梁雅芝開(kāi)題報(bào)告書(shū)

1、 本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）開(kāi)題報(bào)告書(shū)探討車前子抗炎有效成分及其作用機(jī)制二級(jí)學(xué)院藥科學(xué)院專 業(yè)藥物制劑（天然藥物制劑方向）班 級(jí)2012級(jí)（1）班學(xué)生姓名梁雅芝學(xué) 號(hào)1203514155指導(dǎo)教師臧林泉2015年 9 月 15 日擬定的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目探討車前子抗炎有效成分及其作用機(jī)制一、選題依據(jù)（包括目的、意義、國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，主要參考文獻(xiàn)）：1、目的與意義：痛風(fēng)病是嘌呤代謝紊亂所致的疾病，以高尿酸血癥、急性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石形成、慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形為臨床特征，病程后期常出現(xiàn)腎尿酸結(jié)石和痛風(fēng)性腎實(shí)質(zhì)病變。研究發(fā)現(xiàn)1,2，車前子多糖(PSP)具有抗炎鎮(zhèn)痛效果。通過(guò)抑制一氧化氮合酶、環(huán)加

2、氧酶的表達(dá)，減少一氧化氮和前列腺素 E2產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮抗炎作用的；且能抑制滑膜炎癥中腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素12等細(xì)胞因子的分泌；對(duì)急性期和晚期炎性反應(yīng)均有抑制作用，表現(xiàn)為減輕炎性因子滲出，抑制白細(xì)胞趨化。痛風(fēng)病治療上以別嘌呤醇、立加利仙為代表藥，但副作用較多，故研究中藥車前子的抗炎鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制為臨床用藥提供理論依據(jù)。2、 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)車前子是車前科植物車前 Plantago asiatica L.或平車前 Plantago depressa wild.成熟的干燥種子，性味甘、寒，入腎、膀胱經(jīng)，具有利水、清熱、明目，祛痰的功效。車前子種皮細(xì)胞壁含有 10%30%黏液質(zhì)，是一種親水性的膠體

3、，屬多糖類物質(zhì)，是車前子有效成分，被稱為車前子多糖(PSP)。車前子多糖具有潤(rùn)腸通便、降血糖、降血脂、抗氧化、抑制抑制平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等功效。近年來(lái)有關(guān)車前子的化學(xué)成分、藥理作用等基礎(chǔ)研究報(bào)道增多，這不僅為闡明其臨床效果提供了依據(jù)，也為開(kāi)發(fā)此藥拓寬了思路。2.1化學(xué)成分研究現(xiàn)代研究表明車前子中含大量粘液質(zhì)，即多糖類化合物及車前子酸、膽堿、腺嘌呤、琥珀酸、蛋白質(zhì)、微量元素等。其中多糖類化合物最為豐富，由木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸等組成的雜多糖，該多糖是一種部分發(fā)酵性膳食纖維，具有整腸通便、調(diào)節(jié)血糖、降低血脂、抗氧化及防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用。但其抗炎和抗腫瘤作用

4、方面的研究甚少3。2.2 藥理作用研究2.2.1緩瀉 車前子多糖是一種親水性黏膠，雙向調(diào)節(jié)作用。付志紅4研究表明大粒車前子多糖能促進(jìn)小鼠小腸的蠕動(dòng)，促進(jìn)排便；明顯增加小腸水分的含量，使腸道容積變大，從而軟化大便，有利于大便的排出，并對(duì)老年小鼠腸粘膜組織的退化具有改善作用。在國(guó)外臨床上作為容積性瀉藥用于便秘和非特異性腹瀉的治療，已列入美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、印度等國(guó)家藥典。2.2.2抗氧化作用 車前子中的多糖、黃酮及麥角甾苷等成分均具有抗氧化作用。周超5，張然6等發(fā)現(xiàn)，車前子多糖對(duì)羥自由基和超氧陰離子有一定的清除作用，可防止體內(nèi)活性氧類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，將有望作為抗衰老劑、抗氧化劑用于臨床及

