02第二章細胞生物學(xué)研究方法

1、第二章第二章 細胞生物學(xué)細胞生物學(xué)的研究方法的研究方法第一節(jié)第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)(二二)熒光顯微鏡熒光顯微鏡:熒光：特定物質(zhì)可以在紫外線激發(fā)后，發(fā)射熒光：特定物質(zhì)可以在紫外線激發(fā)后，發(fā)射出更長波長的可見光，即熒光。出更長波長的可見光，即熒光。暗背景，強反差，彩色圖像暗背景，強反差，彩色圖像（熒光染料）（熒光染料）熒光分子：在激發(fā)后可發(fā)射熒光的物質(zhì)即熒光分子熒光分子：在激發(fā)后可發(fā)射熒光的物質(zhì)即熒光分子 。 （由于熒光分子可以使被檢樣品呈現(xiàn)不同的染色，因此可做熒光染料用（由于熒光分子可以使被檢樣品呈現(xiàn)不同的染色，因此可

2、做熒光染料用,熒光分子也可以稱作熒光染料。）熒光分子也可以稱作熒光染料。）熒光顯微鏡的應(yīng)用熒光顯微鏡的應(yīng)用 定性、定位和定量定性、定位和定量的研究組織內(nèi)的熒光標(biāo)記的研究組織內(nèi)的熒光標(biāo)記物質(zhì)。物質(zhì)。 對對活細胞活細胞內(nèi)分子的內(nèi)分子的動態(tài)動態(tài)變化進行實時觀察。變化進行實時觀察。 活細胞的微細結(jié)構(gòu)和變化、分裂和運動等?；罴毎奈⒓毥Y(jié)構(gòu)和變化、分裂和運動等。相差顯微鏡觀察培養(yǎng)中的相差顯微鏡觀察培養(yǎng)中的hela細胞細胞(四四)暗視野顯微鏡通過散射光成像暗視野顯微鏡通過散射光成像應(yīng)用：應(yīng)用：分辨率不高。分辨率不高。用于觀察未經(jīng)染色、無色透用于觀察未經(jīng)染色、無色透明的物體的輪廓和運動以及明的物體的輪廓和運動

3、以及活細胞的質(zhì)膜、纖毛、細胞活細胞的質(zhì)膜、纖毛、細胞核等結(jié)構(gòu)。核等結(jié)構(gòu)。原理：散射光成像。原理：散射光成像。( (五五) )顯微電影攝影技術(shù)記錄細胞或細胞器的運動過程顯微電影攝影技術(shù)記錄細胞或細胞器的運動過程 原理：原理：用顯微電影攝影術(shù)或電視錄像以一定用顯微電影攝影術(shù)或電視錄像以一定時間間隔時間間隔拍攝。拍攝。應(yīng)用：應(yīng)用：準(zhǔn)確記錄細胞或細胞器的準(zhǔn)確記錄細胞或細胞器的運動過程和速度運動過程和速度。 （六）共聚焦激光掃描顯微境（六）共聚焦激光掃描顯微境 laser confocal scanning microscope, lcsm特點：特點：p高清晰高清晰p可形成被檢物體的三維圖像可形成被檢物

4、體的三維圖像結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：普通熒光顯微鏡（普通熒光顯微鏡（a）與激光共聚焦顯微鏡（）與激光共聚焦顯微鏡（b）的成像比較）的成像比較 二、電子顯微技術(shù)二、電子顯微技術(shù) 以以電子束電子束作為光源，作為光源， 波長短，分辨率高波長短，分辨率高電子顯微鏡分辨率電子顯微鏡分辨率 理論值：理論值：0.002nm 實際值：實際值：0.1nm 電鏡下觀察到的結(jié)構(gòu)稱為電鏡下觀察到的結(jié)構(gòu)稱為超微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)或或亞顯微結(jié)構(gòu)亞顯微結(jié)構(gòu) (一一)透射電子顯微鏡（透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，tem ）光學(xué)顯微鏡與透射電子顯微鏡的比較光學(xué)顯微鏡與透射電子顯微鏡的比較原理：

5、原理：通過電子束穿透標(biāo)本后成像。通過電子束穿透標(biāo)本后成像。 應(yīng)用：應(yīng)用：用來觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。用來觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。透射電鏡及其圖像透射電鏡及其圖像掃描電鏡及其圖像掃描電鏡及其圖像電鏡與光鏡區(qū)別主要在于：電鏡與光鏡區(qū)別主要在于： （1 1）光源不同）光源不同 光鏡為可見光或紫外線光鏡為可見光或紫外線, ,電鏡為電子束電鏡為電子束 （2 2）透鏡不同）透鏡不同 光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡 （3 3）電鏡要求真空）電鏡要求真空 （4 4）電鏡分辨力高）電鏡分辨力高( (具體）具體） (5) (5) 成像原理不同（具體）成像原理不同（具體） 第二節(jié)第二節(jié) 細胞的分離與培

