡單談 談自己研究領(lǐng)域的前景）答：（1） western blot,所謂免疫印跡是一種將凝膠電泳與固相 免疫結(jié)合起來的分了生物學(xué)技術(shù)。就是把正常的細胞打碎，分離出 各種蛋h質(zhì)抗原，經(jīng)特殊的電泳(sds-page)方法分離并轉(zhuǎn)移到一張 硝酸纖維薄膜(nc)或pvdf牘上固定。由于各種抗原分子量大小不 同，所以在電場中泳動的速度不同，在硝酸纖維薄膜上所占據(jù)的位 置也不同，各種抗原冇它相應(yīng)固定的位置。然后把標(biāo)記的特異性抗 體與薄膜上的抗原結(jié)介，通過標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)就能顯示出可見 的結(jié)果。(2) el1sa的基礎(chǔ)是抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面 的抗原或抗體仍然保持其免

10、疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留 其免疫學(xué)活性,乂保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本與固相載體 農(nóng)面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使i古i相載體上形成的抗原 抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗 體，加入沒反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量 與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的暈直接相關(guān)，故可根據(jù)成色的深淺進行定性或 定量分析。由丁酶的催化效率很高，間接地放人了免疫反應(yīng)的結(jié)果, 使測定方法達到很高的敏感度。(3) pcr：pcr 技術(shù)又稱聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction) 技術(shù)，是一種在體外(試管、切片)擴増核酸的技術(shù)。該技術(shù)模 擬體內(nèi)夭然dn

11、a的復(fù)制過程。其基本原理是在模板、引物、4種dntp 和賴熱dna聚合酶存在的條件下，特杲擴增位于兩段已知序列z間 的dna區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。每-循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、 中溫延仲三步反應(yīng)。毎一循壞的產(chǎn)物作為下一個循壞的模板，如此 循環(huán)30次，介于兩個引物z間的新生dna片段理論上達到230拷 貝(約為109個分子)。pcr技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合 的特異性。rnai與mirna介導(dǎo)的調(diào)控非編碼 rna： rrna, trna, snrna, snorna, rnai, sirna, mirna核仁小分子rna (snorna)是一類廣泛分布于真核生物細胞核仁的 小分子非編碼rn

12、a,具有保守的結(jié)構(gòu)元件.分為3人類：boxc / d snorna、boxh / aca snorna、mrp ra。研究發(fā)現(xiàn)，snorna 除了 在核糖體rna的生物合成中發(fā)揮作用z外，還能夠指導(dǎo)snrna.trna 和mrna的轉(zhuǎn)錄后修飾。此外，述有相當(dāng)數(shù)量的snorna功能不明， 被稱為snorna (orphansnorna)。在哺乳動物的snorna屮，印跡 snorna ( imprintedsnorna)是最為特殊的一群，由基因組印跡iw 編碼，具有明顯的組織農(nóng)達特異性。原核生物古細菌中類snorna 的鑒定表明這些非編碼rna家族成員的古老起源；而哺乳動物屮大 量的snorna

13、反轉(zhuǎn)座了的存在更為人們探索snorna在基因組中擴増 和功能進化提供了新的思路。小核rna(small nuclearrna, snrna)。它是真核牛物轉(zhuǎn)錄后加匚 過程中rna剪接體(spilccosome)的主要成分，參與mrna前體的 加工過程?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有五種snrna,其長度在哺乳動物中約為 100-215個核昔酸。snrna 直存在于細胞核中，與40種左右的核 內(nèi)蛋白質(zhì)共同組成rna剪接體，在rna轉(zhuǎn)錄后加工小起重要作用。 另外,還有端粒酶rna(telomeraserna),它與染色體末端的復(fù)制 有關(guān)；以及反義rna(antiscnserna),它參與基因農(nóng)達的調(diào)控。rna干涉(r