5、食品加工業(yè)中，并可對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病起到一定的防治作用。2.2.3抗炎作用 車前子多糖具有一定的抗炎作用，對(duì)多種原因造成的炎癥反應(yīng)均有抑制作用。馮娜7研究發(fā)現(xiàn)，車前子多糖在炎癥反應(yīng)初期，能增高血管緊張性、減少充血、改善毛細(xì)血管通透性增加，同時(shí)能夠抑制白細(xì)胞的浸潤(rùn)及吞噬反應(yīng)，減少炎性因子釋放。在炎癥后期，車前子多糖通過(guò)毛細(xì)血管和炎細(xì)胞的增生，抑制肉芽組織增生，防止粘連及瘢痕形成，減少后遺癥。因此，車前子多糖有望成為臨床上輔助治療炎癥的藥物。2.2.4降低血尿酸水平 車前子可降低血尿酸水平對(duì)治療痛風(fēng)也有良效8。車前子有顯著利尿作用，同時(shí)能增加尿酸、尿素及氯化物排泄?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí),車前子、金

6、錢草、茵陳等均有促進(jìn)尿酸排泄,降低血尿酸的作用,從而控制癥狀,減少?gòu)?fù)發(fā)或延長(zhǎng)間竭期。2.3臨床應(yīng)用現(xiàn)代臨床應(yīng)用中，車前子多用于治療慢性氣管炎，急、慢性細(xì)菌性痢疾，高血壓病，糖尿病等。同時(shí)發(fā)現(xiàn)車前子多糖具有免疫抑制活性，可用于治療與免疫炎性損傷相關(guān)的各種疾病，包括腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水腫，以及眼葡萄膜炎、角膜基質(zhì)炎、角膜移植排異反應(yīng)等眼部疾病，但車前子治療痛風(fēng)病的報(bào)道鮮有。車前子與土茯苓、金錢草、合用有顯著利尿作用，同時(shí)能增加尿酸、尿素及氯化物排泄。對(duì)治療痛風(fēng)病有臨床指導(dǎo)意義。但對(duì)于復(fù)方中是哪味中藥又或是哪幾味中藥的共同作用，其機(jī)制尚不是很明確。目前，秋水仙堿是治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的

7、特效藥,該藥使用歷史悠久,在痛風(fēng)急性發(fā)作的內(nèi)服用療效最好。但秋水仙堿的有效劑量與中毒劑量非常接近,有較大的不良反應(yīng),服藥后的患者在臨床癥狀完全緩解之前可有惡心嘔吐、腹痛腹瀉、厭食等,且該藥還可引起白細(xì)胞減少、血小板減少等骨髓抑制表現(xiàn)以及脫發(fā)、肝腎功能損害、精神抑郁等。在治療痛風(fēng)過(guò)程中，抗炎止痛是一個(gè)重要的過(guò)程。應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合方法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎取得了令人滿意的效果。中醫(yī)藥材車前子既有較好的消炎鎮(zhèn)痛作用,又有較好的降血尿酸作用,同時(shí)大大降低了毒副作用,體現(xiàn)了中醫(yī)藥在治療急性痛風(fēng)方面的優(yōu)勢(shì)，這是將來(lái)的研究發(fā)展趨勢(shì)之一。3、參考文獻(xiàn)1 劉強(qiáng), 牟洪波, 劉元祿. 中藥車前子對(duì)小鼠氣囊滑膜炎細(xì)胞因

8、子TNF- 及 IL-12 影響的實(shí)驗(yàn)研究J中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25( 4) : 816-818 2 馮娜,劉芳,郭會(huì)彩,等車前子多糖抗炎作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究J. 天津醫(yī)藥: 2012，40(6)：599-601.3 馮娜車前子多糖的抗炎和抗腫瘤作用研究D河北：河北醫(yī)科大學(xué)，20124 付志紅車前子營(yíng)養(yǎng)與活性成分及其保健功能研究D南昌：南昌大學(xué)，2005.5 周超車前子多糖的分離純化及其功能性質(zhì)研究D南昌：南昌大學(xué)，2007.6 張然, 袁從英, 馮娜,等. 車前子多糖對(duì)糖尿病小鼠氧化應(yīng)激的影響J. 天津醫(yī)藥：2011，39(3)：253-255.7 馮娜車前子多糖的抗炎和抗腫瘤作用研究D

