白血病融合基因檢測綜述20130105

1、白血病相關(guān)融合基因的檢測及意義白血病是造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，由于造血干細(xì)胞受損，導(dǎo)致克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。白血病細(xì)胞具有自我更新增強(qiáng)、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等特點(diǎn)，患者會出現(xiàn)不同程度的貧血、出血、感染和浸潤的臨床癥狀，嚴(yán)重危害生命健康。近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識到大部分的白血病中都存在著包括缺失、重復(fù)、易位等染色體畸變，導(dǎo)致原癌基因或抑癌基因結(jié)構(gòu)變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白。現(xiàn)有報道的染色體畸變已有五十種以上，累及更多數(shù)目的融合基因，這些異常已經(jīng)逐漸成為不同類型白血病的

2、分子生物學(xué)特異性標(biāo)志。白血病相關(guān)融合基因的種類多樣，常見的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RAR、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBF-MYH11等。BCR（breakpoint cluster region）基因是BCR-ABL融合基因的組成部分，與費(fèi)城染色體（Philadelphia Chromosome）的形成有關(guān)，具有兩種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。正常的BCR基因編碼產(chǎn)物的功能還尚未清楚，它編碼的蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是編碼細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基因

3、，與細(xì)胞分化、細(xì)胞分裂、細(xì)胞粘附、應(yīng)激反應(yīng)等生命活動相關(guān)?；罨腁BL1蛋白通過SH3結(jié)構(gòu)域受到負(fù)調(diào)控，SH3結(jié)構(gòu)域的缺失會導(dǎo)致ABL1基因轉(zhuǎn)化為癌基因。CDC2介導(dǎo)的磷酸化能夠調(diào)節(jié)ABL1酪氨酸激酶的DNA結(jié)合活化過程，表明ABL1可能在細(xì)胞周期中發(fā)揮作用。Nowell及Hungerford于1960年發(fā)現(xiàn)在慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML）患者外周血中有一個比G組染色體還小的近端著絲粒染色體，由于首先在美國費(fèi)城（Philadelphia）發(fā)現(xiàn)，故命名為費(fèi)城染色體。1971年ORiordon利用熒光顯帶法確認(rèn)費(fèi)城染色體是第22號染色體長臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley發(fā)現(xiàn)缺失下來的那

4、部分通常易位到9號染色體長臂的末端，形成t（9；22）（q34；q11）。1982年Deklein等在費(fèi)城染色體上首次發(fā)現(xiàn)了原來位于9號染色體長臂末端（9q34）的癌基因ABL1，證明費(fèi)城染色體上有來自9號染色體長臂末端的片端，是22號染色體與9號染色體相互易位的產(chǎn)物。易位使9號染色體長臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22號染色體（22q11）上的BCR基因重新組合成融合基因，因而稱為BCR-ABL融合基因。BCR-ABL融合基因編碼的融合蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，改變細(xì)胞多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平和細(xì)胞微絲機(jī)動蛋白的功能，擾亂細(xì)胞內(nèi)正常的信號傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞失去了對周圍環(huán)境的反應(yīng)性，

5、并抑制凋亡的發(fā)生，影響細(xì)胞周期調(diào)控，導(dǎo)致骨髓造血干細(xì)胞過度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常見有四種剪接體mRNA：編碼P210融合蛋白的b2a2和b3a2，編碼P190的e1a2，編碼P230的e19a2。其中b3a2和 b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)中出現(xiàn)，而出現(xiàn)較少的e19a2根據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織（WHO）最新版的血液系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，也應(yīng)被診斷為CML。90%以上的CML患者血細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有費(fèi)城染色體的存在，主要為P210融合蛋白，因而費(fèi)城染色體和BCR-ABL融合基因可以作為區(qū)分典型CML和非典型CML的診斷指標(biāo)。同時在費(fèi)城染色體陽性