14、nai)：rnai是指通過反義rna與正鏈rna形成 歡鏈rna特杲性地抑制靶基因的現(xiàn)象，它通過人為地引入與 內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈rna(有義rna和反義rna), 從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mrna降解，達到阻止棊因表達的h 的。rnai是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈rna (dsrna) 在細胞內(nèi)特異性的將與之同源的mrna降解成21nt23nl的 小片段，使相應(yīng)的基因沉默。rnai是將與靶基因的mrna同 源互補的雙鏈rna (dsrna )導(dǎo)入細胞，能特異性地降解該 mrna，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基 因沉默(post - transcriptional gen

15、e silence , ptgs)。小的干涉rna (sirna)是在rxa干涉過程中人工體外合成的小片 段rma,由約20個堿基對組成，包括5個磷酸鹽，2個核苛和3個 懸臂。sirna在rna沉默通道中起中心作用，是對特定信使rna (mrna)進行降解的指導(dǎo)要素。小的干涉rna (sirna)是在rna干涉過程中人工體外介成的小片 段rna,由約20個堿基對組成,包插5個磷酸鹽,2個核昔和3個 懸臂。sirna在rna沉默通道中起中心作用，是對特定佶使rna (mrna)進行降解的指導(dǎo)要素。mirnas是一種21 25nt長的單鏈小分子rna,其結(jié)構(gòu)特征如下： 廣泛存在于真核生物中，是一組

16、不編碼蛋白質(zhì)的短序列rna,它木 身不具冇開放閱讀框(0rf)；成熟的mirna, 5端冇一個磷酸基 團，3端為疑基，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約7090個堿慕大小的單 鏈rna前休經(jīng)過dicer酶加工后生成，不同于sirna (雙鏈)但是 和sirna密切相關(guān)。成熟的mirna 5,端的磷酸基團和3'端起基則 是它與相同長度的功能rna降解片段的區(qū)分標(biāo)志。mirna獨冇的特 征是其5,端第一個堿基對u冇強烈的傾向性，而對g卻冇抗性， 但第二到第四個堿棊缺乏u, 般來講，除第四個堿基外，其他位 置堿基通常都缺乏c。mirnas具有高度的保守性、時序性和組織特 異性。rnai (rna干涉)技術(shù)

17、及其應(yīng)用rnai技術(shù)利用雙鏈小rna高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mrna 從而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶棊因缺失的農(nóng)型。rnai的命 名來源于安徳魯法爾1998年在口然雜志上的論文。研究發(fā) 現(xiàn)，雙鏈rna是rnai的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補的單鏈rna (ssrna, single- stranded rna)的降解。經(jīng)過 dicer (一種具有 rnaase iii活性的核酸 酶)的加工,細胞中較長的雙鏈rna (30 個核苛酸以上)首先被降解形成2125個核苻酸的小分子干擾核 糖核酸(sirna, short interfering rna )，并有效定位目標(biāo) mrna。 sirna是引發(fā)轉(zhuǎn)錄

18、后基因沉默中序列特并性rna降解的重要中間 媒介,它具有特殊的結(jié)構(gòu)特征,即5'端磷酸基團和3'端的輕基, 其兩條鏈的3'端各冇兩個堿基突出于末端。由sirna中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合 體(risc)的核蛋口體，再由risc介導(dǎo)切割目的mrna分子中 與sirna反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶基因表達的功能。 pcr及分子標(biāo)記 三步：變性，低溫退火，延伸。pcr循環(huán):95度去變性雙鏈dna, 55度去使引物結(jié)合,72度聚 合延伸。mg2,dntps,模板引物，緩沖液，酶，是必須得。歷史60s-70s：棊因的體外分離技術(shù)。khorana (1971

19、)：美國mit教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主“經(jīng) 過dna變性，與合適引物雜交，用dna聚合酶延伸引物，并不 斷重復(fù)該過程便可克隆trna基因”。核酸體外擴增放早設(shè)想遺忘：當(dāng)時很難進行測序和合成寡核苜酸引物;當(dāng)m(1970)smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切臨體外克隆基因成為可能kary muuis(1985)發(fā)明過程mullis在“偶然想出的聚合酶鏈反應(yīng)”一文中寫到：“這種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝dna片段的方法是 在不可想象的悄況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公 路上時想出來的”。發(fā)展過程：開始使用大腸桿菌dna聚合酶klenow片段,該酶不耐熱, 毎次加熱變性dna后都要重新補加。

