免疫組化總結(jié)

1、第1章 緒論組織化學(xué)（histochemistry）也稱細(xì)胞化學(xué)(cytochemistry),是運(yùn)用物理學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等原理與技術(shù)，對(duì)組織與細(xì)胞的化學(xué)成分或酶活性進(jìn)行定性、定位和定量研究的科學(xué)。第1節(jié) 組織化學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)掃描隧道顯微鏡 原理：掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope，STM） 由Binnig等1981年發(fā)明，根據(jù)量子力學(xué)原理中的隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)。當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間產(chǎn)生隧道效應(yīng)而有電子逸出，形成隧道電流。 特點(diǎn)：掃描隧道顯微鏡的分辨率很高，橫向?yàn)?/p>

2、0.10.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。它的優(yōu)點(diǎn)是三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察，而普通電鏡只能觀察制作好的固體標(biāo)本。 應(yīng)用：利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等分子的原子布陣，和某些生物結(jié)構(gòu)，如生物膜、細(xì)胞壁等的原子排列。使放大倍數(shù)可達(dá)數(shù)千萬(wàn)倍。第3節(jié) 組織化學(xué)技術(shù)基本要求一、組織化學(xué)的分支和分類:目前組織化學(xué)從細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子三個(gè)水平，從定性、定位和定量三個(gè)層次，利用物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)原理，揭示著組織和細(xì)胞的化學(xué)本質(zhì)。根據(jù)顯示原理，組織化學(xué)技術(shù)大致可分為以下幾種類型：化學(xué)方法：根據(jù)化學(xué)反應(yīng)原理。在組織切片上生成沉淀以表示其定性定位的存在

3、。絕大部分的組織化學(xué)方法都屬于此類。如磷酸酶等。類化學(xué)方法：如Best胭脂紅顯示糖原；Mayer姻脂紅顯示糖蛋白。雖然染色反應(yīng)有特異性，但機(jī)制尚未完全闡明。物理學(xué)方法：熒光分析法、組織吸收光譜法、X射線顯微分析法、放射自顯影技術(shù)、圖像分析、電鏡細(xì)胞化學(xué)、能譜分析等。顯微燒灰法：對(duì)組織中無(wú)機(jī)物質(zhì)和微量元素的測(cè)定。免疫學(xué)方法：利用免疫學(xué)原理與其技術(shù)研究細(xì)胞的化學(xué)成分。如免疫組織化學(xué)、免疫電鏡等。分子生物學(xué)法：原位雜交組織化學(xué)技術(shù)等。2、 組織化學(xué)技術(shù)的基本要求 :1保持良好的組織和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，保持組織和細(xì)胞生前的化學(xué)成分和酶的活性，防止組織自溶，使反應(yīng)的產(chǎn)物不易位、不彌散，保證反應(yīng)產(chǎn)物定位精確。

4、2反應(yīng)產(chǎn)物具有可視性，即反應(yīng)產(chǎn)物必須呈現(xiàn)顏色，而且必須是有色沉淀，顆粒微細(xì)，不被溶解，定位于原位。反應(yīng)產(chǎn)物具有定量的可能性，即反應(yīng)物沉淀的顏色深度與相應(yīng)物質(zhì)含量或酶的活性具有一定的量效關(guān)系3所用組織化學(xué)方法必須具備一定的特異性，即僅與某種化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)，以便獲取正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。倘若組織化學(xué)試劑同時(shí)能與二種以上物質(zhì)反應(yīng)，則必須有進(jìn)一步的分析方法。此外還要具備一定的靈敏性，以便含量極微的物質(zhì)也能被顯示出來(lái)。4所用方法穩(wěn)定并能重復(fù)，以利于重復(fù)觀察和驗(yàn)證。5設(shè)置必要的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，否則難以判斷其結(jié)果的可靠性。第2章 組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)染色樣品制備第一節(jié) 取材一、組織標(biāo)本取材:準(zhǔn)確、快速。達(dá)到保持生活

5、狀態(tài)下組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性、盡量保持其化學(xué)成分和酶的活性，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損。動(dòng)物取材時(shí)應(yīng)先將動(dòng)物麻醉再處死，其方法如下：1.乙醚吸入麻醉法 2戊巴比妥鈉和烏拉坦麻醉法 3空氣栓塞法細(xì)胞標(biāo)本的取材:（一）培養(yǎng)細(xì)胞1貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞 2懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞 制備細(xì)胞懸液，加入離心涂片機(jī)內(nèi)，1000r/min離心2min，細(xì)胞即可均勻分布于已涂黏附劑的載玻片上。3. 印片法 主要應(yīng)用于活組織標(biāo)本檢查和剖檢標(biāo)本取材。新鮮標(biāo)本做一剖面，充分暴露病變區(qū)，將載玻片輕輕壓于病變區(qū)，脫落的細(xì)胞便粘附在玻片上。隨后立即將載玻片浸入細(xì)胞固定液內(nèi) 510min ，取出后自然干燥，低溫保存?zhèn)溆?。其?yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便省

6、時(shí)，細(xì)胞抗原保存較好；缺點(diǎn)是細(xì)胞分布不均勻，玻片上細(xì)胞有重疊，影響觀察效果。(二)涂片法臨床穿刺獲取含有細(xì)胞的液體（腹水，胸水和心包液）或氣管等分泌物可直接涂片，如果液體太多，可離心。制成細(xì)胞懸液。第2節(jié) 固定（fixation）的目的是用人為的方法盡可能使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分保持生活狀態(tài)，防止組織細(xì)胞死后發(fā)生自溶和組織腐敗。固定還能增加組織塊硬度，使其更容易切片，使不同的結(jié)構(gòu)更容易染色。一、組織和細(xì)胞的固定方法固定方法有物理固定和化學(xué)固定兩類，物理固定可采用空氣干燥（血涂片）、驟冷（在液氮中迅速冷凍）或微波固定等；化學(xué)固定有浸潤(rùn)法(immersion method)和灌流法（perf

7、usion method）。（一）浸潤(rùn)法 :浸潤(rùn)法是組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)常用的固定方法，一次要處理許多組織樣品時(shí)也多用此法。預(yù)先需估計(jì)固定劑的用量，并在取材前配好固定液。固定液的用量應(yīng)是樣品的40倍，以保證組織充分固定。固定時(shí)間可根據(jù)所選固定液和組織類型而定。若進(jìn)行酶組織化學(xué)染色，應(yīng)在4短時(shí)間固定，固定時(shí)間長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致酶活性減弱，甚至消失。（二）灌流固定法 :此法是經(jīng)血管途徑，將固定液灌注到欲固定的器官內(nèi)，使生活的細(xì)胞在原位及時(shí)迅速固定，取下組織之后再浸入相同的固定液內(nèi)繼續(xù)固定。灌流固定時(shí)大動(dòng)物多采用輸液方式，小動(dòng)物多采用心臟主動(dòng)脈灌流，如大、小鼠。在灌注固定液前，先用含抗凝劑的37 生理鹽水灌

