第五章-熒光分析法-scf

1、1本章學(xué)習(xí)目標(biāo)：本章學(xué)習(xí)目標(biāo)：1、掌握分子熒光分析法的基本原理和特點(diǎn)掌握分子熒光分析法的基本原理和特點(diǎn) 2、掌握熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系以及影響熒光強(qiáng)度掌握熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系以及影響熒光強(qiáng)度的因素的因素 3 、熟悉熒光定量分析方法及熒光分光光度計(jì)熟悉熒光定量分析方法及熒光分光光度計(jì) 4 、了解分子熒光分析法的應(yīng)用 第第0505章章 熒光分析法熒光分析法2 處于處于基態(tài)基態(tài)的分子吸收能量后，躍的分子吸收能量后，躍遷到遷到激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以發(fā)射，當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以發(fā)射光的形式釋放能量，返回光的形式釋放能量，返回基態(tài)的過(guò)基態(tài)的過(guò)程程，稱為，稱為分子發(fā)光分子發(fā)光。 一、什么是分子發(fā)光？一、什么是分

2、子發(fā)光？ 分子熒光分析法分子熒光分析法3 二、分子發(fā)光的分類二、分子發(fā)光的分類(按激發(fā)的模式按激發(fā)的模式 )分分子子發(fā)發(fā)光光熱致發(fā)光熱致發(fā)光光致發(fā)光光致發(fā)光場(chǎng)致發(fā)光場(chǎng)致發(fā)光化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光熒光熒光磷光磷光 分子熒光分析法分子熒光分析法4 分子熒光分析法分子熒光分析法優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；選擇性好；試樣用量少；方法簡(jiǎn)單。光致發(fā)光光致發(fā)光：物質(zhì)分子吸收電磁輻射能后，將從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子發(fā)射出光的現(xiàn)象，稱為光致發(fā)光。最常見形式是熒光和磷光熒光和磷光。熒光分析法：熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光光譜的特征及強(qiáng)度對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法，稱之為熒光分析法。5第一節(jié)第一節(jié) 分子熒光分析法

3、的基本原理分子熒光分析法的基本原理（重點(diǎn)）（重點(diǎn)）一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生單重態(tài)（單重態(tài)（S）：）：s=0，M=1，分子所處的電子能態(tài)。分子所處的電子能態(tài)。三重態(tài)（三重態(tài)（T）：）：s=1，M=3，分子所處的電子能態(tài)。分子所處的電子能態(tài)。1.1.分子的電子能級(jí)和激發(fā)過(guò)程分子的電子能級(jí)和激發(fā)過(guò)程12 sM分子電子能級(jí)的多重性：分子電子能級(jí)的多重性：iss總自旋量子數(shù)：總自旋量子數(shù)：E自旋量子數(shù)：自旋量子數(shù)：s = 或或- 泡利不相容原理泡利不相容原理62.熒光的產(chǎn)生熒光的產(chǎn)生 在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為1010-8-8s

4、s，而三重態(tài)分子具有順磁三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4 1s以上（通常用（通常用S S和和T T分別表示分別表示單重態(tài)單重態(tài)和和三重態(tài)三重態(tài)）。）。 電子能級(jí)的電子能級(jí)的多重性：多重性：M=2s+1M=2s+1，s s（總自旋量子數(shù)）（總自旋量子數(shù)）7根據(jù)波茲曼分布，分子室溫基本處于電子能級(jí)的基態(tài)電子能級(jí)的基態(tài)，激發(fā)時(shí)，基態(tài)電子只能躍遷到激發(fā)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)，不能不能直接躍遷到激發(fā)三重態(tài)（激發(fā)三重態(tài)（根據(jù)自旋禁阻定律）。電子處于激發(fā)態(tài)（不穩(wěn)定狀態(tài)），可通過(guò)無(wú)輻射躍遷無(wú)輻射躍遷和輻輻射躍遷射躍遷(發(fā)光)等方式失去能量，返回基態(tài)。2.熒光的產(chǎn)生熒光的產(chǎn)生能量傳遞能量傳遞途徑途徑