20、耗時、費力、易岀錯。耐熱 dna聚合嗨的應(yīng)用使得自動化。原理類似于dna的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴增dna模板加熱變性解 鏈，隨z將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的 靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在dna聚合酶作川下 得以延伸。這種熱變性復(fù)性延伸的過程就是一個pcr循環(huán)，pcr 就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。 程序：template(dna or rna),模板 primers,引物 taq enzyme, 10 x pcr buffer, mg"， 5mmovl dntpsprimer design引物的設(shè)計原則(大家寫英文)most imp.(1) le

21、ngth: 2030bp(2) g ic contents: atcg random distributed 隨機分布(3) primcrs : no complementary sequence(4) 3'end of the primer: no modification(5) 5 'end of the primer:product length, can be modified(6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous

22、 complementary base pcr reaction components and their functionstemplate： ssdna, dsdnamrna needed to be rt as cdnasamples： from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens 院，from ancient biological samples or in the lab 實 驗室的生物標(biāo)本.from bacterial colonics 細菌 or phage plaques. 噬菌體dna：

23、very stableprimes引物stow姚化引物在25%乙膳溶液中4°c；凍干引物于 20°c可保存1-2年，液體狀態(tài)于20°c可保存6個月。不用時應(yīng)20°c 保存。buffer: 10-50mmol/ltris-hcl(ph&3-8.8, 20°c)。mg +： for taq polymerase activityconc.:low:low activityhigh: non-specific amplificationdntps：貯備dntp液：1 mol/l naoh調(diào)ph至中性。貯備濃度為5-10mmol/l,終濃度為2

24、0-200umol/l,分裝-20°c保存。 4種dntp濃度應(yīng)相同。taq dna polymerase：from thermophilic bacteria.taq polymerase from thermus aquaticus.other thermostable dna polymerase with greater accuracy used for certain applications.mineral oilselection for dna polymeraseklenow 酶早期采用該悔不耐熱，缺點冇 溫度要求低(37°c),受熱即失活； 產(chǎn)物特異性

25、不高； 積累大量的失活殘酚，使反應(yīng)產(chǎn)物純度人大降低； 擴增的最長序列約400bp (taq酶則能擴增10kb)taq dna聚合酶 分離:1969年，美國黃右國家公園溫泉 分子量:94kda 活性：在兒種水生棲熱菌中活性授高，200 000u/mg 離子需耍：對mg2+.單價離子性質(zhì)和濃度較敏感。最適濃度為 50mmol/lo忠實性:沒冇校正單核昔酸錯配功能-致命弱點。一般出錯率為2x 10-4核昔酸/每輪循環(huán)，利用pcr克隆、測序時尤應(yīng)注意。抑制劑:尿素、乙醇、dmso、dmf、屮酰胺、sds及許多其他化 學(xué)藥劑。內(nèi)源dna:不同來源的嗨可能山于制備過程中殘留的原細菌dna 或pcr產(chǎn)物的污

26、染而含冇不明來源的dnao在使用擴增保守序列 的通用引物時，會在無模板對照管出現(xiàn)擴增帶。保存:在20°c至少6個月。pcr optimization 優(yōu)化變性溫度和時間92-95°c,富含g和c的序列，可適當(dāng)提高，但過高或時間過長都 會導(dǎo)致稍活性損失。退火溫度與時間引物中g(shù)、c含量高、長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高溫度。 溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常3755°c、12分鐘。延伸溫度和時間溫度：72°c,接近taq稱的最適75°c 時間：過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對低濃度的hl的序列，則 可適當(dāng)增加時間。循環(huán)次數(shù)循環(huán)過多，非特界性產(chǎn)物大量