9、河北：河北醫(yī)科大學(xué)，20128 鄢妘痛風(fēng)病的中藥治療及其機(jī)制研究進(jìn)展J. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥: 2010，6(11)：164-166.9 聶少平,殷軍藝,施曉丹,等一種提高車前子多糖黏性的制備方法：中國(guó)，201410390932.1 P. 2014-12-0310 王東車前子多糖的研究D遼寧：遼寧中醫(yī)學(xué)院，200211 馮娜,劉芳,郭會(huì)彩,等車前子多糖抗炎作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究J. 天津醫(yī)藥: 2012，40(6)：599.12 馮娜車前子多糖的抗炎和抗腫瘤作用研究D河北：河北醫(yī)科大學(xué)，2012二、研究?jī)?nèi)容（具體研究/設(shè)計(jì)內(nèi)容，重點(diǎn)解決的問(wèn)題，預(yù)期結(jié)果）：（一）研究?jī)?nèi)容1車前子采用不同提取工藝抗炎有效成

10、分含量差異。2車前子多糖PSP的薄層色譜TLC鑒別。3建立二甲苯致小鼠耳廓腫脹的炎癥模型來(lái)觀察車前子多糖PSP的抗炎作用。4建立冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的炎癥模型來(lái)觀察車前子多糖PSP的抗炎作用。（二）重點(diǎn)解決的問(wèn)題1車前子多糖提取工藝的優(yōu)化。2車前子多糖的抗炎作用及其可能機(jī)制。（三）預(yù)期結(jié)果預(yù)期可以摸索出一個(gè)具有提取率高，操作簡(jiǎn)便的車前子多糖提取工藝，通過(guò)觀察動(dòng)物炎癥模型解釋抗炎作用及可能機(jī)制。三、研究/設(shè)計(jì)方案（包括研究/設(shè)計(jì)方法、技術(shù)路線，理論分析、計(jì)算、實(shí)驗(yàn)方法和步驟及其可行性，可能出現(xiàn)的技術(shù)問(wèn)題及解決辦法）：（一）實(shí)驗(yàn)方案1、車前子粗多糖的提取1.1.水煮法 稱取500g車

11、前子，加入10倍量的蒸餾水于100提取1.5小時(shí)，離心過(guò)濾、收集濾液。濾渣重復(fù)提取1次1小時(shí)，合并濾液后減壓濃縮至一定體積，即得車前子粗多糖樣液。1.1.水提醇沉法 稱取干燥的車前子500g加8倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1天,過(guò)濾,揮干乙醇。于沸水浴下提取 23 小時(shí)，車前子與水的質(zhì)量體積比（kg/L）為 1:101:30，提取液過(guò)濾后收集濾液，濾渣重復(fù)提取 1 次；合并兩次濾液，減壓濃縮，濃縮液中加入乙醇于4靜置12小時(shí)，離心、收集沉淀，沉淀依次用丙酮、無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇各洗滌兩次，經(jīng)冷凍干燥得車前子多糖9。1.1.破壁粉碎法取車前子藥材500g，粉碎破壁成粗粉，過(guò) 20 目篩，采用超聲波提

12、取，以 10 倍的液固比加入 70乙醇，超聲（頻率80KHz) 提取 30min，重復(fù)提取 3 次，抽濾，合并提取液，回收乙醇并濃縮至 1000ml，冷卻至室溫，靜置24小時(shí)，離心甩濾，得澄清濾液。 2、薄層色譜鑒別2. 1 溶液制備 對(duì)照品溶液: 精密稱定對(duì)照品25mg，置于25mL量瓶中,加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為 1mg/m L的溶液作為對(duì)照品溶液。供試品溶液:精密量1制備所得純車前子多糖溶液5mL，置50mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1mL，置100mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。2. 2 薄層層析 吸取上述對(duì)照品

