紫外光譜在醫(yī)藥方面的研究

1、 紫外光譜在醫(yī)藥方面的研究鍵入文檔副標(biāo)題高慧20120128702014/6/4紫外光譜在醫(yī)藥方面的研究 高慧東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院摘 要： 闡述了幾種紫外光譜在醫(yī)學(xué)技術(shù)（金屬蛋白）及中藥（大黃等）上的應(yīng)用實(shí)例關(guān)鍵詞： 紫外光譜 醫(yī)藥 應(yīng)用前 言: 紫外吸收光譜是由于分子中價(jià)電子的躍遷而產(chǎn)生的。分子中價(jià)電子經(jīng)紫外或可見光照射時(shí)，電子從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)，此時(shí)電子就吸收了相應(yīng)波長(zhǎng)的光，這樣產(chǎn)生的吸收光譜叫紫外吸收光譜目前使用的紫外光譜儀波長(zhǎng)范圍是200800nm.其基本原理是用不同波長(zhǎng)的近紫外光(200400nm)依次照一定濃度的被測(cè)樣品溶液時(shí),就會(huì)發(fā)現(xiàn)部分波長(zhǎng)的光被吸收。如果以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)(單位

2、nm),吸收度(absorbance)A為縱坐標(biāo)作圖,即得到紫外光譜 近年來(lái),紫外光譜法已成為中藥分析研究中主要的儀器分析法之一14,從原始光譜鑒別發(fā)展到導(dǎo)數(shù)光譜、多波長(zhǎng)光譜鑒別,從單一藥材或純組分分析拓展到復(fù)方組分分析。紫外光譜在中藥方面應(yīng)用越來(lái)越廣，下面介紹幾例利用紫外光譜的研究。一 紫外光譜研究中藥大黃有效成分與牛血清白蛋白的相互作用中藥大黃的藥理作用非常廣泛,具有瀉下、健胃、抗菌、保肝、強(qiáng)心、降壓等三十多種功效。其主要活性成分有大黃素(emodin)、大黃酸(rhein)、大黃酚(chrysophanol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)和大黃素甲醚(emodin-monomet

3、hyl ether)1。為了研究大黃類有效成分在體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,開展其與血清蛋白的相互作用研究有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用紫外光譜法對(duì)大黃素、大黃酸和大黃酚與牛血清白蛋白(bovineserum albumin, BSA)的相互作用進(jìn)行了研究,并對(duì)結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了探討,獲得了滿意的測(cè)量靈敏度,為藥物與蛋白質(zhì)的相互作用研究提供了一種快速、簡(jiǎn)便、可行的方法。 大黃素、大黃酸和大黃酚均難溶于中性水溶液,但均溶于乙腈。故實(shí)驗(yàn)采用含20%乙腈的硼砂(0.025 mol/L)緩沖液,pH9.24。對(duì)緩沖液從200700 nm進(jìn)行吸收光譜的掃描,以去離子水作參比,波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)明顯吸收。各物質(zhì)濃度見表1?；旌弦?/p>

4、在室溫下混合均勻,放置過(guò)夜以保證結(jié)合反應(yīng)已完全平衡。在BSA濃度是唯一可變參數(shù)的條件下,通過(guò)測(cè)量藥物從200700 nm的峰值吸收變化反映藥物與BSA的相互作用。實(shí)驗(yàn)采用紫外光譜法實(shí)現(xiàn)了對(duì)大黃素、大黃酸和大黃酚與BSA結(jié)合常數(shù)的測(cè)定,分別為K=1.47105,K=5.00105,K=1.18104。大黃酸和大黃酚與BSA相互作用的研究筆者尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,大黃素與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)與文獻(xiàn)值較一致,表明該方法準(zhǔn)確可行,是藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中較易實(shí)現(xiàn)的方法,而且也拓展了紫外可見光譜法的應(yīng)用。進(jìn)一步對(duì)大黃類有效成分與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)制進(jìn)行了探討,大黃類有效成分與BSA的結(jié)合能力隨其所含極性基

5、團(tuán)的增多而增強(qiáng)。 用紫外光譜法研究中草藥有效成分與血清蛋白質(zhì)的相互作用時(shí),中草藥有效成分具有較大的摩爾吸光系數(shù),與生命分子結(jié)合后這種具有較大摩爾吸光系數(shù)的組分會(huì)出現(xiàn)可被儀器正確識(shí)別的吸光下降。因此可用紫外光譜法研究中草藥有效成分與生命分子的相互作用,這不僅拓展了紫外可見光譜法的應(yīng)用,也打破了不易使用其他儀器方法開展相互作用研究的局限性。二 紫外光譜在天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用黃酮類、蒽醌衍生物、皂甙以及香豆素類化合物廣泛分布于植物藥中,它們的藥理作用多種多樣,其結(jié)構(gòu)類型也是多種多樣根據(jù)理論和實(shí)踐,對(duì)應(yīng)用紫外光譜,區(qū)別上述天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型以及判斷取代基位置和數(shù)目,簡(jiǎn)單做一綜述。1.黃酮類黃酮類化