27、增加pcr污染及其對策強人擴增能力+檢測的敏感性極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性污染源的追蹤 點樣器和加樣器;離心機;微解剖刀;濃縮用具、真空瓶;電 泳裝究;紫外燈箱;乙醇或水浴鍋;冰箱門把手、實驗臺血等污染的預(yù)防(1) 隔離不同操作區(qū)(2) 分裝試劑(3) 改進實驗操作(4) 專用加樣器(5) 結(jié)果的巫演pcr技術(shù)的應(yīng)用遺傳性疾病地中海貧血的基因診斷血友病苯內(nèi)酮尿癥傳染性疾病法醫(yī)學(xué)個人識別、親子鑒定1985年，英國遺傳學(xué)家jeffreys采用dna指紋圖譜進行個人識別和親子鑒疋。有時犯罪物證量很少，不足以用來進行dna指紋分析，pcr有效 解決這些問題。對于犯罪現(xiàn)場屮遺留的少最生物物證，如一根毛發(fā)

28、、 一滴血等都町用于分析，在法醫(yī)學(xué)上認證罪犯、親子鑒定以及人的 性別鑒定中pcr技術(shù)被普遍采用。植物遺傳育種構(gòu)建遺傳圖譜、分離目的基因、基因定位分子標(biāo)記輔助冇種 了解不同品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)進化畜牧畜禽病診斷:豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛白血病 毒、牛病毒、性腹瀉病毒、免疫缺陷病毒等檢測性別鑒定：丫、綿羊y染色體上特異dna片段構(gòu)建基因圖譜檢測基因整介與表達：轉(zhuǎn)基因血植物保護殺蟲病原微牛物的基兇型鑒定植物病原微生物分類:形態(tài)學(xué)上相似性利潛在的血清學(xué)交互反應(yīng)， 用常'規(guī)方法難以區(qū)分，采用反轉(zhuǎn)錄pcr (rt-pcr)可準(zhǔn)確快速區(qū) 分其他 考古學(xué) 植物分類學(xué) 群體生態(tài)學(xué)mol

29、ecular markerintroduction形態(tài)標(biāo)記、細胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記數(shù)十種技術(shù)問吐。萬變不離其宗：分子雜交、pcr擴增第一類：電泳、分子雜交為核心代農(nóng)：rflp、dna指紋第二類：電泳、pcr為核心代表:rapd、ssr、aflp第三類：dna序列為核心代表：its測序分析優(yōu)點：數(shù)量豐富、信息量大；與牛長發(fā)育無關(guān)，取材不受限制；較多共顯性，信息量完整在真核生物中，基因組dna多態(tài)性要遠遠多于各種基因的遺傳多 態(tài)性，因為基因組中存在著大量的不編碼的dna序列，它們的變 異不受或較少地受自然選擇的制約應(yīng)用：種質(zhì)資源研究 品質(zhì)純度鑒定(包括dna指紋鑒定)構(gòu)建遺傳連鎖圖- 基因定位(qt

30、l)標(biāo)記輔助選擇比較基因組研究基因克隆(圖位克隆)生物起源、進化、醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)rflp(restriction fragment length polymorphism)by botstein(1980)基本原理：物種的基因紐.dna在限制性內(nèi)切酶作用卜，產(chǎn)生相當(dāng) 多的大小不等的片段，用放射性同位索標(biāo)記的dna作探針，把與 被標(biāo)記dna相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。優(yōu)點:共顯性，非常穩(wěn)定缺點：檢測步驟多，周期長，費時、費錢；用作探針的dna克隆制備、保存不方便；放射性同位素自從人的rflp圖譜構(gòu)建后，又分別構(gòu)建了果:蠅、丫、大豆、小 麥、水稻等多種生物的rflp圖譜。與常規(guī)pcr的

31、不同a. 引物長度短常規(guī)pcr中需要兩個引物，長度2030個核苜酸。rapd只需一 個引物，長度910個核昔酸，而且是隨機引物。b. 退火溫度低rapd引物短，因此退火溫度要低，一般為35-37c。通用性實驗步驟少，省工、省力、進度快不需先知道基因組的任何分子信息所用材料不需有性世代，可用任何單一親本、任何部位的材料， 在沒冇冇性jit代的線粒體、葉綠體dna研究小也可使用；-引物沒有嚴格的種屈界限，同一套引物可用于任何一種植物的研 究，具有廣泛性和通用性。植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用用于種屬特界性鑒定外源導(dǎo)入基因的追蹤遺傳作圖rapd標(biāo)記從理論上講是無限的，而且在端粒及重復(fù)順序上可以找 出rapd