5、輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光磷光磷光系間竄躍系間竄躍無(wú)輻射躍遷無(wú)輻射躍遷振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換8 在同一電子能級(jí)在同一電子能級(jí)中中，電子由電子由高高振動(dòng)振動(dòng)能級(jí)能級(jí)轉(zhuǎn)至低轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能振動(dòng)能級(jí)級(jí)，而將多余的能，而將多余的能量量以無(wú)輻射形式以無(wú)輻射形式放放出的過(guò)程。出的過(guò)程。（1）振動(dòng)弛豫）振動(dòng)弛豫無(wú)輻射方式傳遞途徑9 當(dāng)當(dāng)兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能級(jí)兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能級(jí)非常非常靠近靠近以至其振動(dòng)能級(jí)有以至其振動(dòng)能級(jí)有重疊重疊時(shí)，時(shí)，常發(fā)生電子由常發(fā)生電子由高高能級(jí)以能級(jí)以無(wú)輻射方式無(wú)輻射方式轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至低低能級(jí)的過(guò)程能級(jí)的過(guò)程。如右圖，處于高激發(fā)態(tài)（如右圖，處于高激發(fā)態(tài)（S2）的電

6、）的電子，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)移到低激發(fā)態(tài)子，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)移到低激發(fā)態(tài)（S1）的振動(dòng)能級(jí)。）的振動(dòng)能級(jí)。（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換）內(nèi)轉(zhuǎn)換10 激發(fā)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的激發(fā)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用而相互作用而失去能量失去能量，并以熱能的形式釋放能量的過(guò)程。外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光強(qiáng)度熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為。這一現(xiàn)象稱為“熄滅熄滅”或或“猝滅猝滅”。（3）外轉(zhuǎn)換）外轉(zhuǎn)換11 處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生發(fā)生自自旋反轉(zhuǎn)旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性多重性發(fā)生變化的過(guò)程。如圖，電子電子S S1 1的振動(dòng)能級(jí)同的振動(dòng)能級(jí)同T T1 1的振的振動(dòng)能級(jí)重疊，則可能動(dòng)能級(jí)重疊，則可能發(fā)生體

7、系間跨越S1T1 ，分子由激發(fā)單重態(tài)跨越到激發(fā)三重態(tài)，熒光強(qiáng)度減弱甚至熄滅。（4）系間竄躍）系間竄躍12 物質(zhì)分子吸收能量被激發(fā)后，從物質(zhì)分子吸收能量被激發(fā)后，從激發(fā)激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的的最低振動(dòng)能級(jí)最低振動(dòng)能級(jí)返回返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光光，稱為，稱為熒光熒光。注意：注意：無(wú)論電子開始被激發(fā)至哪一個(gè)激無(wú)論電子開始被激發(fā)至哪一個(gè)激發(fā)單重態(tài)，經(jīng)過(guò)發(fā)單重態(tài)，經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換，振動(dòng)弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換，均均可回到可回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后再以輻射形式發(fā)射光而返回至基態(tài)然后再以輻射形式發(fā)射光而返回至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)上。各振動(dòng)能級(jí)上。 熒光的產(chǎn)生在熒光的產(chǎn)生

8、在1010-7-7-10-10-9-9s內(nèi)完成。內(nèi)完成。 （1）發(fā)射熒光發(fā)射熒光輻射方式傳遞途徑13 電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，以振動(dòng)能級(jí)，以系間竄躍系間竄躍方式轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)，再經(jīng)三重，再經(jīng)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)返回至基態(tài)時(shí)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)返回至基態(tài)時(shí)發(fā)射的光，稱為發(fā)射的光，稱為磷光磷光。由于（由于（T1S0）這個(gè)躍遷過(guò)程）這個(gè)躍遷過(guò)程也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為較慢，約為10-4-10s。因此，這因此，這種躍遷所發(fā)射的光，種躍遷所發(fā)射的光，在光照停在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。