8、流，沖洗血管內(nèi)的血液，防止血液凝固阻塞血管。肝臟由鮮紅顏色變?yōu)闇\白色時(shí)，即可灌流固定液，灌注速度為5 -10ml/min，應(yīng)在30min內(nèi)結(jié)束灌注并取材，而后將組織浸入相同的固定液中13小時(shí)。灌流固定對(duì)組織結(jié)構(gòu)和酶活性保存較好。 2、 常用固定劑和固定方法（一）組織常用固定劑和固定方法1甲醛 是常用的醛類固定劑 .其特點(diǎn)是組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，穿透性強(qiáng)，組織收縮少。（1）10% 中性緩沖福爾馬林 （2） 4% 多聚甲醛磷酸緩沖液 2. 丙酮 3. 醇類 4.混合固定試劑(1) Bouins液：組織通常在4下固定68h。此固定劑對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)保存不利。(2) Zamboni液：該固定液可用于光鏡、電鏡

9、免疫細(xì)胞化學(xué)觀察。固定時(shí)間以618h為宜。(3) AAF 液（95%-100%乙醇85mL，冰醋酸5ML，濃甲醛10ML）：較常用的固定液。(4) Clarke 改良固定劑（ 100% 乙醇75mL，冰醋酸25 mL），常用于冰凍切片的后固定。(二) 培養(yǎng)細(xì)胞常用固定劑和固定方法 在固定之前需用37預(yù)熱的PBS輕洗細(xì)胞。1. 4%多聚甲醛磷酸緩沖液：固定1020min,干燥。2.甲醇：-10甲醇固定520min, 自然干燥。3.丙酮：4 冷丙酮固定組織穿透性和脫水性強(qiáng)，抗原保存好，很少用于組織切片，常用于培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞涂片的固定，平時(shí)丙酮 4 低溫保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)，將載玻片插入冷丙酮內(nèi) 510

10、min，取出后自然干燥。4.乙醇：95% 乙醇脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（2h內(nèi)）。乙醇使蛋白變性程度輕，固定后蛋白可再溶解，在染色中孵育時(shí)間長(zhǎng)的情況下，抗原可流失，并減弱反應(yīng)強(qiáng)度。5.乙醚（或氯仿）與乙醇等量混合對(duì)組織穿透性極強(qiáng)，即使涂片上含較多的黏液，固定效果仍較好，是理想的細(xì)胞固定液。第三節(jié)、包埋和切片一、石蠟包埋（一）包埋前脫水 脫水(dehydration)是用梯度乙醇將固定好的組織內(nèi)的水分脫去。脫水的時(shí)間長(zhǎng)短與組織塊的大小，結(jié)構(gòu)有關(guān)。般過(guò)程：70、80乙醇可以長(zhǎng)期的保存組織，90乙醇4h，954h，100乙醇()2h，100乙醇()2h。（2

11、） 透明 常用的透明劑是二甲苯。透明的時(shí)間長(zhǎng)短與組織的大小、結(jié)構(gòu)有關(guān)。一般過(guò)程是:二甲苯0.51h，二甲苯 0.51h。應(yīng)注意脫水和透明的時(shí)間一定要充分，否則，不利于浸蠟，易使石蠟與組織之間形成夾層而使切片困難。但時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng)，否則組織變得過(guò)硬，不便于浸蠟，且易引起切片時(shí)脆裂。（3） 浸蠟:經(jīng)透明的組織入溶融的石蠟中浸透，一般需經(jīng)三次，每次0.51h，其時(shí)間的長(zhǎng)短與組織大小和結(jié)構(gòu)有關(guān)，可以靈活掌握。浸蠟時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)或不足，其結(jié)果與脫水、透明不充分或過(guò)長(zhǎng)結(jié)果相似。用于HE染色的標(biāo)本浸蠟和包埋的溫度可限于65，而用于免疫組織化學(xué)的標(biāo)本浸蠟和包埋溫度不能高于60，否則，高溫在非緩沖體系下會(huì)破壞組織

12、中抗原。因此，最好選擇低熔點(diǎn)軟蠟（5658）。（4） 包埋:浸透石蠟的組織塊要入新的石蠟中冷卻凝固，即包埋（embeding）。包埋時(shí)，包埋器中倒入熔化的新蠟，在其凝固之前迅速放入組織塊,放入前要分清組織的各個(gè)面，將所需斷面朝下。包埋有腔組織時(shí)，需平放或立放，以獲得所需斷面。（5） 修塊 :石蠟?zāi)毯螅M織便包封在石蠟內(nèi)。切片前需把包有組織的蠟塊修成一定形狀，并且把各個(gè)面修平，注意不能把蠟邊與組織邊靠得太近亦不能太遠(yuǎn)，近則不易連片，遠(yuǎn)則廢刀。在修塊時(shí)選適當(dāng)?shù)牡胤阶鰳?biāo)記，便于日后辨認(rèn)。二，切片:良好的切片應(yīng)無(wú)刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。 （六）HE染色(1)脫蠟 主要用二甲苯脫蠟。過(guò)程如下：二

13、甲苯()15min 二甲苯()15min。(2)梯度乙醇復(fù)水過(guò)程：100乙醇()10min100乙醇 ()10min95乙醇5min90乙醇 5min80乙醇5min70乙醇5min(3)水洗 把組織片放入自來(lái)水中浸泡5min使組織充分水化，并可洗去多余的乙醇。(4)蘇木精染色 由于蘇木精是水溶性的，故要先入水。水化后的組織片直接放入蘇木精中浸10-20min，染細(xì)胞核。(5)水洗:組織片直接放入自來(lái)水中，一則可以洗去多余的蘇木精染液，二則可以水化組織，加強(qiáng)蘇木精的著色程度(因?yàn)樘K木精是堿性染料，而白來(lái)水也是弱堿性的)。(6)伊紅染色:再次水化的組織片直接入伊紅染液中，染細(xì)胞質(zhì)l0min左右。

14、(7)水洗:再次入自來(lái)水中洗去多余的染液，這時(shí)的水化時(shí)間要短，因?yàn)橐良t在水中易脫色。(8)梯度乙醇脫水 :70乙醇片刻十80乙醇片刻 90乙醇5min95乙醇10min100乙醇()l0min100乙醇()l0min(9)透明:過(guò)程如下：二甲苯()10min，二甲苯()lOmino透明時(shí)，時(shí)間一定要充足，確保乙醇完全被置換出來(lái)，這樣可以使組織片透明、清晰?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】:細(xì)胞核染成紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞外的膠原纖維等成分染成淡粉紅色或淡紅色，紅藍(lán)對(duì)比鮮明。若蘇木精染色過(guò)深，而脫色不足，則細(xì)胞質(zhì)和膠原纖維等成分帶有藍(lán)色。若蘇木精染色過(guò)淡，則細(xì)胞核帶有紅色，對(duì)比不鮮明。（七）封片:透明后的組織片，自

