DNA%BA%CD%D6%CA%C1%A3%B3%E9%CC%E1

1、DNADNA抽取和質(zhì)粒抽取和質(zhì)粒DNADNA制備制備第一部分第一部分 DNA提取總論提取總論一、提取一、提取DNADNA總的原則：總的原則：1 1 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類 分子分子的污染應(yīng)降低到最低程度；的污染應(yīng)降低到最低程度；3 3 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；劑和過(guò)高濃度的金屬離子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也應(yīng)盡量去除。也應(yīng)盡量去除。二、樣本來(lái)源：二、樣本來(lái)源：w理論上所有有核真核

2、細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可理論上所有有核真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可以提取以提取DNAw樣本選擇取決于樣本選擇取決于試驗(yàn)?zāi)康脑囼?yàn)?zāi)康膚全血是基因組提取最常見(jiàn)的樣本全血是基因組提取最常見(jiàn)的樣本w血清、血漿、外周血有核細(xì)胞、痰液、體液、棉拭子采集的各種分泌物、組織（包括骨髓）和羊水等都是分子診斷的檢驗(yàn)材料，其中全血、血漿（血清）標(biāo)本占分子診斷的60%以上 DNA提取前樣本采集、預(yù)處理和保存：提取前樣本采集、預(yù)處理和保存：（一）全血（一）全血 1.抗凝劑 EDTA-Na2 或枸櫞酸鈉或枸櫞酸鈉 作為抗凝劑作為抗凝劑 不宜使用肝素不宜使用肝素 抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80保存2個(gè)月，第10天收率90

3、%4 第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄后逆轉(zhuǎn)錄后RT-PCRRT-PCR結(jié)果（結(jié)果（0 0、3 3、6 6個(gè)月）個(gè)月）A B C DA B C D（二）血漿和血清（二）血漿和血清w血漿和血清是檢測(cè)釋放入血的游離核酸最主要的標(biāo)本來(lái)源，用來(lái)檢測(cè)病毒、細(xì)菌，以及腫瘤細(xì)胞等等釋放出來(lái)的游離核酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在臨床上被廣泛應(yīng)用于病原微生物和腫瘤標(biāo)志基因的檢測(cè)中 w血漿DNA又稱為循環(huán)DNA，是一種無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA，主要是游離的單鏈、雙鏈DNA或DNA-蛋白質(zhì)的混合物w它在未來(lái)分子診斷的應(yīng)用中具有廣闊前景w血漿DN

4、A成分的來(lái)源分為內(nèi)源性和外源性兩個(gè)部分，其中入侵的病毒、細(xì)菌等病原體釋放入血液的核酸是外源性血漿DNA最重要的成分血漿血漿DNADNA內(nèi)源性循環(huán)內(nèi)源性循環(huán)DNADNA外源性循環(huán)外源性循環(huán)DNADNA自身基因組來(lái)源自身基因組來(lái)源DNADNA入侵的病毒、細(xì)菌等病原體入侵的病毒、細(xì)菌等病原體死亡細(xì)胞死亡細(xì)胞活細(xì)胞釋放活細(xì)胞釋放（三（三）體液體液w尿液、胸水、腹水和腦脊液等標(biāo)本離心后取沉淀提取體液中細(xì)胞的核酸w對(duì)釋放入體液中的病毒或細(xì)菌的游離核酸，采用超高速離心或體液濃縮后再提取核酸（四）分泌物（四）分泌物（以痰液為例）w痰液是檢測(cè)呼吸道病原體核酸的主要樣本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采