9、（2）發(fā)射磷光發(fā)射磷光14 熒光和磷光產(chǎn)生示意圖熒光和磷光產(chǎn)生示意圖S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間竄躍系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫15二、 激發(fā)光譜與熒光光譜激發(fā)光譜（激發(fā)光譜（excitation spectrum）：使使不同不同激發(fā)激發(fā)波長(zhǎng)波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光體，然后讓所產(chǎn)生的的入射光激發(fā)熒光體，然后讓所產(chǎn)生的熒光通過(guò)固熒光通過(guò)固定定發(fā)射發(fā)射波長(zhǎng)波長(zhǎng)的單色器而照到檢測(cè)器上，測(cè)定不同激的單色器而照到檢測(cè)器上，測(cè)定不同激發(fā)波長(zhǎng)光照射下熒光強(qiáng)度的變化，以發(fā)波長(zhǎng)光照射下熒光

10、強(qiáng)度的變化，以激發(fā)波長(zhǎng)為橫激發(fā)波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，可得熒光物質(zhì)的激發(fā)光，可得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。譜。注意：激發(fā)光譜與其吸收光譜極為相似，但激發(fā)光譜曲線是熒光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，吸收曲線則是吸光度與波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，兩者性質(zhì)是不同的。16二、 激發(fā)光譜與熒光光譜17 熒光光譜（熒光光譜（fluorecence spectrum）：固定激固定激發(fā)光波長(zhǎng)發(fā)光波長(zhǎng)（為最大激發(fā)波長(zhǎng)）和強(qiáng)度，而讓熒光物（為最大激發(fā)波長(zhǎng)）和強(qiáng)度，而讓熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光通過(guò)發(fā)射單色器分光掃描并檢測(cè)質(zhì)發(fā)射的熒光通過(guò)發(fā)射單色器分光掃描并檢測(cè)不同不同發(fā)射發(fā)射光波長(zhǎng)下光波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，以的熒光強(qiáng)度，

11、以發(fā)射波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)發(fā)射波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得到物質(zhì)的熒光光譜。，得到物質(zhì)的熒光光譜。 熒光物質(zhì)的熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)（最大激發(fā)波長(zhǎng)（l lex）和）和最大發(fā)射最大發(fā)射波長(zhǎng)（波長(zhǎng)（l lem）是鑒定物質(zhì)的根據(jù)；也是定量測(cè)定最是鑒定物質(zhì)的根據(jù)；也是定量測(cè)定最為靈敏的條件。為靈敏的條件。分子的激發(fā)光譜可能含有幾個(gè)激發(fā)帶，但發(fā)射光譜只含一個(gè)發(fā)射帶；分子的激發(fā)光譜可能含有幾個(gè)激發(fā)帶，但發(fā)射光譜只含一個(gè)發(fā)射帶；即使分子被激發(fā)到高于即使分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)，由于經(jīng)過(guò)極快的內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫降的電子態(tài)，由于經(jīng)過(guò)極快的內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫降到到S1電子態(tài)的最低振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能

12、級(jí)，然后以輻射形式釋放能量回到基態(tài)。電子態(tài)的最低振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)，然后以輻射形式釋放能量回到基態(tài)。200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l191.斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift):熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光譜波長(zhǎng)的現(xiàn)象。熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光譜波長(zhǎng)的現(xiàn)象。室溫下菲的乙醇溶液熒光光譜熒光光譜的特征熒光光譜的特征 （重點(diǎn)重點(diǎn)）202.2.熒光光譜與熒光光譜與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 電子躍遷到不

13、同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一電子第一電子激發(fā)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)的的最低最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，從振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，從而熒光發(fā)射光譜而熒光發(fā)射光譜只有一個(gè)發(fā)射帶只有一個(gè)發(fā)射帶，而且熒光光譜，而且熒光光譜的的形狀形狀與與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。3.3.熒光光譜與熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系激發(fā)光譜與熒光光譜成對(duì)稱鏡像關(guān)系。激發(fā)光譜與熒光光譜成對(duì)稱鏡像關(guān)系。nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激發(fā)光譜

