第十章免疫學(xué)診斷

1、免疫學(xué)診斷技術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù)抗原及抗體的制備抗原及抗體的制備一、抗原的制備一、抗原的制備 1. 細(xì)菌抗原細(xì)菌抗原細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)滅活，加熱或化學(xué)方法滅活，加熱或化學(xué)方法離心洗滌離心洗滌無活菌檢驗(yàn)無活菌檢驗(yàn)配置成配置成1億菌量?jī)|菌量/mL的菌懸液的菌懸液2. 細(xì)菌細(xì)菌O抗原抗原細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)100孵育孵育22.5h，破壞，破壞H抗原抗原離心洗滌離心洗滌無活菌檢驗(yàn)無活菌檢驗(yàn)配置成約配置成約1億菌量?jī)|菌量/mL的菌懸液的菌懸液即為即為O抗原抗原3. 細(xì)菌細(xì)菌H抗原抗原細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)0 .4%甲醛生理鹽水洗刮菌苔甲醛生理鹽水洗刮菌苔37水浴水浴24h或或4 35d無活菌檢驗(yàn)無活菌檢驗(yàn)配置成約配置成

2、約1億菌量?jī)|菌量/mL的菌懸液的菌懸液即為即為H抗原抗原細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)0 .5%甲醛溶液洗刮菌苔甲醛溶液洗刮菌苔離心洗滌，離心洗滌，0.5%甲醛溶液甲醛溶液4 過夜過夜離心棄沉淀離心棄沉淀上清上清10,000rpm冷凍離心冷凍離心15,棄棄 沉淀沉淀上清上清40,000rpm冷凍離心冷凍離心2.5h，棄上，棄上清，沉淀懸浮于蒸餾水，即為清，沉淀懸浮于蒸餾水，即為H抗原抗原或或4. 細(xì)菌菌毛抗原細(xì)菌菌毛抗原細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)30%蔗糖溶液，劇烈震蕩（蔗糖溶液，劇烈震蕩（620次次/分分10,000rpm離心，離心，15，棄沉淀，棄沉淀50,000rpm冷凍離心冷凍離心6h沉淀用蒸餾水懸浮，即成菌

3、毛抗原沉淀用蒸餾水懸浮，即成菌毛抗原5. 病毒抗原病毒抗原沉淀用沉淀用PBS懸浮懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物或組織懸液細(xì)胞培養(yǎng)物或組織懸液反復(fù)凍融，反復(fù)凍融，34次次20,000rpm冷凍離心，棄沉淀冷凍離心，棄沉淀上清超速冷凍離心，或梯度離心上清超速冷凍離心，或梯度離心沉淀用沉淀用PBS懸浮懸浮收集病毒條帶收集病毒條帶6. 蛋白質(zhì)抗原蛋白質(zhì)抗原 離心分離（梯度離心），鹽析（飽和硫酸銨），離心分離（梯度離心），鹽析（飽和硫酸銨）， 分子篩層析，離子交換層析分子篩層析，離子交換層析7. 半抗原半抗原 載體：載體：HSA，BSA，OA，鑰孔戚血藍(lán)蛋白等，鑰孔戚血藍(lán)蛋白等 連接：多用化學(xué)方法。連接：多用化學(xué)方法。

4、 炭化二亞胺法：炭化二亞胺法：縮合劑，既能縮合氨基又能縮合羧基縮合劑，既能縮合氨基又能縮合羧基 戊二醛法：戊二醛法：以其兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以以其兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價(jià)鍵連接共價(jià)鍵連接 氯甲酸異丁脂法：氯甲酸異丁脂法：半抗原的羧基與載體蛋白的氨基以半抗原的羧基與載體蛋白的氨基以肽鍵相連肽鍵相連二、佐劑二、佐劑 1. 概念概念 凡能非特異性地通過物理或化學(xué)的方式與抗原結(jié)合凡能非特異性地通過物理或化學(xué)的方式與抗原結(jié)合而增強(qiáng)其特異免疫原性的物質(zhì)。而增強(qiáng)其特異免疫原性的物質(zhì)。 2. 作用作用 儲(chǔ)存作用儲(chǔ)存作用 活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞與活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞與T、B的相互

5、作用的相互作用 增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，提高抗體滴度增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，提高抗體滴度 3. 常用佐劑常用佐劑三、抗血清的制備三、抗血清的制備 1. 抗體產(chǎn)生規(guī)律抗體產(chǎn)生規(guī)律2. 免疫動(dòng)物選擇免疫動(dòng)物選擇3. 免疫劑量免疫劑量 家兔家兔 初次免疫：初次免疫：50200ug，加福氏完全佐劑，背部皮下多點(diǎn)注射。，加福氏完全佐劑，背部皮下多點(diǎn)注射。 再次免疫：再次免疫： 50200ug，加福氏不完全佐劑。，加福氏不完全佐劑。 豚鼠和大鼠豚鼠和大鼠 初次免疫：初次免疫：10100ug，加福氏完全佐劑，背部皮下多點(diǎn)注射。，加福氏完全佐劑，背部皮下多點(diǎn)注射。 再次免疫：再次免疫： 105