13、溶液和供試品溶液各5L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酷一甲醇一乙酸一水(13:3:3:3)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,涼干,噴以苯胺一鄰苯二甲酸溶液,110烘烤10分鐘至顯色清晰10。3、動(dòng)物造模3.1. 小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn) 采用小鼠二甲苯致炎法。將雌性小鼠隨機(jī)分為5組：每組10只。第1組為陰性對(duì)照組，給予同等容量的生理鹽水；第2 組為陽(yáng)性對(duì)照組，給予阿司匹林200mg/kg；第35 組分別為低、中、高 PSP 劑量組，分別給予400、800及1600mg/kg 的PSP，灌胃給藥，1 次/天，連續(xù)5天，末次給藥 1 h后在小鼠右耳涂 0.03 m L的二甲苯致炎，左耳涂生理鹽水作為自身對(duì)照，

14、涂耳2h后處死。沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑為 6 mm 的穿孔器將兩耳廓同一部位穿孔取下，以腫脹度抑制率作為炎癥腫脹程度的指標(biāo)，腫脹度抑制率（%）=（給藥組腫脹度-對(duì)照組腫脹度）/對(duì)照組腫脹度×100%。3.2 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn) 采用醋酸致炎法。動(dòng)物分組、給藥劑量、給藥途徑同小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)，末次給藥1 h后，尾靜脈按10 L/g注射0. 5%伊文斯藍(lán)溶液，隨即腹腔注射等量的0.6%冰醋酸致炎，20 min后脫臼處死，腹腔注射6 m L 生理鹽水洗滌并取出洗滌液，3000 r/min 離心15min，取上清液用紫外分光光度計(jì)，在590 nm測(cè)定光密度（OD）值，以反映小鼠腹

15、腔透出伊文思藍(lán)的含量11,12。（二）計(jì)算腫脹度抑制率（%）=（給藥組腫脹度-對(duì)照組腫脹度）/對(duì)照組腫脹度×100%。（三）可行性分析1.本課題在立題期間通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，歸納出三種提取工藝及有效的動(dòng)物炎癥模型的建立，且實(shí)驗(yàn)步驟較簡(jiǎn)單，成功率較高。2.實(shí)驗(yàn)人員方面，有經(jīng)驗(yàn)豐富的藥理老師進(jìn)行指導(dǎo)，并有優(yōu)秀的研究生師姐師兄以供咨詢，保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。3.原料供需方面，本實(shí)驗(yàn)所需原料容易獲得；所需儀器為實(shí)驗(yàn)室常備器材，準(zhǔn)備充分。綜上所述，本課題具有可行性。（四）可能出現(xiàn)的技術(shù)問(wèn)題及解決辦法可能出現(xiàn)的技術(shù)問(wèn)題：最佳提取工藝條件的確定，車前子多糖主要位于車前子種皮層，其提取率受很多因素的

16、影響。解決方法：通過(guò)三種提取工藝的變化，進(jìn)行多次試驗(yàn)，進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，探索優(yōu)化提取工藝四、創(chuàng)新之處：五、工作基礎(chǔ)及條件：工作基礎(chǔ)：充分查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，參考前人實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)以探索車前子抗炎有效成分的提取工藝和解釋抗炎機(jī)制；經(jīng)驗(yàn)豐富的老師的指導(dǎo)和建議。所需試劑：70%乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇、二甲苯、冰醋酸、NaCl 溶液、0. 5%伊文斯藍(lán)溶液 所需儀器：葡聚糖凝膠柱、硅膠G薄層板、紫外分光光度計(jì)、破壁粉碎機(jī)器、穿孔器畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）工作計(jì)劃時(shí) 間工 作 內(nèi) 容預(yù) 期 結(jié) 果2015.11.24-2015.12.042015.12.05-2016.01.152016.01.16-2016.02.162016.02.17-2016.03.172016.03.17-2016.04.102016.04.10-2016.05.10查閱文獻(xiàn)、綜合歸納資料、確定試驗(yàn)方案、撰寫(xiě)開(kāi)題報(bào)告。預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步摸索出車前子多糖的提取工藝。通過(guò)探索，不斷優(yōu)化提取工藝，并對(duì)其有效物質(zhì)進(jìn)行薄層色譜鑒定。建立動(dòng)物炎癥模型來(lái)觀察車前子多糖 PSP 的抗炎作用。