細(xì)胞培養(yǎng)與病毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟

1、實(shí)驗(yàn)二傳代細(xì)胞培養(yǎng)及病毒在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獾怪蔑@微鏡的構(gòu)造及使用，了解不同傳代細(xì)胞的形態(tài)及接毒后的 病變特征，掌握細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法、病毒接種方法及收毒方法。二、常用細(xì)胞的種類BHK-21：倉鼠腎傳代細(xì)胞PK-15：豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2：豬腎傳代細(xì)胞Hela：人的子宮瘤細(xì)胞Vero：非洲綠猴腎細(xì)胞Marc-145：來源于Vero細(xì)胞TK-143：人的胸背激酶陰性細(xì)胞Sf9：昆蟲細(xì)胞三、材料1、100ml細(xì)胞瓶、吸管、吸球、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭2、BHK-21 (baby hamster kidney)細(xì)胞3、0.25%胰酶 4、生長液：含10與犢牛血清、200U/

2、ml青、鏈霉素的DMEM維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM5、偽狂犬病病毒液（PRV）四、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1）細(xì)胞密度：2-3X105個(gè)/ml2） pH 范圍 最適 PH7. 0-7. 4,耐受 PH6. 6-7. 83）培養(yǎng)溫度哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般為37昆蟲細(xì)胞28-30五、常用細(xì)胞分散劑及作用原理1、胰酶 使精氨酸或賴氨酸的廢基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā) 生水解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個(gè)細(xì)胞。2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：及二價(jià)鈣、鎂離子結(jié)合，從而使細(xì)胞分 散。3、灰色鏈絲菌酶：由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑，是蛋白酶、氨肽酶

3、和峻肽酶的混合物。六、營養(yǎng)液1、人工綜合營養(yǎng)液氨基酸、糖類、無機(jī)鹽類、維生素、輔酶、喋吟、喀咤、輔助生長因子。2、血清1）血清的種類胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、 羊血清、人血清，其中以新生犢牛血清使用最為廣泛。2）血清的處理無菌采集，過濾除菌。用前56c滅活30min。3）血清的作用A、能提供細(xì)胞生存、生長和增生所必須的生長調(diào)節(jié)因子。B、能補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。C、含有一些可供貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長基質(zhì) 成分。D、有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的作用。E、給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)。F、提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞釋

4、放的蛋白酶的損害。4）應(yīng)用血清存在的問題A、血清中存在不少有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)：補(bǔ)體、免疫球蛋白、 生長抑制因子。B、血清的成分不明確，影響對(duì)結(jié)果的分析。C、不同動(dòng)物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn) 定。七、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)1、優(yōu)點(diǎn)：1）可以無限的傳代。2）不少細(xì)胞系對(duì)病毒很敏感。3）某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的 大量生產(chǎn)。4）生長旺盛，繁殖快速，對(duì)營養(yǎng)條件不苛刻。2、缺點(diǎn)：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。3、培養(yǎng)方法1）取長滿單層的細(xì)胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。2）加入2ml胰酶消化液，于37c培養(yǎng)箱放置兒分鐘，至細(xì)胞間出現(xiàn)空隙 或細(xì)胞變圓后，倒去

5、消化液。3）加入生長液，反復(fù)吹打兒次，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，然后分裝于3個(gè) 小瓶中。再在每個(gè)小瓶中補(bǔ)充生長液至10ml,然后置37c培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 培養(yǎng)1-2天即可長成單層。八、病毒（PRV）在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)1、選長滿單層的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液。2、加入適量的病毒懸液3、置溫箱中感作（吸附）45min-lho4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養(yǎng)液，補(bǔ)足維持液，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)， 直至80%以上的細(xì)胞病變。5、收毒：將病變的細(xì)胞置于-20冰箱中，凍結(jié)后取出自然解凍，在解凍 過程中振搖兒次，以使細(xì)胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水 瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。實(shí)驗(yàn)三、原代細(xì)胞培養(yǎng)（以雞胚成纖維細(xì)胞

6、為例）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠煌?xì)胞的形態(tài)，掌握雞胚成纖維細(xì)胞的制備及培養(yǎng)方法。二、材料1、9-11日齡雞胚2、照蛋燈及蛋座3、碘酊棉球及酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小鑲子5、平皿、細(xì)菌瓶、吸管、吸球、細(xì)胞瓶、6、胰酶、生長液、維持液三、細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1）細(xì)胞密度原代細(xì)胞：4-6X105個(gè)/ml傳代細(xì)胞：2-3義1。5個(gè)/ml2） pH 范圍 最適 PH7. 0-7. 4,耐受 pH6. 6-7. 83）培養(yǎng)溫度哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般為37昆蟲細(xì)胞28-30 四、操作步驟1、取9T2 口齡孵育良好的雞胚，依次用碘酊和酒精消毒氣室部。2、無菌操作下用剪子去除氣室部卵殼，去除殼膜，穿破絨毛尿囊膜，夾