32、標(biāo)記位點，因此可以做出很密集、很詳細的遺傳圖來。 鑒定染色體上特界的dna片段，進行基因定位和分離rapd易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，敏感性高?？烧页雠c靶基因連鎖的rapd 標(biāo)記，進行基因定位。aflp(amplified restriction fragment polymorphism)瑞士 zabeau等1992年發(fā)明結(jié)介了 rflp和pcr技術(shù)的特點，具冇rflp技術(shù)的町靠性和pcr 技術(shù)高效性?；驹恚簩蚪Mdna進行酶切，連上雙鏈人工接頭，根據(jù)接 頭的核昔酸序列和悔切位點設(shè)計引物，進行選擇性擴增。它將rapd隨機性和專一性擴增巧妙結(jié)介，再選用內(nèi)切酶以達選擇 的目的。三個步驟(1) dna酶切

33、及人工接頭連接，對提取dna質(zhì)量要求較高，需避 免其它dna污染和抑制物質(zhì)的存在；(2) 擴增反應(yīng)；(3) 通常在4%-6%的變性聚內(nèi)烯酰胺凝膠上分離特點理論上，可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇堿基的種類、數(shù)ii很多, 所以標(biāo)記數(shù)目是無限的。每次譜帶在50-100條z間，多態(tài)性檢測菲常有用-呈典型的孟德爾方式遺傳-可用丁作為遺傳圖譜和物理圖譜的位標(biāo)。-可用于分析基因組dna、克隆的dna大片段，對模板濃度不敏感，即使模板濃度存在差異，也會得到強度一致 的譜帶。缺點專利技術(shù)，試劑盒價格貴需要同位索或非同位索標(biāo)記引物，須具特殊陰護措施、配套儀器設(shè) 備基因組的不完全酶切會彩響實驗結(jié)果，所以實驗對dna純

34、度和內(nèi) 切酶的質(zhì)屋要求較高。ssr ( simple sequence repeat )=(microsatellite)=(short tandem repeat,str)satellite dna：真核生物基因組酶切、離心后,在主帶附近會出 現(xiàn)(at)含量很離的簡單離度重復(fù)序列。microsatellite dna： 一類由兒個核苛酸(一般1-5個，基序很短) 為重復(fù)單位串聯(lián)而成的dna序列。繼rflp之后的笫二代分子標(biāo)記多態(tài)性好、重復(fù)好、共顯性標(biāo)記特點微衛(wèi)星dna廣泛存在：人和動物(tg) n,植物(at) n微衛(wèi)星dna長度的多態(tài)性微衛(wèi)星dna兩端多是高度保守的單拷貝序列 原理根據(jù)兩端

35、序列的保守性，設(shè)計引物；進行pcr,電泳分離，染色顯帶以檢測微衛(wèi)星序 列多態(tài)性。applications構(gòu)建遺傳連鎖圖種質(zhì)資源鑒定標(biāo)記輔助育種基因診斷與治療：一些人類基因病的產(chǎn)生與三核苜酸逍復(fù)序列動態(tài) 有關(guān)其他：簡單序列重復(fù)區(qū)間(intcr-simplc sequence repeat, issr)序列標(biāo)記位點(sequence-tagged sites,sts) 小衛(wèi)星 dna (minisatellite dna) 單鏈構(gòu)型多態(tài)性(single-strand comfonnation poiymorphism,sscp)變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel el

36、ectrophoresis,dgge) section 3 transposition (轉(zhuǎn)座)11 a specific form of genetic recombination that moves certain genetic elements from one dna site to anothe匚11 movement can occur with or without duplication (復(fù)制)of the element.transposons (轉(zhuǎn)座子) can insert within genes or the regulatory sequencesi基因組是相

