金屬離子對(duì)原花青素和牛血清白蛋白相互作用的影響

1、 學(xué)學(xué) 號(hào)號(hào) 0908014127 蛋白之間相互作用的影響蛋白之間相互作用的影響分分 類類 號(hào)號(hào) 密密 級(jí)級(jí) 10722 公開公開 Metal ion for the Procyanidins and for interaction between bovine serum 作者姓名作者姓名指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師學(xué)科門類學(xué)科門類提交論文提交論文日期日期專業(yè)名稱專業(yè)名稱學(xué)校代碼學(xué)校代碼成績(jī)?cè)u(píng)定成績(jī)?cè)u(píng)定 化化 學(xué)學(xué)尚永輝尚永輝 2013 年年 5 月月 金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白 張張 沛沛 理理 學(xué)學(xué)摘要-摘摘 要要采用熒光光譜法研究了不同溫度下金屬離子 Fe2+、Zn2

2、+對(duì)原花青素和牛血清白蛋白(BSA)之間相互作用的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不存在金屬離子時(shí)，原花青素對(duì) BSA 的熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅，在 Fe3+ 或 Zn2+的存在下，原花青素和牛血清白蛋白相互作用的峰逐漸降低，說明了這兩種金屬離子可以增大原花青素對(duì) BSA 的猝滅，并且隨著原花青素濃度的增加，猝滅的效果越明顯。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：金屬離子；熒光光譜；原花青素；牛血清白蛋白AbstractEffects of metal ions Fe2+, Zn2+ of proanthocyanidins and bovine serum albumin by fluorescence spectroscop

3、y at different temperatures (BSA) influence the interaction between. The experimental results show that, there is no metal ion, fluorescence quenching process of proanthocyanidins on BSA is a static quenching procedure in Fe3+ or the presence of Zn2+, the interaction of proanthocyanidins and bovine

4、serum albumin was gradually reduced, and show that the two kinds of metal ions can increase the procyanidins quenching of BSA, and with the increase of proanthocyanidins concentration quenching effect more obvious.Key words: Metal ion; fluorescence spectrophotometry; procyanidins; bovine serum album

5、in目目 錄錄摘摘 要要.I目目 錄錄.前前 言言.11 文獻(xiàn)綜述文獻(xiàn)綜述.21.1 原花青素.21.2 牛血清白蛋白.31.3 藥物小分子與大分子的相互作用的研究現(xiàn)狀.31.3.1 藥物小分子與大分子的相互作用模式.31.3.2 分析方法及進(jìn)展.42 實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分.72.1 藥品試劑與儀器設(shè)備.72.1.1 藥品試劑.72.1.2 儀器設(shè)備.72.2 實(shí)驗(yàn)步驟.73 結(jié)果與討論結(jié)果與討論.83.1 白楊素對(duì) BSA 的猝滅作用 .83.1.1 猝滅光譜.83.1.2 測(cè)定結(jié)合常數(shù)以及猝滅機(jī)理.83.1.3 研究作用力類型及熱力學(xué)性質(zhì).93.2 Fe2+對(duì)原花青素與 BSA 的相互作用的影

6、響3.2.1 熒光猝滅光譜圖.103.2.2 同步熒光光譜.10 3.3 Zn2+對(duì)原花青素與 BSA 的相互作用的影響.11 3.3.1 熒光猝滅光譜法.12 3.3.2 同步熒光光譜.133.4結(jié)結(jié) 論論.14致致 謝謝.15參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn).160前前 言言從上世紀(jì)90年代以來，DNA、蛋白質(zhì)和藥物小分子的研究已經(jīng)成為化學(xué)以及生命科學(xué)的熱門主題之一。并且在分子水平來探究這些小分子、大分子、離子，尤其是藥物分子之間的相互作用，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生物科學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)等很多領(lǐng)域的重要的研究課題，并且引起了很多學(xué)者的關(guān)注。人類和藥物是密切相連，經(jīng)過長(zhǎng)期反復(fù)的實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐，歷史上人們也發(fā)現(xiàn)了許多可以

7、治療疾病的藥物。但隨著科技的發(fā)展，藥物的效率必須提高，而副作用必須減小，為了達(dá)到這一目標(biāo)，人們開始了一系列的模擬疾病的過程或者效果的體外和體內(nèi)的系統(tǒng)，用這些來挑選來自植物和動(dòng)物以及微生物發(fā)酵和人工合成的各個(gè)化合物。伴隨著醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)的發(fā)展以及人們對(duì)病癥的發(fā)生、發(fā)展的深入了解，這些選擇出來的系統(tǒng)也從簡(jiǎn)單的動(dòng)植物模型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閷ｉT針對(duì)病癥治療靶點(diǎn)命中率更好的選擇體系。比如蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)則是生物體內(nèi)重要的大分子，它可以運(yùn)載、儲(chǔ)存生物體內(nèi)的一些物質(zhì)，主要由于它的特殊結(jié)構(gòu)，使其在生物體內(nèi)有著很關(guān)鍵的作用。對(duì)于蛋白質(zhì)當(dāng)中的血清蛋白來說，它是非常豐富的載體蛋白在血漿內(nèi)，藥物一旦進(jìn)人血漿內(nèi)，就會(huì)立即先于