6、的ALL患者中，65%的成人和80%的兒童能夠檢測到P190融合蛋白陽性。由于BCR-ABL融合蛋白能夠收到多種小分子化合物的抑制，臨床上第一代針對BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶小分子抑制劑（TKI）伊馬替尼就是是通過結(jié)合抑制BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域來抑制其在細(xì)胞周期中的影響，從而發(fā)揮抗白血病作用的。第二代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼和尼洛替尼也是在這個基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以以減少因伊馬替尼使用而帶來的抗藥性。對費(fèi)城染色體和BCR-ABL融合基因的檢測，對于正確區(qū)分CML類型，指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后情況具有重要的指導(dǎo)作用。RUNX1（Runt-related tran

7、scription factor 1）基因也被稱為AML1（acute myeloid leukemia 1）基因或 CBFA2（core-binding factor subunit alpha-2）基因，RUNX1基因編碼的RUNX1蛋白是調(diào)控造血干細(xì)胞分化為成熟血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，是RUNX（Runt-related transcription factor）家族或CBF（core binding factor-）的成員，能夠與CBF蛋白形成異質(zhì)二聚體復(fù)合物，增強(qiáng)DNA結(jié)合和復(fù)合物的穩(wěn)定性。人的RUNX1基因全長260kb，在21號染色體（21q22.12）上，有兩個選擇性轉(zhuǎn)錄啟動子，能夠

8、通過選擇性剪接形成多種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。全長的RUNX1蛋白由12個外顯子編碼形成，在這些外顯子中，包含有兩個結(jié)構(gòu)域，分別被命名為RHD（runt homology domain）和TAD（transactivations domain），前者由2,、3、4號外顯子編碼形成，后者由6號外顯子編碼形成。RUNX1蛋白分別通過這些結(jié)構(gòu)域來介導(dǎo)DNA結(jié)合和蛋白間相互作用。RUNX1的轉(zhuǎn)錄過程受兩個增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)，這些組織特異性的增強(qiáng)子能夠結(jié)合淋系或紅系調(diào)控蛋白，促進(jìn)RUNX1基因在造血系統(tǒng)中的高度活化。RUNX1在胚胎發(fā)育的造血過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在所有的造血部位都有表達(dá)，能促進(jìn)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)

9、胞的形成。在分子水平，RUNX1基因通過結(jié)合血小板生成素TPO（thrombopoietin）受體c-Mpl的啟動子，募集轉(zhuǎn)錄活化子或抑制子，進(jìn)而促進(jìn)造血干細(xì)胞的生成或向其他造血細(xì)胞方向分化。RUNX1還能夠通過上調(diào)Smad6的表達(dá)來促進(jìn)蛋白體降解。ETO基因又稱RUNX1T1基因，編碼的蛋白是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子和癌蛋白。AML1-ETO融合基因主要見于急性髓系白血?。ˋML）患者中，t（8；21）（q22；q22）染色體易位導(dǎo)致21號染色體的原癌基因AML1基因和8號染色體的ETO基因融合，形成AML1-ETO和ETO-AML1融合基因。ETO-AML1不能通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測

10、到，一般被認(rèn)為其表達(dá)量極低或由于降解導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定。AML1-ETO融合基因表達(dá)的蛋白全長含有752個氨基酸，其N端為RUNX1（runt-related transcription factor 1），也稱AML1區(qū)；C端是8號染色體編碼的RUNX1T1runt-related transcription factor 1; translocated to, 1 (cyclin D-related)，也稱ETO。AML1-ETO融合基因主要發(fā)生在M2型AML患者中（約40%），在M2b的陽性率達(dá)90%，因而可以作為M2b分型診斷的重要分子標(biāo)志，少見于M4和M1，極少數(shù)骨髓增生異常綜合癥（my

11、elodysplastic syndrome, MDS）患者中也有AML1-ETO融合基因的存在。臨床上將AML1-ETO融合基因作為分子分型診斷和預(yù)后觀察的一個重要依據(jù)，AML1-ETO融合基因陽性的患者預(yù)后較好。AML1-ETO陽性的白血病細(xì)胞有一定程度的分化能力，能分化為較成熟的嗜中性粒細(xì)胞核嗜酸性粒細(xì)胞，對化療反應(yīng)較為敏感，因而AML1-ETO融合基因陽性的患者采用大劑量的阿糖胞苷治療，完全緩解率高達(dá)98%，5年存活率達(dá)到67%，預(yù)后較除M3外的其他亞型好。因而對初診患者的AML1-ETO融合基因檢測，對預(yù)后判斷和治療方案的制定具有重要意義。PML（Promyelocytic leuk