14、（虛線）熒光光譜（實(shí)線）蒽的能級(jí)躍遷V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4E4E3E2E10S 1SE4E3E2E122（一）（一）分子產(chǎn)生熒光必須分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件具備兩個(gè)條件：三、熒光強(qiáng)度與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 分子必須具有與所照射的輻射頻率相分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的適應(yīng)的 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，才能，才能吸收吸收激發(fā)光；激發(fā)光； 吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率。23熒光效率（熒光效率（fluorescence efficie

15、ncy):指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的量子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的量子數(shù)之比，常用表示。2425 （重點(diǎn)重點(diǎn)）262728293031三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素1、溫度溫度2、溶劑溶劑：極性、粘度：極性、粘度3、酸度酸度：熒光物質(zhì)自身最適宜的：熒光物質(zhì)自身最適宜的pH范圍范圍4、熒光熄滅劑熒光熄滅劑：主要四種類型：主要四種類型5、散射光散射光：瑞利光、拉曼光：瑞利光、拉曼光32五、影響熒光強(qiáng)度的外部因素溫度降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度升高。1）溫度2）溶劑*躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)也發(fā)生紅移；溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度降低；溶劑應(yīng)達(dá)到足夠的純度。333）pH值值熒熒光

16、物質(zhì)都自身最適宜的光物質(zhì)都自身最適宜的pH范圍范圍NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+34熒光熒光淬淬滅（滅（熒光熄滅熒光熄滅）：熒光物質(zhì)分子與溶劑分）：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光淬滅。的現(xiàn)象稱為熒光淬滅。熒光熒光淬滅淬滅劑：能引起熒光熄滅的物質(zhì)。劑：能引起熒光熄滅的物質(zhì)。4)熒光淬滅熒光淬滅 碰撞碰撞淬淬滅滅 M+hvM*,M*+Q M+熱熱 靜態(tài)靜態(tài)淬淬滅滅 M+Q MQ 非熒光物質(zhì)非熒光物質(zhì) 轉(zhuǎn)入三重態(tài)的轉(zhuǎn)入三重態(tài)的淬淬滅滅 三重態(tài)，氧的作用三重態(tài)，氧的作用 熒光物質(zhì)的自熒光物質(zhì)的自淬淬滅滅

17、熒光物質(zhì)濃度較高熒光物質(zhì)濃度較高導(dǎo)致導(dǎo)致熒光淬滅熒光淬滅的的四種原因四種原因：35熒光淬淬滅法: 熒光物質(zhì)加入某種淬淬滅劑后，其熒光強(qiáng)度的減少與熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，可用于測(cè)定熄滅劑的含量，這種方法稱為熒光淬淬滅法。365)5)散射光散射光瑞利瑞利散射光散射光( (Rayleigh scattering light) )：光子與：光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，運(yùn)物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；動(dòng)方向改變；瑞利光瑞利光入射光入射光拉曼拉曼散射光散射光(Raman scattering light) ：光子與光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)生能量交換，運(yùn)物質(zhì)

18、分子發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)生能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；動(dòng)方向改變；拉曼光拉曼光入射光入射光消除方法消除方法：選擇：選擇適當(dāng)適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)320360448激發(fā)激發(fā) 320nm硫酸奎寧硫酸奎寧350448激發(fā)激發(fā) 350nm硫酸奎寧硫酸奎寧320360激發(fā)激發(fā) 320nm0.1mol/L硫酸硫酸350400激發(fā)激發(fā) 350nm0.1mol/L硫酸硫酸a.強(qiáng)度強(qiáng)度b.強(qiáng)度強(qiáng)度硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光（硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光（a）與拉曼光譜（）與拉曼光譜（b）382 2、定量方法定量方法 1 1、定量依據(jù)定量依據(jù) 第二節(jié)第二節(jié) 熒光定量分析方法熒光定量分析方法39 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 1.靈