8、血清蛋白合成，然后再通過血清蛋白運(yùn)送到身體的每個(gè)部位，從而達(dá)到發(fā)揮藥效的作用。這也是從分子的水平上來研究血清白蛋白和小分子之間的相互作用，對(duì)于了解藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的過程，都非常有幫助，并且可以為具有高活性的藥物小分子設(shè)計(jì)和開發(fā)研究出有價(jià)值的一些信息。對(duì)于原花青素的來說，它是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最好的天然的抗氧化劑，并且它還具有防癌、抗癌、抗高糖、抗輻射，調(diào)節(jié)免疫力，保護(hù)皮膚等等一系列對(duì)人體有益的作用，它分布在較多的植物中，具有很強(qiáng)的藥理性。所以，研究原花青素和白蛋白是現(xiàn)如今國內(nèi)外的熱點(diǎn)話題。它可以為人類的克服疾病方面做出很大的貢獻(xiàn)。近些年，人們采用了非常豐富的手段研究藥物小分子、DNA 以及蛋白質(zhì)之

9、間的相互作用，以及當(dāng)有金屬離子存在時(shí)，對(duì)他們實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度。目前常用到的方法有許多，比如說：紫外可見吸收光譜法、熒光光譜法、元二色譜法、線二光譜法、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜法、拉曼光譜法、核磁共振等等一系列的方法。而熒光光譜法則是目前研究蛋白質(zhì)與各種有機(jī)小分子、離子或無機(jī)化合物之間相互作用的重要手段之一。金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白蛋白相互作用的影響- 1 - 1 文獻(xiàn)綜述文獻(xiàn)綜述 研究金屬離子對(duì)原花青素和 BSA 之間相互作用的影響為研究金屬離子對(duì)于藥物小分子和生物大分子（牛血清白蛋白、核酸）之間的作用的影響的發(fā)展起到很大的作用.在機(jī)體是由數(shù)以億萬計(jì)分子量大小不等的分子組成。蛋白質(zhì)是體內(nèi)重要的

10、生物大分子。蛋白質(zhì)擔(dān)負(fù)著各種生理功能，是生物性狀的直接表達(dá)者。它在人體代謝中扮演極為重要的角色，從整體上維持生物體新陳代謝活動(dòng)的進(jìn)行，人類絕大多數(shù)疾病都是由蛋白質(zhì)異常引起的。因此核蛋白質(zhì)的分析在生命科學(xué)、生化藥物、食品分析及臨床檢驗(yàn)中都有著重要作用。深入研究小分子物質(zhì)與蛋白的作用，對(duì)分子水平上闡明生命的奧秘、開發(fā)新型藥物、攻克許多疑難病癥以及促進(jìn)信息科學(xué)的發(fā)展都具有重要的意義，并且,生物體內(nèi)存在很多種金屬元素, 它們參與著多種重要的生命機(jī)體活動(dòng),任何一種生物所體必需的金屬元素在體內(nèi)含量過高或過低，都可能導(dǎo)致病態(tài)。金屬離子本身也可與藥物分子或者生物大分子相互結(jié)合。因此,研究藥物小分子、金屬離子與

11、生物大分子之間的相互作用對(duì)于指導(dǎo)藥物設(shè)計(jì)與合成、認(rèn)識(shí)并了解某些疾病的致病機(jī)制和藥物治病機(jī)制、明確生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能、探索超分子體系的化學(xué)本質(zhì)等都有著重要的意義.并因此成為醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、計(jì)算化學(xué)及物理學(xué)等領(lǐng)域的研究的熱點(diǎn), 是生命科學(xué)研究非常重要的組成部分。 國外的許多研究學(xué)者在很早之前就做了金屬離子與血清蛋白之間的相互作用。國內(nèi)對(duì)金屬離子和血清蛋白的研究則相對(duì)較晚，大概 80 年代初期開始起步，但也取得了一些比較有意義的成果。國內(nèi)外在此領(lǐng)域研究的目的在于全面了解藥物的作用機(jī)理和它的不良反應(yīng),對(duì)傳統(tǒng)藥物的預(yù)估和對(duì)新藥物的開發(fā)和研究。此領(lǐng)域研究的方法很多,范圍比較廣泛,比如光譜法、色譜法

12、、電泳法、電化學(xué)方法以及其他物理化學(xué)方法等。尤其是光譜法的研究，并取得了一定的研究成果，為促進(jìn)藥物的生產(chǎn)提供了一定生產(chǎn)工藝。目前,有關(guān)金屬離子對(duì)藥物小分子和生物大分子之間作用影響的報(bào)道非常的多。本文擬采用熒光光譜法研究不同溫度下不同的金屬離子對(duì)它們之間相互作用的影響以及影響的程度, 擬根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)對(duì)它們的相互作用機(jī)理做初步的研究與探討。1.1 原花青素原花青素原花青素,簡(jiǎn)稱 OPC。分子式及分子量:C30H26O13 594.5, 紅棕色粉末，沸點(diǎn) 986.4Cat760mmHg, 氣微、味澀，能溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑。是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基