6、0ug，加福氏不完全佐劑。，加福氏不完全佐劑。 小鼠小鼠 550ug 綿羊或山羊綿羊或山羊 初次免疫：初次免疫：0.510mg，加福氏完全佐劑，肌肉、皮下或皮內(nèi)多，加福氏完全佐劑，肌肉、皮下或皮內(nèi)多點(diǎn)注射。點(diǎn)注射。 再次免疫：再次免疫： 0.510mg ，加福氏不完全佐劑。，加福氏不完全佐劑。 雞雞 初次免疫：初次免疫： 50200ug，加福氏完全佐劑，胸肌多點(diǎn)注射。，加福氏完全佐劑，胸肌多點(diǎn)注射。 再次免疫：再次免疫： 50200ug，加福氏不完全佐劑。，加福氏不完全佐劑。4. 動(dòng)物采血法動(dòng)物采血法5. 血清分離血清分離6. 免疫球蛋白的提取免疫球蛋白的提取四、單克隆抗體的制備四、單克隆抗體

7、的制備五、基因工程抗體的制備五、基因工程抗體的制備圖8-5 B細(xì)胞雜交瘤及單克隆抗體制備過程（據(jù)杜念興）凝聚性試驗(yàn)?zāi)坌栽囼?yàn) 抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，在電解質(zhì)存在下，復(fù)合物相互凝形在電解質(zhì)存在下，復(fù)合物相互凝形成肉眼可見的凝集小塊或沉淀物，成肉眼可見的凝集小塊或沉淀物，根據(jù)是否產(chǎn)生凝聚現(xiàn)象來判定抗體根據(jù)是否產(chǎn)生凝聚現(xiàn)象來判定抗體或抗原，稱為凝聚性試驗(yàn)。或抗原，稱為凝聚性試驗(yàn)。凝集試驗(yàn)?zāi)囼?yàn)沉淀試驗(yàn)沉淀試驗(yàn) 顆粒性抗原與其相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，顆粒性抗原與其相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形

8、成肉眼可見的凝集團(tuán)塊的試驗(yàn)，稱為凝集試驗(yàn)（的試驗(yàn)，稱為凝集試驗(yàn)（agglutination）。）。凝集試驗(yàn)?zāi)囼?yàn)1. 直接凝集試驗(yàn)直接凝集試驗(yàn) 玻片凝集，試管凝集玻片凝集，試管凝集 2. 間接凝集試驗(yàn)間接凝集試驗(yàn) 將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的不溶性顆粒表面（載體）然后再與相應(yīng)的、一定大小的不溶性顆粒表面（載體）然后再與相應(yīng)的抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)條件下，發(fā)生特的抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)條件下，發(fā)生特異性凝集反應(yīng)，稱為間接凝集試驗(yàn)。異性凝集反應(yīng)，稱為間接凝集試驗(yàn)。 間接血凝，乳膠凝集，碳凝集。間接血凝，

9、乳膠凝集，碳凝集。 反向間接凝集試驗(yàn)反向間接凝集試驗(yàn)3. 協(xié)同凝集試驗(yàn)協(xié)同凝集試驗(yàn) 覆蓋有特異性抗體的金黃色葡萄球菌與相應(yīng)的抗原結(jié)覆蓋有特異性抗體的金黃色葡萄球菌與相應(yīng)的抗原結(jié)合時(shí)，在適宜電解質(zhì)條件下，發(fā)生特異性凝集反應(yīng)，稱為合時(shí)，在適宜電解質(zhì)條件下，發(fā)生特異性凝集反應(yīng)，稱為協(xié)同凝集試驗(yàn)。協(xié)同凝集試驗(yàn)。 富含富含SPA的金的金 IgG類類 結(jié)合了結(jié)合了IgG類抗體類抗體 抗抗 原原 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 黃色葡萄球菌黃色葡萄球菌 抗抗 體體 的金黃色葡萄球菌的金黃色葡萄球菌 的協(xié)同凝集的協(xié)同凝集 沉淀試驗(yàn)沉淀試驗(yàn) 可溶性抗原（如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌可溶性抗原（如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素

10、、菌體裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出體裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀試驗(yàn)形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀試驗(yàn)（precipitation test）。）。 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)，免疫電泳技術(shù)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)，免疫電泳技術(shù)標(biāo)記抗體技術(shù)標(biāo)記抗體技術(shù) 根據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性和根據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性和標(biāo)記分子的敏感性建立的技術(shù)，稱標(biāo)記分子的敏感性建立的技術(shù)，稱為標(biāo)記抗體技術(shù)（為標(biāo)記抗體技術(shù)（labelled antibody techniq