12、emia）基因編碼的PML蛋白，屬于TRIM（tripartite motif）家族的成員，定位在核小體上，具有轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤抑制蛋白的功能。PML的表達(dá)與細(xì)胞周期有關(guān)，能夠調(diào)節(jié)p53對致癌信號的反應(yīng)。RAR（Retinoic acid receptor alpha，維甲酸受體）也叫NR1B1（nuclear receptor subfamily 1， group B， member 1）基因，能編碼細(xì)胞核受體蛋白。維甲酸信號由兩種細(xì)胞核受體家族轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別是RAR（retinoic acid receptor）和RXR (retinoid X receptor)，兩者能夠結(jié)合形成RXR/RAR

13、異質(zhì)二聚體。在沒有配體存在的情況下，DNA結(jié)合的RXR/RAR復(fù)合物通過募集共阻遏物NCOR1、NCOR2（SMRT）和組蛋白脫乙酰基酶來抑制轉(zhuǎn)錄過程的進(jìn)行；當(dāng)配體結(jié)合到復(fù)合物時，就能夠誘導(dǎo)構(gòu)像發(fā)生改變，允許募集共活化物、組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，使轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行下去。PML-RAR融合基因是急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia， APL）的特異性分子標(biāo)志，見于98%的APL患者中。APL患者的特異性細(xì)胞遺傳學(xué)異常 t（15；17）（q22；q21），導(dǎo)致15號染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病基因（PML）和17號染色體上的維甲酸受體（RAR）形成PML-RAR融合

14、基因。正常的RAR等位基因編碼野生型維甲酸受體，與維甲酸結(jié)合可以調(diào)節(jié)多個靶基因的轉(zhuǎn)錄。PML是POD（PML oncogenic domain）多蛋白復(fù)合體的核心組分，通過轉(zhuǎn)錄共激活作用，可以抑制腫瘤生長，在多種凋亡途徑中起重要作用。形成PML-RAR融合基因后，維甲酸核受體基因表達(dá)受抑制，使維甲酸對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能喪失；PML-RAR融合蛋白通過負(fù)顯性抑制作用抑制早幼粒細(xì)胞分化成熟；PML去定位使POD的結(jié)構(gòu)破壞，形成上百個細(xì)小顆粒分布在核及胞質(zhì)中，正常的抑制增殖和促凋亡功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)胞大量增殖，凋亡減少，這些導(dǎo)致了APL的發(fā)生。形成PML-RAR融合基因的RAR部分?jǐn)嗔盐稽c(diǎn)位于2

15、號內(nèi)含子上，而PML部分的斷裂位點(diǎn)有三種，因此將PML-RAR融合基因分為三類：1）PML斷裂位點(diǎn)在6號內(nèi)含子上的BCR1型（L型），占APL患者的55%；2）PML斷裂位點(diǎn)在6號外顯子上的BCR2型（V型），占APL患者的5%；3）PML斷裂位點(diǎn)在3號內(nèi)含子上的BCR3型（S型），占APL患者的40%。由于PML-RAR融合基因與APL發(fā)生的重要相關(guān)性，臨床上已經(jīng)將PML-RAR融合基因作為動態(tài)評估患者病情及預(yù)后的重要依據(jù)。E2A基因編碼蛋白能夠與NeuroD形成二聚體復(fù)合物，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄過程。PBX1（Pre-B-cell leukemia transcription factor

16、1）基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子PBX1能夠與HOXB1、MEIS1和HOXB7等蛋白相互作用，形成復(fù)合物，結(jié)合到DNA上，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄過程的進(jìn)行。臨床中發(fā)現(xiàn)的E2A-PBX1融合基因是由t（1；19）（q23；p13）易位形成的，編碼的融合蛋白中E2A氨基端轉(zhuǎn)錄活化域結(jié)合到PBX1同源結(jié)構(gòu)域蛋白的DNA結(jié)合域上，是急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）中常見的染色體畸變，見于3-5%的兒童ALL患者和3%左右的成人前B-ALL患者中，在兒童前體B細(xì)胞ALL（precursor-B ALL）患者中20-25%可以檢測到E2A-PBX1融合基因陽性。E2A基因13號外顯子和PBX1的2號外顯子斷裂后相連接，形成E2A-