7、住雞胚頸部，取出雞胚放于滅菌平皿中。3、用眼科剪、鑲?cè)コu胚頭、四肢及內(nèi)臟，用DMEM沖冼2次。4、將沖洗后的雞胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜狀。5、將剪碎的組織塊倒入錐形瓶或燒杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分沖洗, 并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加DMEM。如此反復(fù) 沖洗2-3遍。6、于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0.25%胰酶，并調(diào)pH至7. 6-7. 8,振 蕩混勻后置37水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動(dòng)一次，使細(xì) 胞消化完全（組織塊變散松，沉降漸變緩慢時(shí)即表示消化足夠）。7、取出，靜置兒分鐘，小心吸棄上層胰酶溶液，用DMEM輕洗2次后，加 入生長液5ml,用大口徑吸管

8、反復(fù)吹打，使細(xì)胞游離。8、靜置兒分鐘，使未消化好的組織塊下沉。9、細(xì)胞計(jì)數(shù)取細(xì)胞懸液0.5ml+2ml0. 1%結(jié)晶紫一枸椽酸（0. Imol/L）溶液,室溫 或37c溫箱中5Tomin,充分振蕩后進(jìn)行計(jì)數(shù)。按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算4角4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)（N）。每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)（n） =N/4X 10000XK （稀釋倍數(shù)）?；罴?xì)胞數(shù)應(yīng)在90%以上。10、將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞稀釋到合適的濃度，使細(xì)胞量約為4-6X10$個(gè)/ml, 分層于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶1ml,再補(bǔ)加DMEM生長液至10ml,蓋上 蓋子，置于37c恒溫箱中培養(yǎng)。表示可計(jì)數(shù)表示不計(jì)數(shù)15 / 18五、結(jié)果的觀察于培養(yǎng)后每天觀察結(jié)果，

9、至長層單層。細(xì)胞量較大時(shí)，一天即可長成 單層，細(xì)胞呈纖維狀。實(shí)驗(yàn)四病毒感染力的滴定(TCIDw的測(cè)定)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠《靖腥玖y(cè)定的幾種常用方法，掌握半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID5。的操作步驟、計(jì)算方法及含義。二、測(cè)定病毒感染力的方法半數(shù)致死量LD5o( 50% lethal dose)：用動(dòng)物或雞胚來檢測(cè)半數(shù)雞胚感染量EIDso(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測(cè)半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量 TCIDso (50% tissue culture infective dose)： 用細(xì)胞來檢測(cè)蝕斑形成單位(plaque forming unit, PFU)：用細(xì)胞來檢測(cè) 三

10、、材料1、長滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液(PRV)四、TCID”的操作步驟1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔,每孔接種100小3、在每孔加入細(xì)胞懸液100同，使細(xì)胞量達(dá)到23X IO,個(gè)/ml。4、設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排。(100M生長液+100M細(xì)胞懸液)5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。6、結(jié)果的計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法五、TCID5。的計(jì)算方法CPE：細(xì)胞病變效應(yīng)1、Reed-Muen

11、ch 兩氏法病毒液稀釋 度出現(xiàn)CPE 孔數(shù)無CPE孔 數(shù)累計(jì)出現(xiàn)CPE孔 所占的外CPE孔數(shù)無CPE孔 數(shù)10-180270100 (27/27)10-28 -0190100 (19/19)10-37111191.6 (11/12)ICT354640 (4/10)ICT171130.7 (1/14)1040S0210 (0/21)CPE： Cytopathic effect距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%) / (高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))=(91. 6-50) / (91.6-40)= 0.8IgTCIDs產(chǎn)距離比例X稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50與病變率

12、的稀釋度的對(duì) 數(shù)=0. 8X (-1) + (-3)=-3.8TCID5o=1O-3 70. 1ml含義：將該病毒稀釋1()3 8接種100M可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。2、 Karber 法病毒液稀釋出現(xiàn)CPE的孔出現(xiàn)CPE孔的比度數(shù)率10"88/8=110-288/8=110-377/8=0. 87510"33/8=0. 37510-511/8=0. 12510-600/8=0lgTCID5o=L-d(s-0. 5)L：最高稀釋度的對(duì)數(shù)D：稀釋度對(duì)數(shù)之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID5o=-l-lX (3. 375-0. 5)=-3. 875TCID50=10-3 8