37、對穩(wěn)定的，基因組屮的序列通簾處于恒定的位 置。因此，我們可以通過構(gòu)建遺傳圖譜(genetic map)來鑒 定己知基因的基因座。i在分子水平上，每個個體棊因組乙間的差異主要由重組引 起，但轉(zhuǎn)座元件(transposable element )或轉(zhuǎn)座子 (transposons)的存在也叮以造成基因組的改變。轉(zhuǎn)座子的概念及發(fā)現(xiàn)11 轉(zhuǎn)座子(transposon 或 transposable element)是基因組內(nèi) 相對獨立的、可移動序列，它們不必借用噬菌體或質(zhì)粒的 形式就可以從基因組的一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位， 這個過程稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。ii轉(zhuǎn)朋子每次移動時攜帶著轉(zhuǎn)

38、朋必需的基因一起在基因組 內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子乂稱跳躍基因(jumping gene),i轉(zhuǎn)座子是基因組的正常組成成分，不以獨立的形式存在 (如噬菌體或質(zhì)粒dna)o轉(zhuǎn)座的發(fā)生不依賴于轉(zhuǎn)座子和 靶位點之間任何的序列同源性，在基因組內(nèi)由一個部位直 接轉(zhuǎn)移到另一個部位。ii轉(zhuǎn)座以很低的頻率發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是隨機的，i轉(zhuǎn)座子有時插入到一個結(jié)構(gòu)棊因或基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)，引起 基因表達的改變。ii轉(zhuǎn)座子也可以引起基因組序列的重排，它們的移動也和進 化有關(guān)。i轉(zhuǎn)座元件首先是由barbara mcclintock于40年代在玉米的 遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的，她稱z為控制元件(controlling element

39、),因為它不僅能夠在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，而且還能夠 改變基因的活性并引起功能的改變。ii現(xiàn)在認為轉(zhuǎn)座子存在于地球上所冇的生物。轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座子分為兩個基本類型：i 一種是以編碼蛋白質(zhì)的dna序列的形式存在，其編碼的 蛋口能直接操作dna,從而使轉(zhuǎn)座子能夠在基因組內(nèi)繁 殖其自身。i另一種與反轉(zhuǎn)錄病毒冇關(guān)，并口它們可移動的特性來自于 它們能由rna轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生dna拷貝，這種dna拷貝然 后被整合到基因組的新位點。轉(zhuǎn)座子的作用ii轉(zhuǎn)座元件可直接或間接地促進基因組的重排。ii轉(zhuǎn)朋子的間歇的活動性似乎為自然選擇提供了一個不確 定的靶部位。ii轉(zhuǎn)座子是位于基因組內(nèi)的一個獨立的實體。轉(zhuǎn)座子與基因 組的這種關(guān)系相

40、當(dāng)于寄生蟲與宿主的關(guān)系。轉(zhuǎn)座了的擴增 可能通過產(chǎn)生有害的結(jié)果而得到平衡。ii在原核和真核細胞內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了通過dna移動的轉(zhuǎn)座子的 存在。插入序列11 5j簡單的轉(zhuǎn)座子被稱為插入序列is (insertion sequences, is)o is元件是細菌染色體和質(zhì)粒的正常組成部分。i最早被鑒定的轉(zhuǎn)座元件是細菌操縱子中的自主插入序列。 這種插入肌止了插入部位基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。ii is元件是獨立的結(jié)構(gòu)單位，每個元件只編碼為口身轉(zhuǎn)座所 需要的蛋白質(zhì)。i is元件的末端為短的反向末端重復(fù)序歹!j (inverted terminal repeats),通常這兩個拷貝密切相關(guān)，但并不完全一樣。在插入

41、部位，is dna總是和很短的正向重復(fù)序列(direct repeats) 相連。但在插入之前靶部位只有這兩個重復(fù)序列中的一個。轉(zhuǎn)座后 在轉(zhuǎn)座子的兩側(cè)各存在一個此序列的拷貝。轉(zhuǎn)座的結(jié)果是靶部位序列形成了兩個正向重復(fù)序列i is元件具冇一個典型的結(jié)構(gòu)，它的末端為反向重復(fù)序列， 而與其和連的宿主dna的末端為短的正向重復(fù)序列。ii當(dāng)在一段dna序列中見到這種結(jié)構(gòu)類塑時，可被用來鑒 別轉(zhuǎn)座子。ii反向重復(fù)序列標(biāo)明了轉(zhuǎn)座子的末端。所冇類型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn) 座皆需轉(zhuǎn)廉酚(transposase)對末端的識別。i阻止轉(zhuǎn)座的“順式作用”(命-acting)突變位丁末端。 除is1之外，所有的is元件皆含有一個單一