5、集前應(yīng)先漱口，以避免混入大量的口腔脫落的上皮細(xì)胞和唾液等影響檢測(cè)結(jié)果 w結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白質(zhì)；非結(jié)核分枝桿菌的核酸，使用生理鹽水后取上清液 w痰液檢測(cè)病原體核酸不適宜作定量分析，檢測(cè)時(shí)盡可能提高痰液中細(xì)胞成分的回收率三、三、DNA的收率的收率樣本類型樣本類型基因組基因組DNA收率收率20mg肝臟組織肝臟組織8 g100mg豆苗豆苗10 g100 l全血全血2 g2 106培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞10 g四、四、DNA提取的基本步驟提取的基本步驟1、核酸的釋放：核酸的釋放： 破裂細(xì)胞破裂細(xì)胞 釋放核酸釋放核酸 機(jī)械法與非機(jī)械法機(jī)械法與非機(jī)械法 （非機(jī)械法中（非機(jī)械法

6、中溶胞法溶胞法是應(yīng)最廣泛的方法）是應(yīng)最廣泛的方法）各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法 應(yīng)用 機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動(dòng)物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母 物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞 化學(xué)法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母破裂細(xì)胞破裂細(xì)胞 、釋放核酸、釋放核酸2、核酸的分離與純化：、核酸的分離與純化： 將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其 他物質(zhì)分離他物質(zhì)分離 非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂 類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶

7、液類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用少數(shù)鹽類可使用70-75%70-75%的乙醇洗滌的乙醇洗滌4、DNA鑒定鑒定 DNA的鑒定的鑒定 濃度鑒定濃度鑒定 純度鑒定純度鑒定 完整性鑒定完整性鑒定濃度鑒定濃度鑒定1 1）紫外分光光度法：測(cè)定）紫外分光光度法：測(cè)定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。 如計(jì)算如計(jì)算

8、DNADNA濃度濃度 A A260260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)5050 g/mlg/ml紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25ug/ml的核酸的核酸溶液。溶液。(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA，20g/ml單鏈寡核苷酸） 各種堿基的紫外吸收光譜各種堿基的紫外吸收光譜2 2）熒光光度法）熒光光度法 熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。 適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5

9、ng）EB與DNA的結(jié)合500 l全血提取的基因組全血提取的基因組DNA電泳電泳動(dòng)物組織提取基因組動(dòng)物組織提取基因組DNA純度鑒定純度鑒定紫外分光光度法：紫外分光光度法： 在在260260nmnm和和280280nmnm處測(cè)定處測(cè)定DANDAN溶液的光吸收，純的溶液的光吸收，純的DNADNA，低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有高于此值表明有RNARNA的殘留量。的殘留量。 A A260260與與A A280280之比應(yīng)在之比應(yīng)在1.801.80；純的；純的RNA ARNA A260260與與A A280280之比之比應(yīng)在應(yīng)在2.02.0。 A

10、260/A280A260/A280比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)。比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)。完整性鑒定完整性鑒定凝膠電泳法：凝膠電泳法： 基因組基因組DNADNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象； 總總RNARNA電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在RNARNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNADNA污染。污染。5 5、核酸的貯存、核酸的貯存DNADNA保存保存 1 1）短期貯存：）短期貯存： 4 4或或-20-20存放于存放于TETE（tri

11、stris和和EDTAEDTA）緩沖液中。緩沖液中。 TETE緩沖液的緩沖液的PHPH與與DNA DNA 貯存有關(guān)，貯存有關(guān)，PHPH為為8 8時(shí)，可減少時(shí)，可減少DNADNA脫氨反應(yīng)，脫氨反應(yīng)，PHPH低于低于7.07.0時(shí)時(shí)DNADNA容易變性。容易變性。2 2）長(zhǎng)期貯存：）長(zhǎng)期貯存： TETE緩沖液中緩沖液中-70-70保存數(shù)年；在保存數(shù)年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染?？捎行Х乐辜?xì)菌和核酸的污染。第二部分第二部分 基因組基因組DNADNA的分離與純化的分離與純化一、一、DNADNA樣品準(zhǔn)備樣品準(zhǔn)備 常見(jiàn)的標(biāo)本：常見(jiàn)的標(biāo)本： 血液、尿液、唾液、