17、PBX1融合基因，同時在5-10%的E2A-PBX1融合基因陽性患者中發(fā)現(xiàn)連接點(diǎn)處有27個核苷酸的突變，編碼出兩種不同的蛋白P85和fy77，兩者只在PBX1部分的羧基端存在差異，并都具有轉(zhuǎn)化特性，屬于癌蛋白。近年來隨著化療方案的改進(jìn)，對于E2A-PBX1融合基因陽性的ALL兒童采用更強(qiáng)烈的化療方案，可以改善其預(yù)后，5年無病生存率（EFS）已達(dá)89.5%。E2A-PBX1融合基因陽性和預(yù)后關(guān)系不明顯，但是可以作為ALL和微小殘留病變（MRD）診斷分子標(biāo)志。DEK癌基因編碼的蛋白具有一個SAP結(jié)構(gòu)域，該蛋白能夠結(jié)合到十字形和超螺旋DNA上，誘導(dǎo)閉環(huán)DNA出現(xiàn)超螺旋結(jié)構(gòu)，并且與mRNA形成中剪接位

18、點(diǎn)的選擇密切相關(guān)。該區(qū)域的染色體異常會增加DEK基因的表達(dá)，產(chǎn)生針對DEK蛋白的抗體，引起多種疾病。CAN基因又稱為Nup214（Nuclear pore complex，核孔復(fù)合物）基因，它編碼的核孔復(fù)合物蛋白是延伸通過核膜的主要結(jié)構(gòu)，形成一個能夠調(diào)節(jié)大分子在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間流通的通道。CAN基因編碼的蛋白定位在核孔復(fù)合物的細(xì)胞質(zhì)一面，是細(xì)胞周期和核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)正常運(yùn)行的必要調(diào)節(jié)。DEK-CAN融合基因是由Von Lindern等人在1990年研究發(fā)現(xiàn)的t（6；9）（p23；q34）易位，導(dǎo)致6號染色體上的DEK基因和9號染色體上的CAN基因融合形成的。CAN基因的3部分和DEK基因的5部分發(fā)生

19、融合，在6號染色體短臂上產(chǎn)生DEK-CAN融合基因，轉(zhuǎn)錄形成一個異常的5.5kb的mRNA。DEK-CAN融合基因主要見于急性髓系白血?。ˋML）的M2型和M4型中，也見于M1型，且常常是唯一存在的核型，發(fā)生率為0.5%4%，這種異常也存在于MDS的難治性貧血伴原始細(xì)胞增多癥（RAEB）中。伴有這種染色體異常的患者的年齡一般比較輕，且預(yù)后較差。對于DEK-CAN融合基因的檢測，有助于輔助診斷分型和判斷預(yù)后。SIL-TAL1融合基因僅見于急性T淋巴細(xì)胞白血病中（T-ALL），約占26%，由1p32的部分缺失形成，是T-ALL的特異性克隆標(biāo)志，是兒童T-ALL患者中最為常見的一類染色體異常，在兒童

20、患者中出現(xiàn)的頻率要遠(yuǎn)高于成人患者。由TAL1基因的5端丟失，與SIL基因的5端融合，形成SIL-TAL1融合基因，TAL1編碼序列在SIL啟動子的調(diào)控下在T細(xì)胞中表達(dá)。SIL基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA存在于整個細(xì)胞周期中，其編碼的含有1283個氨基酸的胞質(zhì)蛋白，在細(xì)胞進(jìn)入G2期時積累，在細(xì)胞周期完成時降解。而SIL-TAL1融合基因的形成，引起了細(xì)胞周期調(diào)控的異常，導(dǎo)致白血病的發(fā)生。臨床上SIL-TAL1融合基因的檢測可以輔助分型診斷和MRD的監(jiān)測。CBF（Core-binding factor subunit beta）基因編碼的蛋白是二聚體核結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的beta亞基，屬于PEBP2/CBF轉(zhuǎn)