11、ue）。）。 免疫檢測(cè)新技術(shù)免疫檢測(cè)新技術(shù)一、一、SPA檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù) 1. SPA的特性的特性 分子量為分子量為1215KD，等電點(diǎn)為，等電點(diǎn)為pH5.1，多肽單鏈，多肽單鏈，內(nèi)有內(nèi)有3個(gè)高度相似的個(gè)高度相似的IgG Fc端結(jié)合區(qū)，天然結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。端結(jié)合區(qū)，天然結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。 能與人和豚鼠、豬、兔、小鼠和猴等動(dòng)物的能與人和豚鼠、豬、兔、小鼠和猴等動(dòng)物的IgG結(jié)合。結(jié)合。 2. SPA的應(yīng)用的應(yīng)用 SPA標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù) 酶標(biāo)酶標(biāo)SPA，熒光素標(biāo)記，熒光素標(biāo)記SPA，放射性標(biāo)記，放射性標(biāo)記SPA 免疫球蛋白的制備免疫球蛋白的制備 親和層析，親和層析，SPA-Sepharose層析柱，層析柱， 洗脫

12、條件為：洗脫條件為：4mol/L尿素、尿素、 4mol/L硫氰酸鹽硫氰酸鹽 或或 6mol/L 鳥嘌呤鹽酸鹽鳥嘌呤鹽酸鹽二、生物素二、生物素-親和素免疫檢測(cè)技術(shù)親和素免疫檢測(cè)技術(shù) 1. 生物素與親和素的特性生物素與親和素的特性 生物素（生物素（biotin）：）：廣泛存在于動(dòng)、植物組織中的廣泛存在于動(dòng)、植物組織中的生長(zhǎng)因子，也即輔酶生長(zhǎng)因子，也即輔酶R或維生素或維生素H。分子量為。分子量為244D，生，生物素的羧基用化學(xué)方法修飾后，可制成各種活性基團(tuán)物素的羧基用化學(xué)方法修飾后，可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，成為活化生物素，用于標(biāo)記。的衍生物，成為活化生物素，用于標(biāo)記。 親和素（親和素（avidi

13、n）：）：存在于雞蛋清中的堿性蛋白，存在于雞蛋清中的堿性蛋白，能與生物素牢固地結(jié)合。分子量為能與生物素牢固地結(jié)合。分子量為68KD，pI為為10.5，對(duì)熱穩(wěn)定，富含色氨酸。每個(gè)親和素分子有對(duì)熱穩(wěn)定，富含色氨酸。每個(gè)親和素分子有4個(gè)與生物個(gè)與生物素結(jié)合的位點(diǎn)。素結(jié)合的位點(diǎn)。 鏈霉親和素（鏈霉親和素（stretoavidin）：是）：是Streptomyces avidini 菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的蛋白。菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的蛋白。pI為為6.02. 生物素和親和素的標(biāo)記生物素和親和素的標(biāo)記 生物素的標(biāo)記生物素的標(biāo)記 標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素：標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素： 生物素生物素N-羥基丁二酰亞胺

14、酯（羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長(zhǎng)臂）、長(zhǎng)臂BNHS 標(biāo)記醛基的活化生物素：標(biāo)記醛基的活化生物素： 生物素酰肼（生物素酰肼（BHZ）、賴氨酸生物素酰肼）、賴氨酸生物素酰肼 標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的生物素：標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的生物素： 賴氨酸生物素賴氨酸生物素-丙氨丙氨-N-順丁烯亞胺順丁烯亞胺 親和素的標(biāo)記親和素的標(biāo)記 可用酶、熒光素等標(biāo)記可用酶、熒光素等標(biāo)記 3. 生物素生物素-親和素免疫檢測(cè)系統(tǒng)親和素免疫檢測(cè)系統(tǒng) ABC法：法： Ag-Ab-Ab2-生物素生物素-親和素親和素-生物素生物素-酶酶 BRAB法：法：Ag-Ab-生物素生物素-親和素親和素-生物素生物素-酶酶 LAB法：法： Ag- Ab-生物素生物素-親和素親和素-酶酶三、免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)三、免疫膠體金檢測(cè)技術(shù) 1. 概述概述 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金顆粒為示蹤物或顯色免疫膠體金技術(shù)是以膠體金顆粒為示蹤物或顯色劑，用于抗原抗體檢測(cè)的技術(shù)。劑，用于抗原抗體檢測(cè)的技術(shù)。 膠體金是通過還原劑將氯化金分子聚合成特定膠體金是通過還原劑將氯化金分子聚合成特定大小的金顆粒，能與多種生物分子（如抗體，大小的金顆粒，能與多種生物分子（如抗體，SPA等）等）相結(jié)合，即膠體金標(biāo)記物。相結(jié)合，即膠體金標(biāo)記物。 2. 膠體金檢測(cè)技術(shù)膠體金檢測(cè)技