13、75/0. 1ml含義：將該病毒稀釋1()3 *5接種100同可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。實(shí)驗(yàn)五血清中和試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵泻驮囼?yàn)的基本原理和兒種不同的測(cè)定方法，掌握固定病毒一稀 釋血清法的操作步驟和計(jì)算方法及含義。二、原理抗體及相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使病毒的感染力喪失。三、用途1、疾病診斷2、病毒分離株的鑒定3、不同病毒株的抗原關(guān)系研究4、疫苗免疫原性的評(píng)價(jià)5、免疫血清的質(zhì)量評(píng)價(jià)6、測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中是否存在抗體四、分類 （一）蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗(yàn)將病毒一正常血清混合物以及病毒一待檢血清混合物分別接種到單 層細(xì)胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進(jìn)行蝕斑測(cè)定，比較病毒一 正常血清組和病

14、毒一待檢血清組產(chǎn)生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清 的中和能力。以試驗(yàn)組的蝕斑數(shù)比對(duì)照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是 其蝕斑減數(shù)試驗(yàn)效價(jià)。（二）交叉保護(hù)試驗(yàn)先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫，然后以待檢病毒進(jìn)行攻擊， 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被保護(hù)的情況，判定待檢V的種類或型別。這一方法的缺點(diǎn) 是試驗(yàn)周期太長，并且需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。可用于以下幾方面：應(yīng)用已 知V鑒定未知V ；應(yīng)用已知免疫血清鑒定未知V：應(yīng)用已知V鑒定未知血 清。（三）終點(diǎn)法中和試驗(yàn)1、固定病毒一稀釋血清法將不同稀釋度的血清及固定量的病毒液（一般為100或200個(gè)TCID50. EID”或LDG混合，置適當(dāng)?shù)臈l件下感作一定時(shí)間，

15、再將血清-病毒混合物接種于敏感細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，測(cè)定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞 胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物發(fā)生病毒感染的能力及其效價(jià)。以能保護(hù)50%組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物不發(fā)生病變、感染或死 亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50%中和效價(jià)（PDG。2、固定血清稀釋病毒法在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對(duì)照非免疫血清 （對(duì)照組）和待檢血清同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每一組的TCIDw、EID必或LDm, 然后計(jì)算中和指數(shù)。五、材料1、長滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）6、待檢血清、PRV陽性對(duì)照血清、PRV陰性對(duì)照血清六、操

16、作步驟 1、固定病毒一稀釋血清法1）測(cè)定病毒液的TCID% 2）將測(cè)好TCID5。的病毒液稀釋成200個(gè)TCID5。的病毒懸液。3）在96孔微量培養(yǎng)板中將血清（預(yù)先56滅活30min）作連續(xù)倍比稀釋 （具體方法是在96孔板中先加入50Al生長液，再加5014待檢血清，混勻后，吸50耳至下一孔，如此下去。一直到1： 256）,每個(gè)稀釋度 作4孔。4）在上述各孔內(nèi)加入50目稀釋好的病毒液，混勻后放入37 5就0二培養(yǎng) 箱中作用45min-60mino5）同時(shí)設(shè)待檢血清毒性對(duì)照，陰、陽性血清對(duì)照，病毒對(duì)照和正常細(xì)胞 對(duì)照，其中病毒對(duì)照要作200個(gè)TCIDso、20個(gè)TCID50、2個(gè)TCID”、0.

17、2 個(gè)TCID50 4個(gè)不同濃度的對(duì)照。6）感作完成后每孔加入100閔細(xì)胞懸液，放37c 5%C0二培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐 口觀察并記錄結(jié)果，一般要觀察5-7天。7）結(jié)果計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進(jìn)行。累計(jì)血清稀釋度CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)保護(hù)率%1 ： 2 (1O-0 3)04015100 (15/15)1 ： 4 (10一° 6)04011100 (11/11)1 ： 8 (W0 9 )131787.5 (7/8)1 ： 16 (1()72)132466. 7 (4/6)1 ： 32 (10-15)315116. 7 (1/6 )1 : 64

18、 (10-l s)40900 (0/9)1 ： 128 (10-21)401300 (0/13)1 ： 256 (IO"')401700 (0/17)lgPD50=高于50%的保護(hù)率的血清稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋度對(duì)數(shù)的差=-1.2+033X(-03)=-1.299距離比例=（高于50%的保護(hù)率-50% ） /（高于50%的保護(hù)率一低于50%的保護(hù)率） =（66.7-50） / （66.7-16.7） 一八 QQDncn-_i odd 口片涮了一八 nc-1 /on即1 ： 20稀釋的待檢血清可保護(hù)50生的組織培養(yǎng)細(xì)胞免于出現(xiàn)CPE。2、固定血清一一稀釋病毒法1）將病毒作連續(xù)10倍稀釋2）將稀釋好的病毒接種96孔板，每個(gè)稀釋度接種一縱排