12、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等 生物組織：生物組織： 最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存 70 70或液氮或液氮二、二、DNADNA提取提?。ㄒ唬┓映樘岱ǎ海ㄒ唬┓映樘岱ǎ?先用先用EDTAEDTA、 SDS SDS 、蛋白酶蛋白酶K K破碎細(xì)胞，破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用消化蛋白，然后用pH8pH8的的TrisTris飽和飽和酚或酚酚或酚- -氯仿抽提氯仿抽提DNADNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。獲沉淀。獲DNADNA大小為大小為100100150150kbkb。DNA酚抽提法示意圖主要試劑的作用：主要試劑的作用

13、： EDTAEDTA：1 1 二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶； 2 2 降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性SDSSDS的作用：的作用：1 1 溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂2 2溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸 釋放出來(lái)釋放出來(lái)3 3 對(duì)對(duì)RNARNA、DNADNA酶有抑制作用酶有抑制作用4 4 與蛋白質(zhì)形成與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3 R-O-SO3 .R.R蛋白質(zhì)復(fù)合物，蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性使蛋白質(zhì)變性蛋白酶蛋白酶K K：w水解蛋白質(zhì)的作用，消化水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNADNA酶和細(xì)胞

14、中的蛋白質(zhì)酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)w蛋白酶蛋白酶K K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能 力，而且在力，而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可存在時(shí)仍保持較高活性，可 同時(shí)使用同時(shí)使用苯酚的特點(diǎn)：苯酚的特點(diǎn)：w蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑、抑制蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑、抑制DNADNA酶活性酶活性w苯酚溶于有機(jī)溶劑，微溶于水苯酚溶于有機(jī)溶劑，微溶于水w提取提取DNADNA前苯酚用前苯酚用Tris-HclTris-Hcl飽和，防止吸收過(guò)多飽和，防止吸收過(guò)多DNADNA，降低降低DNADNA的損失率的損失率w氧化苯酚會(huì)破壞氧化苯酚會(huì)破壞DNADNA為什么苯酚要重蒸飽和

15、后才能用于為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNADNA的分離？的分離？ 苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。 氧化苯酚需要經(jīng)過(guò)高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。wPH8.0PH8.0的的TrisTris溶液可以似的抽提出的溶液可以似的抽提出的DNADNA進(jìn)入進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。w在酚或酚在酚或酚- -氯仿中加入少許的異戊醇，是可以氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。保持分相的穩(wěn)

16、定性。DNADNA的沉淀的沉淀1）無(wú)水乙醇沉淀）無(wú)水乙醇沉淀 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。 無(wú)水乙醇可以吸收分子之間的水，使無(wú)水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無(wú)水沉淀析出，無(wú)水乙醇使用前冰凍，可以減少乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過(guò)程釋放熱量對(duì)沉淀析出過(guò)程釋放熱量對(duì)DNA的損傷。的損傷。2）異丙醇沉淀）異丙醇沉淀 除了使除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子分子（二）（二） 甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚

17、法：w破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與質(zhì)與DNADNA的結(jié)合，再透析獲得的結(jié)合，再透析獲得DNADNA。高濃度甲酰高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNADNA的復(fù)合物，可以使蛋的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟w甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNADNA樣品?？傻脴悠??？傻肈NA 200kbDNA 200kb左右。左右。（三）（三） 玻璃棒纏繞法：玻璃棒纏繞法：w用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上

18、，然后用帶鉤或上，然后用帶鉤或U U型玻璃棒在界面輕攪，型玻璃棒在界面輕攪，DANDAN沉淀液繞于玻棒。生成沉淀液繞于玻棒。生成DNADNA約約8080kbkbDNA玻棒纏繞法示意圖（四）（四） 表面活性劑快速制備法：用表面活性劑快速制備法：用Triton Triton X-100X-100或或NP40NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶用蛋白酶K K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。析。二、二、DNADNA的濃縮的濃縮1 1、固體聚乙二醇（、固體聚乙二醇（PEGPEG）濃縮：用透析袋濃縮：用透析袋 外敷外敷PEGPEG至合適量至合適量2 2、