21、錄因子家族，基因特異性的調(diào)控造血過程和成骨作用的進(jìn)行。CBF蛋白亞基是一個非DNA結(jié)合亞基，它通過別構(gòu)作用增強(qiáng)DNA和alpha亞基的結(jié)合，并使結(jié)合后的復(fù)合物結(jié)合到多種增強(qiáng)子和啟動子的核心區(qū)。CBF基因能夠選擇性剪接形成兩種mRNA，每種編碼不同的羧基末端。MYH11基因編碼的myosin-11蛋白是一種平滑肌肌球蛋白，屬于肌球蛋白重鏈家族，是一個包含2條重鏈亞基和2對輕鏈亞基的六聚體蛋白亞基，能夠通過ATP的水解來將化學(xué)能量轉(zhuǎn)換為動能。CBF-MYH11融合基因是在多為AML-M4伴嗜酸性細(xì)胞增多癥，但亦可見于其他類型，如M1、M2、M4、M5、M7和慢性髓系白血病(CML)急變，是由inv

22、（16）（p13；q22）導(dǎo)致16號染色體長臂的核心結(jié)合因子（CBF）鏈基因和短臂的MYH11基因發(fā)生融合形成的，見于8-9%的初診AML患者中。它具有CBF-MYH11和MYH11-CBF兩種形式的融合基因，其中前者對M4EO的致病可能具有重要作用。研究顯示CBF基因的斷裂位點(diǎn)靠近3端編碼區(qū)的17個氨基酸處，而MYH11基因的斷裂點(diǎn)存在著至少3種不同的方式，能形成10種以上的不同剪接體重排，同時這些重排仍然保持著融合基因轉(zhuǎn)錄本的開放閱讀框，常見的三種剪接體為A型，D型和E型。85%的CBF-MYH11融合基因陽性患者為A型，D型和E型各占5%。CBF-MYH11融合基因的產(chǎn)生能夠促進(jìn)白血病的

23、發(fā)生，但是含有CBF-MYH11融合基因的M4EO白血病患者預(yù)后較好。研究表明CBF-MYH11融合基因在患者治療緩解后可以消失，所以該基因可以用于MRD的檢測和預(yù)后判斷。MLL（Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia）基因編碼轉(zhuǎn)錄共激活物，是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠正調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程，對早期發(fā)育過程的基因表達(dá)和造血功能具有不可缺少的作用。雖然ML的功能仍有很多未能研究清楚，但是已有報道表明MLL在發(fā)育過程的細(xì)胞分裂中起著核心作用。同時MLL還是HOX基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，HOX基因在造血生成中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，當(dāng)MLL蛋白功能異常時，HOX基因表

24、達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響正常造血功能。混合譜系白血?。∕ixed Lineage Leukemia，MLL）基因重排發(fā)生在11號染色體2區(qū)3帶，MLL蛋白包括三個功能區(qū)，分別是轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)。MLL基因重排使得AT鉤區(qū)和鋅指結(jié)構(gòu)之間的序列發(fā)生斷裂，在DNA修復(fù)時與其他基因發(fā)生融合。MLL基因重排涉及五十余種染色體易位，產(chǎn)生不同的融合基因，常見的MLL重排形成的融合基因有MLL-AF4、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-F10、MLL-ENL、MLL-ELL等。MLL-AF4融合基因由t（4；11）（q21；q23）易位形成，是前B-ALL中最為常見的11q23易位，由MLL

25、和AF4基因融合形成，具有6種不同的剪接體，分別為e9e5、e9e4、e10e5、e10e4、e11e5、e11e4。MLL-AF4融合基因在不同年齡段的發(fā)生率不同，嬰兒ALL中最多見，發(fā)生率為40-60%，在兒童和成人中較低，約為5%。在嬰兒ALL中檢測出MLL-AF4提示預(yù)后良好，而相反若在成人ALL中檢測出MLL-AF4則提示預(yù)后較差。在小兒ALL中出現(xiàn)MLL-AF4時，年齡的不同預(yù)后并不一致。MLL-AF6 融合基因由t(6;11)(q27;q23)易位形成，主要發(fā)生在AML的M4和M5a分型中，在兒童AML患者中的比例為2-5%，成人患者中較少出現(xiàn)。MLL-AF9融合基因由t(9;1