6、合物屬于一個(gè)完整的共軛體系,在無(wú)水甲醇中的紫外光譜有兩個(gè)主要吸收峰,峰是由黃酮基本結(jié)構(gòu)中的B環(huán)和丙酰側(cè)鏈(即桂皮酰系統(tǒng))引起的,峰是由A環(huán)和側(cè)鏈(即苯甲酰系統(tǒng))引起的,各類黃酮因基本母核的差異,使帶和帶的吸收強(qiáng)度有明顯的差異,根據(jù)帶和帶的位置和強(qiáng)度,可大致區(qū)別黃酮的種類。黃酮母核上最常見的取代基是羥基,在特定的位置,可與三氯化鋁或硼酸絡(luò)合,引起相應(yīng)的吸收帶紅移,不穩(wěn)定的絡(luò)合物,加鹽酸后解離,使紅移消失,據(jù)此,可推測(cè)出羥基取代的的位置和數(shù)目。甲醇鈉和醋酸鈉是兩種堿性試劑,能使黃酮母核上的酚羥基解離,影響吸收峰紅移;其中,醋酸鈉堿性較弱,只影響酸性較強(qiáng)的酚羥基,據(jù)此,可判斷羥基取代情況;如果存在對(duì)

7、堿敏感的體系(特定位置的羥基取代),容易在堿性條件下氧化破壞,光譜圖上的吸收峰隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而衰退。在實(shí)際測(cè)定工作中,先測(cè)定樣品“無(wú)水甲醇”光譜,然后加入適當(dāng)?shù)脑噭?通過(guò)吸收峰的紅移與結(jié)構(gòu)之間的規(guī)律性,進(jìn)行對(duì)比分析,能較快的推測(cè)出樣品的大致結(jié)構(gòu),其主要判斷規(guī)律如下2. 蒽醌衍生物用乙醇作溶劑,蒽醌的苯樣結(jié)構(gòu)在紫外光譜上給出252nm(lgE=4.7),325nm(lgE=3.7)的吸收峰,醌樣結(jié)構(gòu)給出272nm(lgE=4.3)的吸收峰。羥基蒽醌除引起上述吸收峰的變化,另外在230±10nm的范圍內(nèi)有一強(qiáng)吸收峰,在400nm以上,由羰基結(jié)構(gòu)引起一吸收峰,所以羥基蒽醌有5個(gè)吸收譜帶。羥

8、基蒽醌如只在A位上有羥基,苯樣結(jié)構(gòu)吸收峰的峰位紅移,但強(qiáng)度降低;羥基蒽醌如只在B位上有羥基,苯樣結(jié)構(gòu)和醌樣結(jié)構(gòu)的吸收峰均紅移、峰強(qiáng)度均增加。這是由于A位或B位上連有羥基,相當(dāng)于在苯環(huán)上加一助色團(tuán),必然引起苯樣結(jié)構(gòu)吸收峰的紅移;當(dāng)羥基連于B位上時(shí),通過(guò)氧上孤對(duì)電子的轉(zhuǎn)移,可與醌樣結(jié)構(gòu)形成一個(gè)穩(wěn)定的共振系統(tǒng),相當(dāng)于增長(zhǎng)了醌樣結(jié)構(gòu)的共軛鏈,所以能引起醌樣結(jié)構(gòu)吸收峰的紅移和增色效應(yīng)5。無(wú)論羥基位于A或B位,羥基數(shù)目越多,紅移越明顯。苯樣結(jié)構(gòu)給出的吸收峰(305389nm)受供電子基影響,其規(guī)律是,當(dāng)A位上有甲基、羥基、甲氧基時(shí),峰位向紅移動(dòng),但強(qiáng)度降低,而當(dāng)取代基處于B位時(shí),則吸收強(qiáng)度增高。醌樣結(jié)構(gòu)中

9、的羰基在可見光區(qū)可引起吸收,AOH與羰基相互作用,極大地影響Kmax,AOH數(shù)目越多,Kmax紅移越大,其規(guī)律見表5上類化合物,母體結(jié)構(gòu)在紫外上有顯著的特征吸收峰,取代基的存在及位置又影響吸收峰的位置,由此可獲得結(jié)構(gòu)信息。在實(shí)際測(cè)定工作中,加入適當(dāng)?shù)脑噭?通過(guò)吸收峰的位移與結(jié)構(gòu)之間的規(guī)律性,進(jìn)行對(duì)比分析,能較快的推測(cè)出樣品的大致結(jié)構(gòu),但其他天然產(chǎn)物如生物堿、糖苷、萜類、鞣質(zhì)等能從紫外光譜上獲得的結(jié)構(gòu)信息就比較少。三 紫外光譜在金屬-蛋白的金屬中心結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用的實(shí)例 研究金屬-蛋白的金屬中心結(jié)構(gòu)是探討金屬離子在體內(nèi)的生理功能或毒理效應(yīng)的基礎(chǔ)。許多金屬-蛋白體系在紫外區(qū)均顯示LMCT (liga