19、丁醇抽提濃縮：、丁醇抽提濃縮：DNADNA溶液中水可分配到溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但正丁醇或仲丁醇，但DNADNA不會(huì)。因此重復(fù)不會(huì)。因此重復(fù)幾次可顯著減少幾次可顯著減少DNADNA體積體積三、三、DNADNA回收回收 主要是從電泳中分離回收主要是從電泳中分離回收DNADNA片段片段回收原則：盡量提高回收率回收原則：盡量提高回收率 去除回收去除回收DNADNA樣品中的污染物樣品中的污染物（二） 從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段（一） 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段1.二乙基氨基乙基-纖維素膜插片電泳法2.電泳洗脫法3.冷凍擠壓法4.低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法 （一） 從瓊脂糖凝膠中回收DN

20、A片段電泳到電泳到DEAE-DEAE-纖維素膜纖維素膜 ： DEAEDEAE是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有負(fù)電荷的負(fù)電荷的DNADNA分子分子 在所需條帶前插入在所需條帶前插入DEAT-DEAT-纖維素膜，繼續(xù)電泳纖維素膜，繼續(xù)電泳至條帶至條帶DNADNA都到膜上，取出洗下都到膜上，取出洗下 500 500bp-5kbbp-5kb的的DNADNA片段回收率較好，純度高。片段回收率較好，純度高。但但不適用于分子量超過(guò)不適用于分子量超過(guò)1010kbkb和單鏈和單鏈DNADNA 透析袋電洗脫透析袋電洗脫 ： 切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后切下條

21、帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳，繼續(xù)電泳，DNADNA出膠后進(jìn)行抽提出膠后進(jìn)行抽提DNADNA回收?；厥铡?低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠：低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠： 切下膠，加熱到切下膠，加熱到6565熔化膠，然后抽提回收熔化膠，然后抽提回收DNADNA。 方法：有機(jī)溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂方法：有機(jī)溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。水解酶等。 瓊脂水解酶：將含瓊脂水解酶：將含DNADNA的凝膠進(jìn)行消化，瓊脂的凝膠進(jìn)行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放糖水解成二糖，釋放DNADNA，后使用酚抽提方法后使用酚抽提方法回收回收DNA DNA （二） 從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝膠

22、中回收DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。雖費(fèi)時(shí)但操作簡(jiǎn)單，是小片段DNA回收的較好方法。w至今尚無(wú)一種方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同時(shí)回收幾種DNA片段并有效清除凝膠中酶促反應(yīng)抑制劑。DNA提取試驗(yàn)中常遇到的問(wèn)題提取試驗(yàn)中常遇到的問(wèn)題w基因組DNA收率較低或無(wú)基因組DNA 樣本材料太少 細(xì)胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全 離心力偏小 兩相分離不完全 wDNA降解的原因降解的原因 樣本不夠新鮮，采集材料過(guò)陳舊 樣本本身存在大量DNA酶w提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因組DNA鹽濃度過(guò)高 基因組DNA中乙醇未清除凈 基因組DNA中可能存在其他抑制因素w提取基因組提取

23、基因組DNA，有時(shí)加入蔗糖的原因有時(shí)加入蔗糖的原因 加入多糖，保護(hù)加入多糖，保護(hù)DNA長(zhǎng)度長(zhǎng)度質(zhì)質(zhì) 粒粒 DNA DNA 制制 備備plasmid extractionplasmid extraction 質(zhì)粒簡(jiǎn)介質(zhì)粒簡(jiǎn)介質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)(plasmid)是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀自我復(fù)制的小環(huán)狀DNADNA分子分子 其大小范圍從其大小范圍從lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。 已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒. . 這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行