6、養(yǎng)細胞的分離與培養(yǎng)細胞分離的第一步是要將細胞從組織中分離出來，細胞分離的第一步是要將細胞從組織中分離出來，制備出單細胞懸液。制備出單細胞懸液。細胞分離操作的原則：細胞分離操作的原則：p 等滲等滲p 低溫低溫p 無菌操作無菌操作 根據(jù)不同細胞的特征采用不同的細胞分離方法。根據(jù)不同細胞的特征采用不同的細胞分離方法。 細胞分離方法細胞分離方法離心方法離心方法 流式細胞術(shù)流式細胞術(shù) 免疫磁珠法免疫磁珠法 激光捕獲顯微切割技術(shù)激光捕獲顯微切割技術(shù) ( (一一) )離心方法離心方法 利用細胞的利用細胞的密度特性密度特性可有效分離不同的細胞?？捎行Х蛛x不同的細胞。如血漿白細胞和紅細胞的分離。如血漿白細胞和紅

7、細胞的分離。 二、細胞培養(yǎng)二、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cell culture)：從機體中取出組織或細胞，從機體中取出組織或細胞，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存、生長和增模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存、生長和增殖的一種方法。殖的一種方法。1.條件條件 營養(yǎng)條件：營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：rpmi-1640、dmem。 血清。血清。 5%co2 無菌環(huán)境無菌環(huán)境 2.細胞培養(yǎng)的主要方式是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)細胞培養(yǎng)的主要方式是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（原代培養(yǎng)（primary culture）：）：直接從體內(nèi)獲取直接從體內(nèi)獲取的組織和細胞進行的首次培養(yǎng)。的組織和細胞進行的首次培養(yǎng)。

8、傳代培養(yǎng)（傳代培養(yǎng)（secondary culture）：）：原代培養(yǎng)的細原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)過增殖達到一定密度后，將細胞分散，從一胞經(jīng)過增殖達到一定密度后，將細胞分散，從一個培養(yǎng)器以一定比例移到另一個或幾個容器中的個培養(yǎng)器以一定比例移到另一個或幾個容器中的擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)。3.來源于體內(nèi)的細胞可在體外建系（細胞系）來源于體內(nèi)的細胞可在體外建系（細胞系）細胞系（細胞系（cell line）：）：在培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生在培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生“不死不死”的的 變異細胞，這種細胞可以無限繁殖、傳代。變異細胞，這種細胞可以無限繁殖、傳代。細胞系的來源細胞系的來源p取材于腫瘤組織的原代培養(yǎng)細胞（取材于腫瘤組織的原

9、代培養(yǎng)細胞（hela細胞系）細胞系）p培養(yǎng)過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化的正常細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化的正常細胞細胞株（細胞株（cell strain）：）：用細胞克隆化的方法進一步改用細胞克隆化的方法進一步改 善細胞系的均一性，即分離出單個細胞使之增殖善細胞系的均一性，即分離出單個細胞使之增殖 形成的細胞群。形成的細胞群。 單克隆抗體技術(shù)正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人kohler和milstein 1975將兩種細胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎。第三節(jié)第三節(jié) 細胞組分的分離細胞組分的分離 一、細

10、胞裂解一、細胞裂解在細胞組分分離前，首先破碎細胞，制備細胞裂解液在細胞組分分離前，首先破碎細胞，制備細胞裂解液方法：方法：p 低滲透壓；低滲透壓； p 超聲振蕩；超聲振蕩； p 強制通過微孔；強制通過微孔；p 機械破碎及研磨；機械破碎及研磨；p 反復(fù)凍融反復(fù)凍融 二、細胞二、細胞器及細胞器及細胞組分的分級離心組分的分級離心 (一一)差速離心差速離心（differential centrifugation）方法：方法：從低速到高速逐級沉降。從低速到高速逐級沉降。分離對象：分離對象：體積、質(zhì)量差別較大的顆粒體積、質(zhì)量差別較大的顆粒 。細胞骨架細胞骨架細胞骨架細胞骨架勻漿勻漿離心離心1 000g 20分鐘分鐘細胞核細胞核線粒體等線粒體等離心離心15 000g 120分鐘分鐘微粒體微粒體離心離心0.26%脫氧膽酸鈉脫氧膽酸鈉15 000g 20分鐘分鐘核糖體等核糖體