15、二甲苯中取出后，用綢布擦去多余的二甲苯，直接滴加中性樹膠，然后壓上蓋玻片即可鏡檢。注意：1)滴加樹膠要快，以免組織干燥影響觀察效果2)樹膠不用太多，蓋住組織即可 3)蓋玻片時(shí)，要用鑷子夾住蓋玻片，讓蓋玻片的端先接觸樹膠，再輕輕蓋好，以防止出現(xiàn)氣泡(二)冰凍切片:(frozen section)是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法,最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)采用冰凍切片。新鮮組織和已固定的組織均可作冰凍切片。組織在切片前需要冰凍，而冰凍過(guò)程容易使組織中的水分形成冰晶，從而影響抗原定位。一般認(rèn)為，冰晶體積大而

16、量少時(shí)，影響較小，冰晶體積小而量多時(shí)，對(duì)組織結(jié)構(gòu)損害較大，含水量較多的組織中較易發(fā)生。1. 防止組織中冰晶形成的方法（1） 速凍 使組織溫度驟降，減少冰晶的形成。 方法包括：1）干冰-丙酮（酒精）法2）液氮法 （2）應(yīng)用蔗糖溶液2. 恒冷箱切片法1，取材:根據(jù)研究目的取所需組織(如切取小鼠肝臟1.0X1.0X0.5cm大小的組織塊)，用濾紙吸去多余的水分，將組織塊平放于用錫紙?zhí)刂菩『?直徑約2 cm)或軟塑瓶蓋內(nèi) 。加適量OCT包埋劑浸沒(méi)組織，4 2030min。2，組織冷凍:將150200ml丙酮裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和，不再冒泡時(shí)，溫度可達(dá)-70，之后將含有組織塊的小盒輕輕放

17、到干冰制冷后的丙酮液面上。(注意不要使丙酮進(jìn)入包埋液中)，待數(shù)十秒后組織凍結(jié)即可置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80低溫冰箱內(nèi)貯存。3，切片:切片前1小時(shí)將恒冷箱切片機(jī)的溫度設(shè)定為-18左右，以備切片。切片時(shí)溫度以-15-18為宦，溫度過(guò)低組織易破碎。切片厚度以46um為宜。組織切片可直接貼附于載玻片，或貼附于涂有明膠或防脫片劑內(nèi)載玻片上以減少組織片脫落。切片于室溫干燥或風(fēng)吹30min分鐘以上干燥，即可直接進(jìn)入染色或凍存。4，冰凍切片的保存:冰凍切片后如不染色，可吹干后裝入密封的標(biāo)本盒內(nèi)，外包塑料袋，貯存于低溫冰箱，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后于低溫冰箱保存。染色前，從冰箱內(nèi)取出切片，置室溫干燥10min，再

18、經(jīng)丙酮固定510min(未固定者)，即可進(jìn)入染色程序。（三）振動(dòng)切片:用振動(dòng)切片機(jī)（vibratome）可以把新鮮組織（不固定、不冷凍）切成厚片20400m，以漂浮法在反應(yīng)板內(nèi)進(jìn)行組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)染色。因組織不冷凍，無(wú)冰晶形成也無(wú)組織抗原破壞，染色前又避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對(duì)抗原的損害，故能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原。振動(dòng)切片主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布的研究。對(duì)于柔軟的胚胎腦組織，可用低熔點(diǎn)（4555）10%瓊脂糖包埋，振動(dòng)切片機(jī)切成厚片（40100m），采用漂浮法在反應(yīng)板內(nèi)進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。3、 防脫片處理步驟:（一）載玻片和蓋

19、玻片的處理（二）黏附劑的使用:1.多聚賴氨酸（Poly-L-Lysin）首先配制0.1(w/v)多 聚賴氨酸濃縮液，室溫下（18-26）可保存一年;2. 3-氨丙基-乙氧基甲硅烷（3-Amino APES) APES必須現(xiàn)用現(xiàn)配。（三）組織化學(xué)常見脫片原因: 1組織固定、脫水、透明不充分。2. 組織切片過(guò)厚，如5m以上。3. 組織切片有折疊。 4. 過(guò)度的熱抗原修復(fù)（高壓、微波、水煮）處理或抗原修復(fù)液的pH值偏高。5. 操作過(guò)程中，沖洗方法不正確等。第三章 組織化學(xué)第一節(jié) 核酸組織化學(xué)一、Feulgen反應(yīng)是顯示DNA的經(jīng)典而特異的染色方法，由Feulgen（孚爾根）在1924年提出，因而得名

20、。原理:DNA可在酸性條件下水解，嘌呤-脫氧核糖之間的糖苷鍵斷開，形成醛基(一CHO)，再用顯示醛基的特異性試劑 schiff 試劑處理，形成光鏡下所見的細(xì)胞核內(nèi)紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。2、 吖啶橙染色吖啶橙 (acridine orange，AO) 屬于三環(huán)雜芳香類異嗜性陽(yáng)離子熒光染料, 主要以兩種方式與核酸結(jié)合，一是嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間；二是與單鏈核酸的磷酸間發(fā)生靜電相互作用。 當(dāng)吖啶橙與DNA或RNA結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生綠色熒光或橙紅色熒光。可用于區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞少量細(xì)胞懸液與0.01%吖啶橙混合，活細(xì)胞核呈黃綠色熒光；死細(xì)胞呈紅色熒光，這是由溶酶體釋放導(dǎo)致的3、 Hoechst 33258染色原

21、理： Hoechst 33258和Hoechst 33342均為非嵌入性熒光染料，它們?cè)诨罴?xì)胞中DNA聚AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合，活細(xì)胞或固定細(xì)胞均可從低濃度溶液中攝取該染料, 從而使細(xì)胞核著色, 故又把此類染料稱為DNA探針。4、 DAPI染色的原理：DAPI與雙鏈DNA小槽，特別是AT堿基結(jié)合，也可插入少于3個(gè)連續(xù)AT堿基對(duì)的DNA序列中;特點(diǎn)：熒光強(qiáng)度較Hoechst低，但穩(wěn)定;應(yīng)用：檢測(cè)是否存在支原體污染，在有支原體污染的胞質(zhì)和細(xì)胞表面可見孤立的點(diǎn)狀熒光.五、溴化乙啶和溴化丙啶染色法的原理：溴化乙啶是最常用的嵌入式熒光染料，可用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞的染色，標(biāo)本經(jīng)強(qiáng)酸水解破壞R