24、復(fù) 制和遺傳的輔助性遺傳單位。制和遺傳的輔助性遺傳單位。 Chromosome DNA genomePlasmid DNA 質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)本的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 質(zhì)粒特性質(zhì)粒特性1. 1. 分子相對(duì)小分子相對(duì)小 2. 2. 含有高效的自主復(fù)制成分含有高效的自主復(fù)制成分 3. 3. 不相容性不相容性(incompatibility)(inc

25、ompatibility)4. 4. 轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)移性5. 5. 選擇的標(biāo)記選擇的標(biāo)記(selective markers)(selective markers)6. 6. 限制性內(nèi)切酶單一切口限制性內(nèi)切酶單一切口質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)w 分子量相對(duì)較小分子量相對(duì)較小w 共價(jià)閉合分子共價(jià)閉合分子w 雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的抗切割和抗變性能力具有更強(qiáng)的抗切割和抗變性能力超螺旋超螺旋DNA分子分子 線性線性DNA分子分子 半開(kāi)環(huán)半開(kāi)環(huán)DNA分子分子Plasmid vectors表達(dá)載體表達(dá)載體載體含有載體含有tac啟動(dòng)子、啟動(dòng)子、Lac操縱基因、操縱基因、SD序列、序列、Lac I阻遏

26、蛋白基因等阻遏蛋白基因等 Exprssion vector 細(xì)菌收集純化質(zhì)粒DNA細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取和純化的提取和純化 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取和純化的提取和純化 一、細(xì)菌的培養(yǎng)一、細(xì)菌的培養(yǎng) (bacterial culture)(bacterial culture)l l 先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA也在自主復(fù)制。也在自主復(fù)制。 對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上不受到宿主細(xì)胞的控制，故在細(xì)菌

27、對(duì)度上不受到宿主細(xì)胞的控制，故在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，加入氯霉素（數(shù)生長(zhǎng)后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體DNADNA的復(fù)制。的復(fù)制。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的復(fù)制不受影響而大量擴(kuò)增的復(fù)制不受影響而大量擴(kuò)增l 所以使用氯霉素的主要目的，是在不減所以使用氯霉素的主要目的，是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細(xì)菌的培養(yǎng)低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細(xì)菌的培養(yǎng)體積和細(xì)菌的數(shù)量體積和細(xì)菌的數(shù)量 有時(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌中的擴(kuò)增狀況很差，常有時(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌中的擴(kuò)增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過(guò)大所致。過(guò)大所致。二、

28、細(xì)菌的收集二、細(xì)菌的收集(bacterial collection)(bacterial collection)w細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒了提高質(zhì)粒DNADNA的純度，離心棄上清，細(xì)的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用菌沉淀最好用STESTE或生理鹽水懸浮，漂洗或生理鹽水懸浮，漂洗l-2l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈。除干凈。 三、細(xì)菌裂解w細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。不法、堿變性法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法

29、等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇加以選擇。 質(zhì)粒提取的方法質(zhì)粒提取的方法w堿裂解法堿裂解法 (Alkaline )w煮沸裂解法煮沸裂解法wSDS裂解法裂解法w其他其他質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA提取方法的選擇提取方法的選擇 l 常用的煮沸法，堿法常用的煮沸法，堿法, ,SDSSDS法均可獲得較法均可獲得較滿意效果至于有人采用堿法提取小量滿意效果至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒， 用煮沸法或用煮沸法或SDSSDS法法進(jìn)行質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒DNA

30、DNA的大量分離，只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)的大量分離，只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問(wèn)題室的習(xí)慣問(wèn)題. .l選擇哪種方法制備質(zhì)粒選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNADNA，應(yīng)考慮以下應(yīng)考慮以下因素：因素： 1 1菌株類型（菌株類型（typetype） 2 2質(zhì)粒的大小質(zhì)粒的大小( (size)size) 3 3細(xì)菌染色體細(xì)菌染色體DNADNA變性條件強(qiáng)弱的控制變性條件強(qiáng)弱的控制 ( (denaturation condition)denaturation condition)質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量制備的小量制備 2-5ml質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的大量制備的大量制備 500mlw大質(zhì)粒（大質(zhì)粒（15kb）的處理方法：的處理方法： 采用溫