10、nd to metal charge transfer)型電荷轉(zhuǎn)移譜帶。紫外區(qū)LMCT型譜帶的吸收很強(qiáng)(消光系數(shù)通常在104mol-1左右),容易觀察,特別適合于研究濃度較低的生化體系。下面是我們用紫外光譜進(jìn)行金屬-血清白蛋白結(jié)構(gòu)研究的幾個(gè)實(shí)例,以證明這種光譜應(yīng)用于金屬-蛋白的金屬中心結(jié)構(gòu)研究的有效性。1.紫外光譜測(cè)試將金屬離子溶液和HSA (human serum albumin,人血清白蛋白)或BSA (bovine serumalbumin,牛血清白蛋白)溶液按1÷1或n÷1摩爾比混合,即得金屬-血清白蛋白試樣。用相同條件下相同濃度的HSA或BSA溶液為參比,測(cè)定試樣

11、的紫外光譜,得到反映金屬-血清白蛋白配合物金屬中心結(jié)構(gòu)信息的LMCT譜帶。2.紫外光譜特征及結(jié)論 Cu()-HSA、Cu()-BSA和Ni()-BSA體系生理pH下,1÷1摩爾比的Cu()-HSA、Cu()-BSA和Ni()-BSA體系的LMCT譜帶均由較低濃度時(shí)的三個(gè)峰轉(zhuǎn)變?yōu)檩^高濃度(大于2.5×10-4molõL-1)的一個(gè)峰(圖2為Cu ()-BSA的UV光譜)。根據(jù)這一光譜特征并結(jié)合分子軌道理論,推斷:這三種配合物的金屬中心均位于白蛋白分子的N-端三肽段上,且均由較低濃度時(shí)五配位四方錐構(gòu)型M() N4O,M=Cu、Ni轉(zhuǎn)變成較高濃度時(shí)的四方平面構(gòu)型M()N

12、4。根據(jù)這種體系的光譜數(shù)據(jù),利用前面的公式(1)計(jì)算,并討論了Cu2+、Ni2+和有關(guān)配體軌道的光學(xué)電負(fù)性,第一次提供了HSA中A1sp羧基氧參與Cu()配位的證據(jù)3,4。在HSA或BSA的等離子點(diǎn)(分別是pH5.2和5.3)附近pH5.3處,上述三個(gè)體系的紫外光譜特征與生理pH的比較發(fā)生了較顯著的變化(圖略)。我們推斷: pH=4.05.3時(shí),除Cu() -HSA體系在低于4.0×10-4molõL-1時(shí)金屬中心以五配位的四方錐Cu()N4O構(gòu)型存在外,Cu()-BSA、Ni()-BSA及濃度高于4.0×10-4molõL-1的Cu()-HSA均以四方

13、平面M()N4構(gòu)型存在。用pH效應(yīng)可解釋等離子點(diǎn)時(shí)與生理pH下金屬中心結(jié)構(gòu)的變化5 Ni()-HSA體系根據(jù)紫外光譜和平衡透析的研究結(jié)果,我們首次報(bào)道生理pH下Ni()-HSA配合物中存在兩個(gè)金屬中心,且它們的LMCT譜帶有接近100%的減色效應(yīng)(hypochromism)。第一個(gè)金屬中心位于HSA的A1sp-Ala2-His3-肽段,隨著Ni()-HSA濃度的升高,該金屬中心發(fā)生從6-D4h八面體(<1.4×10-4molõL-1)C4v四方錐(1.42.3×10-4molõL-1)4-D4h四方平面的構(gòu)型轉(zhuǎn)變;第二個(gè)金屬中心位于-Ala8-His9-Arg10-肽段上,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),它始終取4-D4h四方面平構(gòu)型。我們認(rèn)為Ni ()-HSA體系的LMCT譜帶的減色效應(yīng)是因這兩個(gè)金屬中心躍遷矩的偶極-偶極相互作用所致。通過(guò)對(duì)這種減色效應(yīng)進(jìn)行初步的定量處理,發(fā)現(xiàn)LMCT躍遷也有基于偶極-偶極相互作用的減色效應(yīng),并且可以接近完全參考文獻(xiàn)1 周永恰 紫外光譜在金屬-蛋白的金屬中心結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用的若干實(shí)例* 1997.22 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所植物化學(xué)研究室編譯.黃酮體化合物鑒定手冊(cè)M.北京:科學(xué)出版社,1981.496,649.3 黃君禮,鮑治宇編著.紫