22、NA，可特異性顯示DNA為橘紅色熒光；標(biāo)本經(jīng)0.1mol/L鹽酸處理，使DNA甲基化，可阻止DNA染色，EB僅與RNA結(jié)合呈橘紅色熒光溴化丙啶不能穿入完整的活細(xì)胞膜中，因此正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不固定的情況下對(duì)溴化丙啶拒染，可用于鑒別死細(xì)胞，DNA呈紅色熒光第2節(jié) 脂類組織化學(xué) 脂類(lipid)是構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分之一，可分為脂肪（fat）和類脂（lipoid）兩大類。脂肪系指甘油三酯，以脂滴形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。類脂是一些與脂肪酸結(jié)合可形成酯的物質(zhì)，包括膽固醇、固醇酯、磷脂和糖脂等。在組織化學(xué)上，根據(jù)染色性質(zhì)的不同可把脂類分為酸性脂類和中性脂類。酸性脂類包括脂肪酸和磷脂等，中性脂類包括甘油三酯、

23、膽固醇及固醇酯、類固醇及某些糖脂等。一酒精蘇丹黑B染色法:蘇丹染色法常用染料有蘇丹黑B（Sudan black-B）、蘇丹III和蘇丹。這類染料均可使中性脂肪著色。蘇丹黑B為重氮染料，能使中性脂肪呈藍(lán)黑色，顯示磷脂效果最好；蘇丹III、蘇丹為紅色染料，后者比前者顯色更強(qiáng)。二油紅O染色法:油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三脂結(jié)合呈小脂滴狀。脂溶性染料能溶于組織和細(xì)胞中的脂類，當(dāng)組織切片置入染液時(shí)，染料則離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)（如脂滴）中，使組織內(nèi)的脂滴呈桔紅色。第3節(jié) 酶組織化學(xué)一、酶組織化學(xué)的基本原理和一般原則:基本原理：細(xì)胞內(nèi)含有多種酶，每一種酶可催化一定的化學(xué)反應(yīng)。將

24、具有酶活性的組織放入含有一定底物的溶液中孵育，底物經(jīng)酶的作用形成初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物，它再與某種捕捉劑相反應(yīng),形成顯微鏡下可視性沉淀，即最終反應(yīng)產(chǎn)物。酶組織化學(xué)對(duì)組織處理的基本要求影響酶活性主要有以下5方面：1. 選擇最適溫度、pH值及緩沖液。2固定和切片標(biāo)本制作 由于固定液易使酶喪失酶活性，因此，最好用不固定的冰凍切片來(lái)顯示酶活性。切片厚度一般為812m，不超過(guò)40m。3. 捕捉劑和激活劑 捕捉劑是形成最終產(chǎn)物的基本條件。凡能提高酶活性的物質(zhì)，稱為激活劑。4. 抑制劑：系指某些物質(zhì)在不引起酶蛋白變性情況下，使酶活性減弱，抑制酶的活力，甚至使酶活性消失。5. 對(duì)照試驗(yàn) 為確定被檢酶是否具有特異性，同時(shí)

25、要進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。二、常用酶組織化學(xué)染色方法（一）磷酸酶（phosphatases）是水解磷酸酯酶的總稱。磷酸酶不僅參與磷酸酯化合物的水解反應(yīng)，而且也參與其逆反應(yīng)及磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。1 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）在堿性環(huán)境下可催化各種酚和醇的磷酸酯水解，還具有磷酸轉(zhuǎn)移作用，在細(xì)胞膜上運(yùn)輸作用較為活躍，如腎近曲小管的刷狀緣、小腸上皮的微絨毛、肝臟的膽小管、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元的突觸膜均可顯示此酶活性。（1）鈣-鈷法：在堿性環(huán)境(pH9.29.4)中，堿性磷酸酶將磷酸鹽的底物（如-甘油磷酸鈉，-萘酚磷酸鈉）分解產(chǎn)生的磷酸離子被孵育液中的鈣離子捕獲生成磷酸鈣沉淀，因

26、磷酸鈣不能顯色，需加入硝酸鈷，用鈷離子置換鈣離子，形成磷酸鈷沉淀后用硫化銨處理，形成棕黑色硫化鈷顆粒沉淀，從而顯示酶活性部位，硫化鈷沉淀的多少與堿性磷酸酶含量成正比。（2）偶氮-偶聯(lián)法：人工合成的磷酸萘酚鹽經(jīng)堿性磷酸酶水解后釋放出萘酚，后者立即與重氮鹽偶聯(lián)生成不溶性偶氮色素。2. 酸性磷酸酶（acid phosphatase, ACP）廣泛分布在機(jī)體各種組織細(xì)胞內(nèi)，主要存在于細(xì)胞的溶酶體內(nèi)，常作為溶酶體標(biāo)志酶，此外，還存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)內(nèi)。在組織退變、核酸和蛋白質(zhì)代謝活動(dòng)增加時(shí) 酸性磷酸酶活性增強(qiáng)。酸性磷酸酶還參與酯類代謝。因此，它在疾病、免疫反應(yīng)和細(xì)胞損傷與修復(fù)過(guò)程中具有一定生物學(xué)意義。（1

27、）金屬鹽鉛法：其基本原理是在酸性環(huán)境下，底物-甘油磷酸鈉被酸性磷酸酶水解，釋放出磷酸，磷酸遇鉛離子則生成磷酸鉛沉淀，最后與硫化銨作用形成棕黃色硫化鉛沉淀。（2）重氮鹽后偶聯(lián)法 與堿性磷酸酶相同 3.葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase, G-6-P）定位于肝、腎、腸粘膜的微體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，主要有兩方面的生理功能：一方面通過(guò)水解葡萄糖-6-磷酸釋放葡萄糖來(lái)控制葡萄糖釋放入血的量，另一方面，在一定條件下通過(guò)其磷酸轉(zhuǎn)移酶活性合成葡萄糖-6-磷酸。糖尿病患者血糖濃度增高的同時(shí)，伴有葡萄糖-6-磷酸酶的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性增高，其作用是取代肝內(nèi)的葡萄糖激酶，使葡萄糖轉(zhuǎn)向糖原合成。 鉛法

28、：葡萄糖-6-磷酸水解后所釋放出磷酸，為硝酸鉛所捕獲，經(jīng)硫化銨處理，最終反應(yīng)產(chǎn)物為顆粒狀的硫化鉛沉淀。第4節(jié) 凝集素組織化學(xué) 凝集素 (lectin)是一種無(wú)免疫原性蛋白質(zhì)，可從植物或動(dòng)物中提取，具有凝集紅細(xì)胞的特性，故又稱植物血凝素。凝集素能特異地與糖蛋白中的糖基反應(yīng)。凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與多種標(biāo)記物結(jié)合，可作為組織化學(xué)的特異性探針在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位，從而廣泛用于糖蛋白的性質(zhì)、分布以及正常細(xì)胞更新過(guò)程中糖蛋白變化的研究。 凝集素的標(biāo)記物:凝集素可作為組織化學(xué)的特異性探針廣泛用于光鏡的石蠟切片、冰凍切片、電鏡樹脂包埋超薄切片及冰凍超薄切片等標(biāo)本的觀察。為使結(jié)合在細(xì)胞膜上單糖的