19、敏度高靈敏度高 比紫外比紫外-可見分光光度法高可見分光光度法高24個(gè)數(shù)量級(jí)；個(gè)數(shù)量級(jí)； 檢測(cè)下限：檢測(cè)下限：0.10.001 g/mL 2.選擇性強(qiáng)選擇性強(qiáng) 既可依據(jù)發(fā)射光譜特征，又可根據(jù)激發(fā)光譜特征；既可依據(jù)發(fā)射光譜特征，又可根據(jù)激發(fā)光譜特征； 3.試樣量少和方法簡(jiǎn)單試樣量少和方法簡(jiǎn)單 缺點(diǎn)缺點(diǎn)應(yīng)用范圍小應(yīng)用范圍小401 1、定量依據(jù)定量依據(jù) 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 If 正比于正比于吸收的光強(qiáng)度吸收的光強(qiáng)度 Ia 和熒和熒光量子產(chǎn)率光量子產(chǎn)率 ：faII 001 10bCatIIII由朗伯由朗伯- -比耳定律得：比耳定律得：2.303001 101bCbCfIIIe 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 If ：4

20、1對(duì)于稀溶液，當(dāng)對(duì)于稀溶液，當(dāng) 2.303 bC 0.05時(shí)：時(shí)：02.303ffIIbC If -熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度I0 -入射光強(qiáng)度入射光強(qiáng)度f(wàn) -熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率b - 吸收光程吸收光程 - 摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)C - 物質(zhì)濃度物質(zhì)濃度f(wàn)IKC422 2、定量方法定量方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法：FCsFxCx43直接比較法直接比較法XSFXFFSFCCIIII)0()()0()(注意：樣品與標(biāo)樣溶液濃度接近，在線性范圍內(nèi)注意：樣品與標(biāo)樣溶液濃度接近，在線性范圍內(nèi)步驟：步驟：1.1.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液2.2.測(cè)測(cè)I IF F3.3.求濃度求濃度44v對(duì)

21、于熒光法對(duì)于熒光法 F = 2.3k I0EClF I0， I0 增強(qiáng)，增強(qiáng)，F(xiàn)增大；低濃度時(shí)，增大；低濃度時(shí)，F(xiàn) C只要檢測(cè)器靈敏，可檢測(cè)微弱信號(hào)。只要檢測(cè)器靈敏，可檢測(cè)微弱信號(hào)。v對(duì)于分光光度法對(duì)于分光光度法 A = -lgT = EClC極小時(shí)，極小時(shí)，A0，無(wú)吸收；，無(wú)吸收；若若C不變，改變?nèi)肷涔獠蛔儯淖內(nèi)肷涔釯0強(qiáng)度，強(qiáng)度，A無(wú)變化。無(wú)變化。所以吸收光譜受一定限制，靈敏度小于熒光光譜。所以吸收光譜受一定限制，靈敏度小于熒光光譜。為什么熒光分析法比紫外可見法更靈敏？為什么熒光分析法比紫外可見法更靈敏？45 用于測(cè)量熒光的儀器由激發(fā)光源、樣品池、用于選擇激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光熒光波長(zhǎng)的單色器

22、以及檢測(cè)器四部分組成。 由光源發(fā)射的光經(jīng)第一單色器得到所需的激發(fā)光波長(zhǎng)，通過(guò)樣品池后，一部分光能被熒光物質(zhì)所吸收，熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)射熒光。 第三節(jié)第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì) 46問(wèn)題：?jiǎn)栴}：熒光分光光度熒光分光光度計(jì)與紫外計(jì)與紫外-可見分光光可見分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？度計(jì)有何異同點(diǎn)？47484950紫外紫外-可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)測(cè)量池測(cè)量池(吸收池吸收池)I0ItI0ItIF,p51在測(cè)量分子熒光強(qiáng)度時(shí)，要在與入射光成直角的方在測(cè)量分子熒光強(qiáng)度時(shí)，要在與入射光成直角的方向上進(jìn)行測(cè)量，這是由于（向上進(jìn)行測(cè)量，這是由于（ ）A. 只有在入射光線成直角的方向上才有熒光只有在入射