31、和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用后再使用SDS裂解，使裂解，使plasmid損傷減少損傷減少w小質(zhì)粒（小質(zhì)粒（15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。（四）其它方法（四）其它方法2、牙簽少量制備法1、 小量一步提取法1、 小量一步提取法 直接將酚/氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部分蛋白質(zhì)和染色體DNA，最后從上清液中回收質(zhì)粒DNA。本法簡(jiǎn)單快捷、成本低，提取的質(zhì)?？捎糜谙拗菩詢?nèi)切酶圖譜分析。（二）牙簽少量制備法 用牙簽直接挑取生長(zhǎng)在瓊脂平板上的細(xì)菌菌落制備質(zhì)粒DNA。 由于制備的質(zhì)粒DNA有較多污

32、染，不能用于分子克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的純化的純化.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱層析法EBCsCl密度梯度離心法wEB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA結(jié)合EB浮力密度降低較小，僅有0.085g/cm3。wCsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。 超速離心將介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過(guò)量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開(kāi)環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開(kāi)。EBCsCl密度梯度離心法示意圖l 轉(zhuǎn)基因動(dòng)

33、物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及DNADNA外切酶酶切外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)閉合環(huán)狀雙鏈缺失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)閉合環(huán)狀雙鏈DNADNA的要求較高，的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。 對(duì)于對(duì)于DNADNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針?lè)派湫詷?biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針?lè)派湫詷?biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直接用小量或中量提取的接用小量或中量提取的DNADNA樣品，并不需要超樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。速離心純化，一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。2 2 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法 分級(jí)沉淀，首先利用分級(jí)沉

34、淀，首先利用LiClLiCl沉淀大分子沉淀大分子RNARNA，用用RnaseRnase酶消化小分子酶消化小分子RNARNA；在利用乙二在利用乙二醇選擇性沉淀大質(zhì)粒醇選擇性沉淀大質(zhì)粒DNADNA，再利用酚再利用酚- -氯氯仿抽提。仿抽提。 方法簡(jiǎn)單實(shí)用，但是不能區(qū)分環(huán)狀或開(kāi)方法簡(jiǎn)單實(shí)用，但是不能區(qū)分環(huán)狀或開(kāi)鏈質(zhì)粒鏈質(zhì)粒DNADNA3 3 柱層析法柱層析法w以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹(shù)脂，在多以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹(shù)脂，在多鹽的條件下，鹽的條件下，DNADNA與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合進(jìn)行純化。進(jìn)行純化。w多鹽造成磷酸二酯骨架脫水，通過(guò)暴露多鹽造成磷酸二酯骨架脫水，通過(guò)暴露的磷酸鹽殘

35、基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后用的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后用50%50%的乙醇洗去的乙醇洗去RNARNA和糖類物質(zhì)，再加入和糖類物質(zhì)，再加入TETE或或水，離心洗脫。水，離心洗脫。RNARNA的分離與純化的分離與純化RNA isolation and purificationRNA isolation and purification每個(gè)細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞的RNA量約為量約為10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA組織材料起始樣品量Total RNA提取量blood1ml1520glecukocyte

36、s1107個(gè)約100 gLiver tissue1g約5000 gCulture cells1107個(gè)約100gRenal tissue1g約3000gSkeleton tissue1g約1500gCerebral tissue1g約1500g一、關(guān)于一、關(guān)于RNaseRNase酶酶wRNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中wRNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵wRNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)。wRnase不需要二價(jià)陽(yáng)離子激活w去除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與