29、凝集素呈現(xiàn)可視性，通常采用熒光素，辣根過(guò)氧化物酶、鐵蛋白、膠體金、生物素等對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。第5節(jié) 熒光組織化學(xué)熒光組織化學(xué)技術(shù)是利用熒光來(lái)鑒定組織細(xì)胞內(nèi)某些生物化學(xué)成分、探討細(xì)胞功能狀態(tài)的常用方法。組織細(xì)胞熒光分類:(一)自發(fā)熒光: (autofluorescence)系指不經(jīng)任何處理的組織細(xì)胞成分，在短波長(zhǎng)光照射下發(fā)出熒光，如膠原纖維和彈性纖維呈藍(lán)綠色熒光，卟啉呈紅色熒光，維生素A發(fā)綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光。(二）誘發(fā)熒光:是指生物胺類物質(zhì)，如去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、組胺等與一些醛類物質(zhì)在一定條件下發(fā)生環(huán)化或縮合反應(yīng)，產(chǎn)生的縮合物可發(fā)出強(qiáng)熒光，稱為誘發(fā)熒光。誘發(fā)

30、熒光法的敏感性較高、特異性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌以及神經(jīng)生物學(xué)等研究。(三)酶促熒光:指酶的反應(yīng)產(chǎn)物能發(fā)熒光，如脫氫酶反應(yīng)中的輔酶I變?yōu)檫€原型輔酶I后，發(fā)紅色熒光。因此可根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度推測(cè)酶與酶促反應(yīng)的情況。(四)熒光染色:(fluorochromy)系指某些熒光染料在極低濃度下可與組織細(xì)胞的某種成分結(jié)合，發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光，如吖啶橙可與細(xì)胞核中DNA結(jié)合，發(fā)出黃綠色熒光。熒光染色的優(yōu)點(diǎn)為敏感度高，所需染料濃度低，對(duì)細(xì)胞毒性小，可作活體染色，觀察組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、組成和功能狀態(tài)。(五)免疫熒光第四章、免疫組織化學(xué)技術(shù)概念：應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些多肽和

31、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行原位定性、定位或定量研究的技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，敏感度高，應(yīng)用廣泛。第一節(jié) 免疫組織化學(xué)基本原理一、直接法:用酶或其它標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原結(jié)合。如標(biāo)記物是酶，再加酶的底物，產(chǎn)生的有色產(chǎn)物沉積在抗原抗體反應(yīng)的部位，即可檢測(cè)。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，特異性強(qiáng)，非特異性反應(yīng)低； 缺點(diǎn)：敏感性差； 很難獲得各種市售標(biāo)記抗體。（舉例）敏感性：一般情況，抗原抗體反應(yīng)比例：1:6二、間接法:第一抗體（兔）不標(biāo)記，使用與一抗種屬相同抗體的Fc段（有種屬特異性）作為抗原免疫動(dòng)物（羊），制備抗抗體，即第二抗體（羊抗兔），并標(biāo)記第二抗體。

32、染色時(shí)，順次以第一抗體和標(biāo)記的第二抗體處理標(biāo)本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗體-標(biāo)記第二抗體復(fù)合物，以達(dá)到檢測(cè)該抗原的目的。間接法因第二抗體的放大作用敏感性大大增高。 三、親和免疫組織化學(xué)(一)親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法 (avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC法)1.生物素 (Biotin) 含硫的雜環(huán)單羧酸，分子量小, 通過(guò)羧基與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，從而可標(biāo)記抗體和酶。2.親和素 (avidin)又稱卵白素，糖蛋白，1個(gè)親和素分子上有4個(gè)與生物素結(jié)合位點(diǎn)，故生物素與親和素有很高的親和力。特點(diǎn): 是將親和素作為“橋”與生物素化的抗體和生

33、物素結(jié)合的酶連接起來(lái)，使抗原與抗體反應(yīng)信號(hào)放大，以增加敏感性。2. 免疫組織化學(xué)酶類標(biāo)記物免疫組化標(biāo)記物的酶結(jié)合在抗體或生物素上，制成酶標(biāo)抗體或生物素化抗體，再借助酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色沉淀，在光鏡下進(jìn)行各種抗原成分觀察 。常用酶類：辣根過(guò)氧化物酶(HRP), 堿性磷酸酶(AP)HRP：底物:-過(guò)氧化氫 供氫體：二氨基聯(lián)苯胺 (Diaminobenzidine,DAB) 3-氨基-9乙基咔唑 (3-amino-9-ethylcarbozole, AEC) HRP+DAB + 過(guò)氧化氫 棕色沉淀（不溶于水） HRP+ AEC + 過(guò)氧化氫 紫紅色沉淀（脂溶性）AP：是磷酸酯水解酶 溴氯

34、羥吲哚磷酸鹽(底物）/硝基藍(lán)四唑（供氫體） (BCIP/NBT) AP +NBT/BCIP 藍(lán)紫色（不溶于水）(二) 鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶法（Streptavidin-peroxidase method，SP法）ABC法的缺點(diǎn)：親和素中含有7%糖類；(單糖之間可產(chǎn)生糖甙）親和素的等電點(diǎn)約10左右，可帶較多的負(fù)電荷；親和素中有4個(gè)結(jié)合點(diǎn)，其中一半與連接抗體結(jié)合，另一半與復(fù)合物結(jié)合，可降低其敏感性 。鏈霉親和素替代ABC法中的親和素-生物素復(fù)合物，形成鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶法，SP法 鏈霉親和素是從鏈霉菌中分離出的一種蛋白，含有四個(gè)亞基，鏈霉親和素的四個(gè)亞基可以全部和二抗上的生物素結(jié)

35、合，故又稱鏈霉菌抗生物素蛋白； 由于該放大系統(tǒng)不含生物素，可以免除由內(nèi)源性生物素所造成的背景染色；等電點(diǎn)為5.56.7，接近中性，所帶的負(fù)電荷少；鏈霉親和素不含糖基。第二節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)應(yīng)用基本原則免疫組織化學(xué)技術(shù)的局限性：組織細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)物質(zhì)要有抗原性；有一定濃度方可檢測(cè)出；檢測(cè)出的陽(yáng)性蛋白不能被確定是細(xì)胞新合成的蛋白還是通過(guò)細(xì)胞間運(yùn)輸而來(lái)的蛋白。 1. 確定細(xì)胞類型和形態(tài)2辨認(rèn)細(xì)胞產(chǎn)物的來(lái)源3確定細(xì)胞的分化程度4追蹤神經(jīng)纖維束和它的投射區(qū)5. 在臨床病理中的應(yīng)用 如鑒定病變性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微小病灶，探討腫瘤起源或分化表型，確定腫瘤分期，指導(dǎo)治療和預(yù)后，輔助疾病診斷和分類，尋找感染病因等。免疫

