EMSA試劑盒使用方法介紹

1、基因結(jié)構(gòu)和功能系列CAT#:131039-100低溫運(yùn)輸，-20保存即用型EMSA試劑盒Electrophoretic Mobility Shift Assay Kit使用手冊(cè)V1.0產(chǎn)品及特點(diǎn)凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay），也稱gel shift，是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通過EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的結(jié)合情況，從而可以研究細(xì)胞內(nèi)一些轉(zhuǎn)錄因子的

2、激活水平。其原理如下：本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：1. 一站式，使用方便，本試劑盒提供了進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)的探針標(biāo)記、蛋白和DNA結(jié)合以及EMSA上樣液等主要試劑，使EMSA實(shí)驗(yàn)變得簡(jiǎn)單方便。2. 非特異性結(jié)合低，EMSA結(jié)合緩沖液中含有poly(dI-dC)等有效成分，其中poly(dI-dC)的濃度經(jīng)過優(yōu)化，可以很好的消除蛋白和標(biāo)記探針間的非特異性結(jié)合，同時(shí)又不會(huì)減弱目的轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)記探針間的結(jié)合。3. 用戶需自備待標(biāo)記的EMSA探針、用于探針標(biāo)記的同位素、EMSA膠配制的相關(guān)試劑。4. 本試劑盒足夠標(biāo)記10-20次探針，足夠進(jìn)行100個(gè)蛋白和探針的結(jié)合反應(yīng)。 規(guī)格及成分成 份編號(hào)100次包裝T4

3、Polynucleotide Kinase131039A100 UT4 Polynucleotide KinaseBuffer(10×)131039B100 LNuclease-Free Water131039C1 mL探針標(biāo)記終止液131039D100 L5M 醋酸銨131039E600 LEMSA結(jié)合緩沖液(5×)131039F200 LEMSA上樣液(藍(lán)色，10×)131039G200 LEMSA上樣液(無色，10×)131039H200 LTE溶液131039I2 mL使用手冊(cè)1份運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸，-20保存，有效期一年。自備試劑待標(biāo)記的EMS

4、A探針、用于探針標(biāo)記的同位素、EMSA膠配制的相關(guān)試劑等使用方法一、探針的標(biāo)記：1. 探針標(biāo)記的反應(yīng)體系如下：成 份用量待標(biāo)記探針(1.75pmol/L)2 LT4 Polynucleotide Kinase Buffer(10×)1 LNuclease-Free Water5 L-32PATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/mL)1 LT4 Polynucleotide Kinase(5-10u/L)1 L總體積10 L按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。2. 37反應(yīng)10分鐘

5、。3. 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。4. 再加入89微升TE，混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo)記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。5. 標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20。二、 探針的純化：通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如下步驟操作：1. 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積（即25微升)的5M醋酸銨，再加入2倍體積（即200微升）的無水乙醇，混勻。

6、2. 在-70至-80沉淀1小時(shí)，或在-20沉淀過夜。3. 在4，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉淀。4. 在4，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20。三、 EMSA膠的配制1. 準(zhǔn)備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞?。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。2. 按照如下配方配制20毫

7、升4的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大)。成 份用量TBE buffer(10×)1 mL重蒸水16.2 mL39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)2 mL80% 甘油625 L10% 過硫酸銨(ammonium persulfate)150 LTEMED10 L3. 按照上述次序加入各個(gè)溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡，并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。四、 EMSA結(jié)合反應(yīng)：1. 按照下表加入EMS

8、A結(jié)合反應(yīng)各成分：成 份陰性對(duì)照樣品探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)Super-shift反應(yīng)Nuclease-Free Water7 L5 L4 L4 L4 LEMSA結(jié)合緩沖液(5×)2 L2 L2 L2 L2 L細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子02 L2 L2 L2 L未標(biāo)記的探針-1 L-未標(biāo)記的突變探針-1 L-目的蛋白特異抗體-1 L標(biāo)記好的探針1 L1 L1 L1 L1 L總體積10 L10 L10 L10 L10 L2. 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫（20-25）放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或讓冷探針優(yōu)先

9、反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25)放置20分鐘。3. 加入1微升EMSA上樣緩沖液(無色，10×)，混勻后立即上樣。注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合，建議盡量使用無色的EMSA上樣緩沖液。如果對(duì)于使用無色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。五、電泳分析1. 用0.5×TBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1×的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。2. 把混合了上樣緩沖液的樣品加

10、入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1×的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。3. 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA上樣緩沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。4. 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。5. 在干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。六、結(jié)果分析上圖為典型的EMSA分析圖，各上樣孔介紹如下：1. 為陰性對(duì)照反應(yīng)(標(biāo)記探針)；2. 為常規(guī)反應(yīng)(含激活的