37、否的關(guān)鍵。w必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。1.內(nèi)源性內(nèi)源性RNA酶酶（intrinsic RNase）2.外源性外源性RNA酶酶(extrinsic RNase)主要來(lái)源：w 被污染的緩沖液 細(xì)菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶， 必須丟棄w 自動(dòng)移液裝置3.實(shí)驗(yàn)室采取避免實(shí)驗(yàn)室采取避免RNA酶污染的措施酶污染的措施w設(shè)置專門設(shè)置專門RNA移液裝置移液裝置w小份保存緩沖液小份保存緩沖液w設(shè)置專門的設(shè)置專門的RNA電泳裝置電泳裝置w準(zhǔn)備溶液或緩沖液時(shí)，使用無(wú)準(zhǔn)備溶液或緩沖液時(shí)，使用無(wú)RNA酶的器皿、酶的器皿、 DEPC處理水等處理水等w分離分離RNA過(guò)程中

38、使用過(guò)程中使用RNA酶抑制劑酶抑制劑1. 1. 變性劑變性劑(denaturant)(denaturant)w選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑）w使用蛋白酶K(proteinase K) w使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉二、二、RNARNA酶抑制劑和變性劑酶抑制劑和變性劑w胍類變性劑胍類變性劑(carbamidine)：胍鹽是破壞蛋白質(zhì)：胍鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑。三維結(jié)構(gòu)的離液劑。w蛋白質(zhì)變性劑中作用最強(qiáng)的是異硫氰酸胍和鹽蛋白質(zhì)變性劑中作用最強(qiáng)的是異硫氰酸胍和鹽酸胍，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成隨機(jī)卷曲狀態(tài)。酸胍，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成隨機(jī)卷曲狀態(tài)。w鹽酸

39、胍抑制鹽酸胍抑制RNA酶作用強(qiáng)，變性作用較異硫氰酶作用強(qiáng)，變性作用較異硫氰酸胍弱。異硫氰酸胍自身可形成氫鍵，在還原酸胍弱。異硫氰酸胍自身可形成氫鍵，在還原劑存在下斷裂氫鍵。劑存在下斷裂氫鍵。w聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對(duì)RNA的降解。2.2.RNARNA酶抑制劑酶抑制劑(RNase inhibitor)(RNase inhibitor)（1）DEPC（焦碳酸二乙酯）w高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來(lái)滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。 OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制備：0.1%DEPC在37C處理1h

40、，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C處理1h或室溫下過(guò)夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過(guò)程中不使用DEPC。w許多RNA酶可以與該類蛋白質(zhì)結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物從而是RNA酶失活。wRNA酶蛋白抑制劑與靶蛋白的親和力大。w商品化的RNA酶蛋白抑制劑的名稱各異（如RNAsin等）。3.3.還原劑還原劑w加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。RNA提取實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備提取實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備【使用器具】 盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃

41、器皿，則使用0.1%DEPC水溶液在37處理12h，后120高壓30min，去除殘留DEPC【試劑配制】 無(wú)菌水須用0.1%DEPC處理后高溫高壓滅菌 RNA實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng)RNA提取專用，避免其他試劑交叉污染【其他】 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用一次性手套，并經(jīng)常更換；在RNA專用區(qū)操作，操作過(guò)程中避免交談 三、酸性異硫氰酸胍三、酸性異硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法w首先以含異硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細(xì)胞。w然后在pH4.0的條件下，酚/氯仿抽提細(xì)胞裂解溶液。w最后通過(guò)異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌而獲得總RNA。w本法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效及提取的RNA質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，能在3小時(shí)內(nèi)迅速處理多個(gè)標(biāo)本。w總RNA產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量，每mg組織大約能制備47g總RNA，每106個(gè)細(xì)胞大約為410g。 四、商品化的單相裂解試劑法分四、商品化的單相裂解試劑法分RNARNAw本法是異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改進(jìn)方案。w以異硫氰酸胍-酚的單相裂解液裂解細(xì)胞，再加入氯仿后形成兩相。w變性的DNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面，可使用乙醇和異丙醇分級(jí)沉淀出來(lái)。w保留于上層水相的RNA，