36、組織化學(xué)染色樣品制備特點(diǎn) 取材：組織標(biāo)本取材：基本原則: 取材速度要快，盡量保持組織新鮮，以充分保存組織的抗原性。細(xì)胞標(biāo)本取材:貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞: 取材時(shí)，用預(yù)熱的PBS輕輕沖洗小蓋片，而后，即可加入固定液。懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞：制備2×10 5-6細(xì)胞/ml懸液，取50-100l，加入涂片機(jī)內(nèi)，1000r/min. 2min. 細(xì)胞即可均勻分布在載玻片上.（2） 涂片法：臨床穿刺獲取含有細(xì)胞的液體（腹水，胸水和心包液）或氣管、宮頸等分泌物可直接涂片。 固定：組織常用固定劑：10%中性緩沖福爾馬林（濃甲醛10ml, 0.01M, pH 7.4, PBS 90ml); 4%多聚甲醛磷酸緩沖液(p

37、H7.4)注意事項(xiàng)： 甲醛固定可引起組織抗原決定簇交聯(lián)和封閉（可以通過(guò)抗原修復(fù)方法來(lái)修正 組織大小應(yīng)該小于2cm×l.5cm × 0.3cm，尤其厚度必須小于0.3cm；固定液的量，體積一般大于組織20倍以上；固定時(shí)間8-24小時(shí)，過(guò)度固定會(huì)使抗原表達(dá)假陰性；組織固定后應(yīng)充分水洗。 細(xì)胞常用固定劑和固定方法： 4%多聚甲醛磷酸緩沖液，固定10-20min,干燥; -10甲醇固定5min, 自然干燥; 冷丙酮(4 )5min，自然干燥。 95% 乙醇（常用于冰凍切片和涂片固定）PBS沖洗三次，接免疫組化染色步驟.石蠟包埋和切片包埋前的脫水、透明等過(guò)程應(yīng)在4 下進(jìn)行，以盡量減少

38、組織抗原的損失，此外，不能在70%酒精中長(zhǎng)時(shí)間浸泡;浸蠟、包埋過(guò)程中，石蠟應(yīng)保持在60 以下，最好選擇低溶點(diǎn)軟蠟（56-58)。切片厚度4-5m;展片最佳的方法是采用兩次展片;載玻片需要多聚-L-賴氨酸防脫片處理.何為二次展片? 是指切片在展片過(guò)程中，先將組織切片漂浮在30%的乙醇溶液中，進(jìn)行第一次展片后將切片撈起，再次放入45一50 的水浴鍋中進(jìn)行第二次展片，因?yàn)榫凭芤号c水之間有一個(gè)張力差，這樣處理可得到平整無(wú)皺折的組織切片。酒精的濃度和水溫可視組織不同和石蠟熔點(diǎn)的高低，自行調(diào)整。防脫片處理步驟:（1）載玻片和蓋玻片的處理（2）多聚賴氨酸（Poly-L-Lysin)的使用方法注意事項(xiàng): 稀

39、釋后的多聚賴氨酸溶液置4 冰箱保存，反復(fù)使用1個(gè)月；檢查玻片是否上膠：在己配好的多聚賴氨酸溶液中沾一下，膠呈一層均勻的水膜狀覆蓋在玻片表面，表明玻片潔凈；若膠呈流水樣流走，表明玻片不夠潔凈，防脫片膠無(wú)法沾附于玻片上，需要重新清洗玻片后再上膠。免疫組化常見脫片原因: 組織固定、脫水、透明不充分； 組織切片太厚，大于5m； 組織切片有折疊； 過(guò)度的熱抗原修復(fù)（高壓、微波、水煮）處理； 抗原修復(fù)液的pH值偏高；操作過(guò)程中，沖洗方法不正確。第三節(jié)、免疫組織化學(xué)染色步驟石蠟切片免疫組化染色步驟1.烤片：58 2-h；2.脫蠟和水化：在二甲苯、中浸泡15min100酒精、中分別浸泡5min95、90、80

40、、70酒精各浸泡2minPBS洗3次×3min,置蒸餾水中待用；3.抗原修復(fù)：先將pH=6.0和0.1molL檸檬酸緩沖液煮沸，將切片置于已沸緩沖液中進(jìn)行高壓修復(fù)1.5min，室溫冷卻，PBS沖洗3次×5min；4.用0.1 0.3TritonX-100浸泡，RT，25min，PBS沖洗3次×5min；使抗體滲透進(jìn)入細(xì)胞的方法（1） Triton X-100 ：使細(xì)胞膜脂類溶解 （2） Np-40：使細(xì)胞膜蛋白質(zhì)破壞 （3） Saponin：使細(xì)胞膜膽固醇溶解（4） Freezing：使細(xì)胞膜穿孔，速凍形成冰晶，溶解后形成小孔。5.滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素（

41、1）滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3甲醇-H2O2浸泡，RT，30min，PBS沖洗3次×5min；（2）滅活內(nèi)源性生物素：加生物素阻斷劑A液1滴，RT，10min，PBS沖洗3次×2min；加B液1滴，RT，10分鐘，PBS沖洗3次×2min；此步驟適用于富含生物素的組織（如腦和胚胎組織）（3）滅活堿性磷酸酶：以每毫升24mg左旋咪唑加入底物液中，保持PH7.68.2;6.非免疫血清封閉：吸附組織中膠原和結(jié)締組織帶正電荷的蛋白，2%-10%濃度，RT，10min，而后還可用2-5BSA（牛血清白蛋白）浸泡，RT，10min，不洗；7.加入一抗ChAT(1:200)（取1

42、l一抗,加入199l的PBS中混勻，4過(guò)夜，PBS沖洗3次×5min8.加入生物素標(biāo)記IgG(二抗），RT,10分鐘， PBS沖洗3次×5min；9.加入鏈霉親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶（SABC-POD，或SABC-AP），RT,10min，PBS沖洗4次×5min10.AEC或DAB（ 或NBT/BCIP ）顯色， 顯色過(guò)程為210min（鏡下監(jiān)控，AEC不能長(zhǎng)期保存），蒸餾水或自來(lái)水沖洗；11.蘇木精復(fù)染（10秒鐘），自來(lái)水沖洗，PBS返藍(lán)；12.水溶性封片劑封片。  鏡下檢查結(jié)果（二）冰凍切片免疫組化染色1.恒冷箱切片：新鮮組織或80保存 組織