26、1)(p22;q23)易位形成，是11q23異常中最常見的易位形式，主要出現(xiàn)在AML的M5a患者中，在兒童AML患者中發(fā)生率為8-10%，在成人中為1-2%，總的預(yù)后良好，但是患者的年齡等各種指標(biāo)的差別也決定預(yù)后的差異。根據(jù)報道，含有MLL-AF9的小鼠能夠?qū)е翧ML的發(fā)生，但單純的MLL基因異常不會導(dǎo)致白血病發(fā)生，表明MLL重排形成融合基因或有伙伴染色體基因的參與是白血病發(fā)生的必需條件。MLL-AF10融合基因由t(10;11)(p13;q23)易位形成，主要見于兒童AML-M5患者中，預(yù)后不良，且變異復(fù)雜易位更常見。MLL-ELL融合基因由t(11;19)(q23;p13.1)易位形成，在

27、AML患者中的發(fā)生率較低，已有報道顯示其主要在M5a分型中出現(xiàn)，以成年人為主，預(yù)后不良，2年無病生存率50%。MLL-ENL融合基因由t(11;19)(q23;p13.3)易位形成的，可見于前B-ALL、前T-ALL、M4、M5、M1、M2多種白血病中，以嬰幼兒患者為主，發(fā)生率較低。因此對MLL重排形成的這些融合基因的檢測，對臨床的分型診斷、治療及預(yù)后判斷都具有重要價值。TEL基因又稱為ETV6基因，定位在12號染色體短臂上，能夠編碼ETS家族轉(zhuǎn)錄因子，編碼的蛋白包含兩個功能結(jié)構(gòu)域：能夠與其他蛋白相結(jié)合的PNT結(jié)構(gòu)域和C末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對小鼠的TEL基因進(jìn)行Knockout實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果

28、發(fā)現(xiàn)該基因?qū)υ煅芰脱芫W(wǎng)絡(luò)發(fā)生的維持必不可少。TEL-AML1融合基因是兒童白血病常見的融合基因，由t（12；21）（p13；q22）易位，導(dǎo)致12號染色體上的TEL基因與21號染色體上的AML1基因融合形成，見于25%的前體B細(xì)胞ALL，在兒童的普通ALL中也有較高的表達(dá)（1020%），未見于成熟的B-ALL和T-ALL中。TEL和AML1編碼對正常造血功能具有關(guān)鍵作用的核酸轉(zhuǎn)錄因子，融合基因的形成擾亂了TEL的正常功能，并形成轉(zhuǎn)錄抑制子抑制AML1靶基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生。目前已報道的轉(zhuǎn)錄亞型有兩種：較多的是TEL的5號外顯子與AML1的2號外顯子結(jié)合（90%），較少的是TE

29、L的5號外顯子與AML1的3號外顯子結(jié)合（10%）。對于TEL-AML1陽性的ALL患者的預(yù)后情況現(xiàn)在仍然存有爭議，但是有報道認(rèn)為TEL-AML1融合基因?qū)颊叩?年無病生存率相關(guān)，是預(yù)后良好的重要指標(biāo)。因而臨床中對TEL-AML1的檢測，主要用于對輔助ALL分型，監(jiān)測MRD和預(yù)后情況。目前，臨床或?qū)嶒?yàn)室用于白血病相關(guān)融合基因檢測的方法有多種，常見的包括如熒光原位雜交（FISH）、巢式RT-PCR、實(shí)時定量RT-PCR、多重RT-PCR+寡核苷酸芯片等。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)是通過標(biāo)記熒光素的單鏈DNA（特異性探針）和與其互補(bǔ)的DNA（標(biāo)本）雜交，通過熒光信號的數(shù)量和位置反應(yīng)標(biāo)本相應(yīng)特異