23、光線成直角的方向上才有熒光B. 熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度小熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度小C. 熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度大熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度大D. 熒光波長(zhǎng)比透射光波長(zhǎng)長(zhǎng)熒光波長(zhǎng)比透射光波長(zhǎng)長(zhǎng)E. 熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的，為了減小透射光的影響熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的，為了減小透射光的影響熒光分光光度計(jì)常使用的光源是（熒光分光光度計(jì)常使用的光源是（ ）A. 空心陰極燈空心陰極燈 B. 氙燈氙燈 C. 氫燈氫燈 D. 硅碳棒硅碳棒BE52儀器的校正（1）靈敏度的校正）靈敏度的校正 一定濃度的穩(wěn)定熒光物質(zhì)作對(duì)照品溶液調(diào)儀器一定濃度的穩(wěn)定熒光物質(zhì)作對(duì)照品溶液調(diào)儀器（如（如1ug/ml硫酸奎寧）硫酸奎寧）（2）波長(zhǎng)校正）

24、波長(zhǎng)校正 汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線（3）激發(fā)光譜和熒光光譜的校正）激發(fā)光譜和熒光光譜的校正 光源強(qiáng)度、檢測(cè)器的感應(yīng)度光源強(qiáng)度、檢測(cè)器的感應(yīng)度53熒光分析法的應(yīng)用（1）無(wú)機(jī)化合物的分析）無(wú)機(jī)化合物的分析v采用有機(jī)試劑進(jìn)行熒光分析的元素已近采用有機(jī)試劑進(jìn)行熒光分析的元素已近70多種多種v能夠與金屬離子形成熒光絡(luò)合物的能夠與金屬離子形成熒光絡(luò)合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物是芳香族化合物。（分子剛性平面結(jié)構(gòu)增大）。（分子剛性平面結(jié)構(gòu)增大）v另一類絡(luò)合物是三元離子締合物。另一類絡(luò)合物是三元離子締合物。例：羅丹明例：羅丹明B為陽(yáng)離子熒光染料，為陽(yáng)離子熒光染料，Au3+、Ga3+、

25、Tl3+等等陽(yáng)離子首先與鹵素離子形成二元絡(luò)陰離子，再與羅丹陽(yáng)離子首先與鹵素離子形成二元絡(luò)陰離子，再與羅丹明明B締合形成熒光化合物。締合形成熒光化合物。v熒光猝滅法熒光猝滅法也是常采用的方法。也是常采用的方法。54v脂肪族有機(jī)化合物本身能發(fā)熒光的很少，需要與某脂肪族有機(jī)化合物本身能發(fā)熒光的很少，需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析v芳香族化合物芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光，可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)具有致癌活性的生熒光，可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)具有致癌活性的多環(huán)芳烴，熒光分析法已成為最主要的測(cè)定方法。多環(huán)芳烴，熒光分析法已成為最主要的測(cè)定方法。v在生物化學(xué)分析、生理醫(yī)學(xué)研究和臨床、藥物分析在生物化學(xué)分析、生理醫(yī)學(xué)研究和臨床、藥物分析領(lǐng)域，許多重要的分析對(duì)象，如領(lǐng)域，許多重要的分析對(duì)象，如維生素、氨基酸和維生素、氨基酸和蛋白質(zhì)、胺類、甾族化合物、酶和輔酶蛋白質(zhì)、胺類、甾族化合物、酶和輔酶等，均可用等，均可用熒光法分析。熒光法分析。（2）有機(jī)化合物的分析）有機(jī)化合物的分析55熒光分析新技術(shù)簡(jiǎn)介1. 激光熒光分析激光熒光分析激光作光源；超低濃度分析激光作光源；超低濃度分析2. 時(shí)間分辯熒光分析時(shí)間分辯熒光分析利用不同物質(zhì)的熒