43、切片；2.裱片和晾干；3.染色前冷丙酮4 固定10-20分；4.一般不必細(xì)胞膜打孔.(三)培養(yǎng)細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色1.固定2.晾干3.抗原修復(fù)（適合于甲醛固定）4.細(xì)胞膜打孔二、SABC法與免疫組織化學(xué)染色其它方法比較（一）SP法或SAP法 （二）EnVision TM Systems 原理是將多個(gè)抗鼠和抗兔IgG分子與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合形成聚合物, 以代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法的二抗和三抗, 直接與特異性第一抗體結(jié)合，從而放大了抗原抗體結(jié)合的信號(hào)，使檢測(cè)變得簡(jiǎn)單而且敏感性增加。（三）Maxvision法 :根據(jù)聚合物技術(shù)把過(guò)氧化物酶與抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚肽上形成多聚物分子，可以避免由于生物素

44、引起的非特異性背景顯色. 三、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)價(jià)如何排除非特異性染色結(jié)果？（一）以抗原表達(dá)模式定位 1細(xì)胞質(zhì)內(nèi)彌漫性分布，即胞質(zhì)型陽(yáng)性反應(yīng)；2細(xì)胞核周邊胞質(zhì)內(nèi)分布，其判別要點(diǎn)是細(xì)胞核輪廓被勾畫得很清楚，如CD3抗體染色。3胞漿內(nèi)局限點(diǎn)狀陽(yáng)性反應(yīng)，如CDl5抗體染色。4細(xì)胞膜線性陽(yáng)性反應(yīng)，大多數(shù)淋巴細(xì)胞標(biāo)志物的染色均如此，如CD20。5細(xì)胞核陽(yáng)性反應(yīng)如BrdU及雌、孕激素受體蛋白等。有些抗原的陽(yáng)性表達(dá)也可同時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞的不同部位，如細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等。 (二) 陽(yáng)性染色結(jié)果定量分析1計(jì)算免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);2以染色陽(yáng)性強(qiáng)度和陽(yáng)性檢出率相結(jié)合而定;3. 圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果.四、討論（一）

45、實(shí)驗(yàn)計(jì)劃（目的，擬用方法，操作流程方案及預(yù)期結(jié)果等）,對(duì)每一抗體均應(yīng)配陽(yáng)性和陰性對(duì)照。 （二）抗體的稀釋度 表4-2.選擇抗體的最佳濃度一抗稀釋度 特異性染色強(qiáng)度 非特異性染色背景強(qiáng)度 1:50 十十十十 十十 1:100 十十十 十 1:200 十十 一 陰性對(duì)照 一 一從表中可以看出，在一抗稀釋度1:100和1:200之間可找出最佳稀釋度。(三)滴加抗體注意事項(xiàng) （組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)） 抗體的種類（多、單克隆抗體；即用、濃縮抗體）抗體的稀釋液： 10mg/ml BSA和0.05 (v/v)% Tween 20 加入0.01molPBS 液中(四）抗體的保存 1抗體分裝 2抗體稀釋 3無(wú)菌與

46、消毒 (五) 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 對(duì)照實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果分析對(duì)照種類靶組織實(shí)驗(yàn)試劑 陽(yáng)性反應(yīng)意義陽(yáng)性組織對(duì)照組織中含待測(cè)抗原按常規(guī)操作流程提示操作系統(tǒng)的試劑和操作方法無(wú)誤一抗陰性對(duì)照組織中待測(cè)抗原未定用與第一抗體相同種屬正常血清取代一抗或用PBS取代一抗，其余步驟不變。提示有非特異性反應(yīng)存在二抗陰性對(duì)照組織中待測(cè)抗原未定 用與第二抗體相同種屬正常血清取代二抗或用PBS取代二抗，其余步驟不變。提示一抗對(duì)組織有非特異性吸附或組織內(nèi)未滅活內(nèi)源性酶 第三節(jié) 免疫組織化學(xué)雙重染色需要檢測(cè)兩種不同物質(zhì)是否在同一樣品中共存或同一種細(xì)胞中共存。 1.條件：不同種屬來(lái)源的特異性抗體雙重染色；兩種抗原最好在不同部位； 兩種抗體

47、的抗原修復(fù)方法一致;應(yīng)用兩種不同的顯色系統(tǒng)或不同顏色的熒光（HRP和AP或FITC和TRITC)。2.與單染不同點(diǎn)：(1)在第一種抗原顯色后，加雙標(biāo)阻斷液或0.05%鹽酸, RT，10min(2) 滴加非免疫血清（與二抗同種屬）37 ，10分鐘。（不洗） 接著加入第二種一抗37 孵育，30min或4 過(guò)夜； 重復(fù)以前的步驟。（注意：二抗的種屬性，復(fù)合物中酶不同）免疫熒光組織化學(xué)1 熒光原理介紹光：由發(fā)光體質(zhì)點(diǎn)的熱運(yùn)動(dòng)所引起的輻射。 光的波動(dòng)性 光的量子性物質(zhì)經(jīng)光照射后的兩種表現(xiàn)形式 1）熒光素 2）非熒光素慮片熒光的分類:熒光（Fluorescence）：當(dāng)某種物質(zhì)經(jīng)一定波長(zhǎng)的入射光照射，吸收

48、光能后進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，并立即退激發(fā)，釋放出比入射光波長(zhǎng)要長(zhǎng)的出射光，稱為熒光。熒光為非溫度輻射，是一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。1 原發(fā)性熒光: 1光致熒光（激發(fā)光通常紫外線、激光）2放射熒光3化學(xué)熒光4生物熒光2 組織自發(fā)性熒光 3 繼發(fā)性熒光 4 免疫熒光 1.2 熒光的本質(zhì) 引發(fā)熒光最有效的光線是光譜上較短的區(qū)域：即紫外線區(qū)域，波長(zhǎng)為320400nm. 這種現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是熒光素吸收了短波光的能量（波長(zhǎng)越短，光能越強(qiáng)），又以發(fā)光的形式以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光射出，而為人眼所見。1.3熒光素特性熒光效率 (fluorescence efficiency)： 熒光素吸收光后發(fā)射出的熒光量子數(shù)與其所吸收激發(fā)光量

49、子術(shù)的比值。通常小于1，其值應(yīng)在0.35以上。 熒光效率= 發(fā)出熒光光子數(shù) / 吸收光子數(shù)熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity）：與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比。在單位強(qiáng)度的激發(fā)光照射下，熒光素發(fā)射熒光的光子數(shù)。1.4 吸收光譜和發(fā)射光譜吸收光譜，又稱激發(fā)光譜(excitation spectrum ) 反映某以物質(zhì)在不同波長(zhǎng)光激發(fā)下的發(fā)光情況的, 橫坐標(biāo)是外來(lái)的激發(fā)光的波長(zhǎng)?？v坐標(biāo)值越高，說(shuō)明吸收能量也越多。 發(fā)射光譜(emission spectrum) 處于高能級(jí)的原子或分子在向較低能級(jí)躍遷時(shí)產(chǎn)生輻射，將多余的能量發(fā)射出去形成的光譜。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)膽]光片，來(lái)觀察不同顏色的光。1.