42、的長編碼區(qū)，其起始 于一端的反向亟復(fù)序列之內(nèi)，而剛好終止于另一端的反向匝復(fù)序列 z前或z內(nèi)，它編碼轉(zhuǎn)座酶。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子i因為臂由is組成，每個is具有通常的反向巫復(fù)末端結(jié)構(gòu), 因此復(fù)合塑轉(zhuǎn)座子具有同樣的短的反向重復(fù)末端。ii 一個功能性的is結(jié)構(gòu)單位能轉(zhuǎn)座它木身或整個轉(zhuǎn)座子。ii對于復(fù)合型轉(zhuǎn)座子來說，隨著中央序列的増長，轉(zhuǎn)廉的頻 率降低。所以長度的依賴性是決定普通復(fù)合型轉(zhuǎn)座子人小 的一個因素。i支持復(fù)合型轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的i個主要的動力是對中心區(qū)所 攜帶的標(biāo)志的選擇。轉(zhuǎn)座發(fā)生的機制i轉(zhuǎn)座子插入到一個新的部位的通常步驟是：在靶dna上 制造一個交錯的切口，然后轉(zhuǎn)座子與突出的單鏈末端相連 接，并填充切口

43、。ii交錯末端的產(chǎn)生和填充解釋了在插入部位產(chǎn)生靶dna正 向重復(fù)的原因。鏈的切口z間的交錯決定了正向重復(fù)的長 度。三種不同類型的轉(zhuǎn)座ii (1)復(fù)制型轉(zhuǎn)座(replicative transposition)作為自身移動 的一個部分，轉(zhuǎn)座子被復(fù)制，一個拷貝仍然保的在原來的 位置上，而另一個則插入到一個新的部位，這樣轉(zhuǎn)座過程 伴隨著轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加。2) 非復(fù)制型轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座元件作為一個物理實體直接由一個部位轉(zhuǎn)移到另一個部位。3) 保守型轉(zhuǎn)座i保守型轉(zhuǎn)座是另一種非復(fù)制型的轉(zhuǎn)座過程，該過程中轉(zhuǎn)朋 元件從供體部位被切除并通過一系列的過程插入到靶部 位，在該過程中每個核苛鍵皆被保酣。ii該轉(zhuǎn)座過程與x的

44、整合機制類似，并且轉(zhuǎn)座酶與x整合酶 家族有關(guān)。除了引起在新部位序列插入的簡單分子間轉(zhuǎn)座z外，轉(zhuǎn)座子還能促 進其他類型的dna重排。任何一對止向重復(fù)序列z間的重組會導(dǎo)致它們的序列的缺失；而一 對反向重復(fù)序列之間的交互重組可能使重復(fù)序列之間的序列被倒 位，而重復(fù)序列本身被保留反轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄病毒ii轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子是基因組屮可移動的獨立的dna序 列，一個轉(zhuǎn)座子可由基因組的一個位置移到另一個位置。 從dna到dna的轉(zhuǎn)移過程稱為轉(zhuǎn)座。從dna到rna 再到dna的過程稱為反轉(zhuǎn)座。反轉(zhuǎn)朋是經(jīng)rna介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座過程ii必須經(jīng)過rna屮間體的轉(zhuǎn)座過程是真核生物所特冇的。ii 一些真核細胞的轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄病毒的原病i®的一般組 成結(jié)構(gòu)相關(guān)，并且通過rna中間體進行轉(zhuǎn)座，這一類結(jié) 構(gòu)單位稱為反轉(zhuǎn)座子(retroposons)oii反轉(zhuǎn)座子