30、性基因的情況。用于白血病相關(guān)融合基因的檢測中，F(xiàn)ISH定量準(zhǔn)確、形象直觀、特異性較強(qiáng)，但是對操作要求較高，成本較高，靈敏度最高達(dá)10-2，不能滿足臨床對于白血病和MRD檢測水平的要求，應(yīng)用受到限制。實(shí)時定量RT-PCR（Real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction）技術(shù)檢測白血病融合基因的方法，是在實(shí)時定量PCR的基礎(chǔ)上，增加逆轉(zhuǎn)錄過程，可用來檢測融合基因的mRNA水平。實(shí)時定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，并使它們發(fā)出的熒光信號隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而成比例

31、增長，通過熒光探測儀實(shí)時檢測每一個循環(huán)結(jié)束后的熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得出定量結(jié)果，可以直接檢測目的基因的起始數(shù)量。實(shí)時定量PCR技術(shù)中SYBR Green法和Taqman探針法兩種最為常用：前者采用SYBR Green染料來監(jiān)測擴(kuò)增過程，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，游離狀態(tài)不發(fā)熒光的SYBR Green染料非特異性結(jié)合到DNA雙鏈中產(chǎn)生熒光；后者采用Taqman探針，該探針能被Taq酶水解，探針的5端帶有熒光報告基團(tuán)，3端帶有熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)兩個基團(tuán)靠近的時候報告基團(tuán)不發(fā)出熒光，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，5端的報告基因由于探針被水解而脫離下來而產(chǎn)生熒光。SYBR Green法價格便宜，能夠和任意的模板

32、引物搭配，但容易受到非特異性擴(kuò)增的影響；Taqman探針法更為準(zhǔn)確，但是必須設(shè)計(jì)特異性的探針與引物模板配合，價格較貴。實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)將逆轉(zhuǎn)錄過程和PCR過程結(jié)合起來，無需開蓋，一步法操作，減少污染機(jī)會；操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高；擴(kuò)增過程中閉管操作，實(shí)時數(shù)據(jù)監(jiān)測，降低了污染機(jī)會，減少假陽性結(jié)果；無需電泳，大大縮短了操作時間，減少了操作的繁瑣；通過定量內(nèi)參基因來評價操作質(zhì)量，減少了假陰性結(jié)果。該方法成本也較低，適合在臨床應(yīng)用中開展。巢式RT-PCR是一種變異PCR，使用兩對PCR引物擴(kuò)增同一個片段。第一對PCR引物擴(kuò)增和普通PCR相似，第二對引物稱為巢式引物，引物它們結(jié)合在第一次PC

33、R產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增片段。巢式PCR特異性強(qiáng)，如果第一次擴(kuò)增出錯，則第二次繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增的概率極低，但是最后的結(jié)果需要用電泳實(shí)驗(yàn)觀察，總體流程繁瑣，無法準(zhǔn)確定量檢測白血病融合基因。多重巢式RT-PCR+寡核苷酸芯片檢測方法，是在巢式RT-PCR的基礎(chǔ)上，在兩輪PCR中都平行設(shè)置針對多組融合基因的引物，同時檢測多種融合基因的剪接體，所有基因的第二輪上游引物在合成時用熒光素在5端進(jìn)行熒光標(biāo)記，所有分型探針再3端進(jìn)行氨基修士。這樣經(jīng)過多重巢式PCR，一次可以擴(kuò)增出多種可能存在的融合基因，再與所有分型探針在芯片上雜交，鑒定具體的融合基因類型。該方法靈敏度較高，能夠同時檢測多

34、種融合基因，但成本較高，操作較為復(fù)雜。2008年WHO關(guān)于白血病分型的標(biāo)準(zhǔn)中將BCR-ABL、PML-RAR、AML1-ETO融合基因等一些常見的染色體異常歸納入白血病基本診斷標(biāo)準(zhǔn)，更說明了對這些融合基因的檢測，對于白血病的診斷和治療具有重要的意義：檢測結(jié)果不僅可以為白血病診斷分型和預(yù)后判斷提供重要依據(jù)，減少人為主觀的判斷，使白血病的診斷分型更加科學(xué)化和規(guī)范化，同時也是白血病微小殘留病變（MRD）檢測的基礎(chǔ)，對白血病的臨床個性化治療的開展具有重要的推動作用。參考文獻(xiàn)1. J Gabert, E Beillard, VHJ van der Velden, et al. Standardizati

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