50、5 熒光穩(wěn)定性1）激發(fā)光強(qiáng)度超過(guò)一定限度或長(zhǎng)時(shí)間照射時(shí)，不可逆地破壞 激發(fā)狀態(tài)的分子叫光漂白photobleaching。措施：降低激發(fā)光的強(qiáng)度；用抗淬滅劑。2）淬滅劑: 能與熒光分子作用引起熒光淬滅的物質(zhì)（淬滅劑）：鹵素離子（l）；重金屬離子（Ag）；及具有氧化性的有機(jī)物等。與熒光穩(wěn)定性有關(guān)的因素溶液pH值; 最適pH;溶劑的性質(zhì) ;熒光素的濃度; 最佳濃度溫度:30C開始，溫度升高，熒光強(qiáng)度降低，易發(fā)生淬滅 1.6 抗淬滅方法 常用抗熒光淬滅劑 P-苯二胺(Para-phenylene diamine，PPD): 最有效，但對(duì)光和熱均有較強(qiáng)的敏感性，且具有毒性。 PPD抗淬滅劑混合液配方：

51、 9份甘油、1份PBS含濃度在27mM/L之間的PPD)，最終pH為8.59 n-丙基沒(méi)食子酸鹽(propyl gallate，NPG): 無(wú)毒性，對(duì)光和熱穩(wěn)定，但抗熒光淬滅的效果不佳.其它： 1，4-二偶氮雙環(huán)2，2，2)-辛烷(1，4-diazobicyelo(2，2，2)-octane，DABCO)等。封片劑的制備： 1) 緩沖甘油（pH8.5）的制備: 0.5M碳酸緩沖液pH 9.5 ：甘油-1：92) Elvanol-緩沖甘油混合劑的制備 （抗淬滅效果較好） Elvanol(聚乙烯醇) : 0.5M碳酸緩沖液pH 9.0 1:1 攪拌6h； 再取1份甘油與2份上述混合劑混合，攪拌6h

52、； 12000人r/min6-分，取上清，暗處密封保存。注：羅達(dá)明在Elvanol中溶解，不能用上述封片劑。染色后應(yīng)立即觀察，否則熒光信號(hào)會(huì)減弱?？煞旁诎岛兄?，罩上塑料袋，放于05C保存。2常用熒光素介紹 1, 異硫氰酸熒光素Fluorescein isothiocyanate (FITC)FITC是熒光黃（ Fluorescein ）的衍生物，是第一個(gè)標(biāo)記抗體的熒光素；缺點(diǎn)易漂白；熒光黃的另一個(gè)衍生物Alexa 488不易淬滅。 2 , 羅丹明 Rhodamine羅丹明衍生物 四甲基異硫氰羅丹明(Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate,TRITC）激發(fā)光550

53、nm; 發(fā)射光620nm (紅色)；常與FITC搭配。Texas Red (TR) 激發(fā)光589nm; 發(fā)射光615nm (紫紅色) 四乙基羅丹明(RB200) 激發(fā)光570nm; 發(fā)射光595600nm (紫紅色) 其它：Alexa 546, Alexa 555, Alexa 633;Rhodamine Red-X (RRX) RB200 3, 花青染料（Cyanine）Cy2耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)為492nm，發(fā)光為波長(zhǎng)510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定。注意：要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因?yàn)檫@種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng)，在染色片儲(chǔ)存后會(huì)

54、導(dǎo)致熒光微弱和擴(kuò)散。Cy3耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)光波長(zhǎng)為550nm，最強(qiáng)發(fā)射光為570nm (橘紅色) 。因?yàn)榧ぐl(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)與TRITC一樣, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾光片。Cy5 激發(fā)光650nm（不用高壓汞燈，而用激光來(lái)激發(fā)）; 發(fā)射光670 nm (遠(yuǎn)紅外線) ，不能用肉眼觀察。通常觀察Cy5時(shí)采用具有合適激發(fā)光和遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡。2 其它熒光素Indo-1：是典型的雙發(fā)射熒光探針。最大激發(fā)光波長(zhǎng)為330/346nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)熒光。無(wú)鈣時(shí)在485nm左右有發(fā)射峰，結(jié)合鈣后，則在405nm處有發(fā)射峰，

55、兩者的比值與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度成線性關(guān)系，將此比值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比即可得出細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，因此，可利用此探針定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。常用于鈣離子指示劑。 Indo-1-AM（乙酸甲酯）它是Indo 1 的乙酰甲酯衍生物，通過(guò)培養(yǎng)液能夠進(jìn)入活細(xì)胞，一旦進(jìn)入細(xì)胞，酯酶將乙酸甲酯水解掉，產(chǎn)生一個(gè)可以透過(guò)膜的熒光染料。是一種鈣熒光探針。量子點(diǎn)(quantum dot)：是近年來(lái)研制的一種新型熒光染料，又稱半導(dǎo)體納米晶體，是由幾百或幾千個(gè)納米級(jí)顆粒構(gòu)成的半導(dǎo)體材料，性質(zhì)穩(wěn)定。DIOC6：波士頓Dana-Farber癌癥研究所內(nèi)一個(gè)日本人 Terasaki作博士后時(shí)，發(fā)現(xiàn)帶有陽(yáng)性電荷DIOC6能夠

56、穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜，低濃度時(shí)能將Mitochondria染色，高濃度是也能染上ER。DAPI ：4-6二脒基-2苯吲哚，能與雙鏈DNA小槽，特別是AT堿基結(jié)合。當(dāng)它于雙鏈DNA結(jié)合是，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)20倍，而與單鏈DNA結(jié)合是無(wú)熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，DAPI的熒光強(qiáng)度雖較Hoechst低，但熒光穩(wěn)定性較好。358nm 激發(fā)，461nm藍(lán)光。Hoechst33258和33342均為非嵌入性熒光染料，它與DNA中AT序列富集區(qū)的小槽結(jié)合，從而使細(xì)胞核著色。激發(fā)光350nm，461藍(lán)光 2.2 GFP:綠色熒光蛋白能夠?qū)⑺杆剞D(zhuǎn)變成綠色的物質(zhì)是水母體內(nèi)的另一種蛋白質(zhì)，叫做綠色熒光蛋白（GFP）。 1962下村修和約翰森從這種水母體內(nèi)提純出水母素外，還純化了產(chǎn)物中的一個(gè)副產(chǎn)物，就是綠色熒光蛋白（ J. Cell. Comp. Physiol. 59, 223-239 (1962)）. GFP的分子特性:GFP是