13、最有效的天然抗氧化劑。最新研究表明藍(lán)莓葉提取物原花青素可阻止丙肝病毒復(fù)制。結(jié)構(gòu)式如下：2 1.2 牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白(Bovine albumin)，又稱第五組分，是牛血清中的一種球蛋白，包含583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66.430 kDa。等電點(diǎn)為4.7。儲(chǔ)存條件，2-8C。溶解度40 毫克/毫升。其主要成分有：蛋白質(zhì)、多肽、激素以及其他成分。它是以牛血為原料分離出血清，用硫酸銨分級(jí)沉淀后，經(jīng)辛酸處理精制而得。 生產(chǎn)用途： 1、 用于生化研究、遺傳工程和醫(yī)藥研究 2、用于醫(yī)藥保健食品、調(diào)味品 3、維持滲透壓、PH 緩沖、載體作用 4、在 PCR 體系中有助于 Taq 酶穩(wěn)定

14、性及活性可以提高 PCR 的效率 BSA 的作用: BSA 一般做為穩(wěn)定劑被用于限制酶或者修飾酶的保存溶液和反應(yīng)液中，因?yàn)橛行┟冈诘蜐舛认虏环€(wěn)定或活性低。加入 BSA 后，它可能起到“保護(hù)”或“載體”作用，不少酶類添加 BSA 后能使其活性大幅度提高。不需要加 BSA 的酶加入 BSA 一般不會(huì)受到什么影響。對(duì)多數(shù)底物 DNA 而言，BSA 可以使酶切更完全，并可實(shí)現(xiàn)重復(fù)切割。在37，酶切反應(yīng)超過1h 時(shí)，BSA 可以使酶更加穩(wěn)定，因?yàn)樵诓缓?BSA 的反應(yīng)緩沖液中，許多限制性內(nèi)切酶在37下只能存活1020min 甚至更短的時(shí)間。而 BSA 可以結(jié)合緩沖液或底物DNA 中抑制限制性內(nèi)切酶活性的

15、金屬離子和其它化學(xué)物質(zhì)。三維結(jié)構(gòu)圖如下： 1.3 藥物小分子與大分子的相互作用的研究現(xiàn)狀藥物小分子與大分子的相互作用的研究現(xiàn)狀1.3.1 藥物小分子與大分子的相互作用模式藥物小分子與大分子的相互作用模式 藥物小分子和DNA之間的相互作用主要是非共價(jià)鍵結(jié)合、共價(jià)鍵的結(jié)合以及三種剪金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白蛋白相互作用的影響- 3 -切模式。非共價(jià)鍵的結(jié)合又被分成靜電結(jié)合、溝槽的結(jié)合以及嵌結(jié)合等三種模式。小分子作用DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)外表面是靜電結(jié)合,并且沒有選擇性。分子和DNA大溝或者小溝的某些堿基對(duì)的直接作用是溝槽結(jié)合，且藥物小分子往往在小溝中作用。嵌結(jié)合則是將小分子內(nèi)的平面直接嵌入到核酸的一

16、些堿基之間。這也是小分子和DNA作用的重要方法之一。當(dāng)藥物小分子和靶部位的大分子結(jié)合后，會(huì)使大分子發(fā)生如構(gòu)象的變化等變化，然后會(huì)引起一些列的生物、化學(xué)、物理變化，最后表現(xiàn)在性質(zhì)以及各個(gè)功能的變化。因此，藥物的效應(yīng)簡(jiǎn)單的可以理解成機(jī)體自身對(duì)藥物小分子和生物大分子之間的相互作用整體反應(yīng)。藥物分子和牛血清白蛋白之間的作用力有靜電力、范德華力、氫鍵、疏水作用力等等。 與血清白蛋白結(jié)合的一些共存物質(zhì)是會(huì)影響藥物小分子和生物大分子的結(jié)合。生物體內(nèi)的許多微量元素也參加了很多重要的生命活動(dòng)，F(xiàn)e3+、Zn2+、Mg2+等，都和生物的生存息息相關(guān)。所以研究這些對(duì)無機(jī)離子在生物體內(nèi)的生理、生化作用，還有他們對(duì)各物

17、質(zhì)之間的體內(nèi)的代謝過程的影響都具有很重要的意義。1.3.2 分析方法及進(jìn)展分析方法及進(jìn)展根據(jù)利用不同的參數(shù)表征情況，此領(lǐng)域的研究包括了光譜法、色譜法、電泳法、電化學(xué)和其他的各種理化方法。在光譜法中主要的方法有紫外-可見吸收光譜法(UV-vis absorption spectroscopy)、熒光光譜法(fluorescent spectrum)、圓二色譜法(circular dichroism，CD)、拉曼光譜法(Raman spectroscopy)等等。然則蛋白質(zhì)分子中的某些氨基酸具有一些特別的光學(xué)活性，在270nm附近有吸收，對(duì)于許多藥物自身也有光學(xué)活性，藥物分子也可以和蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生

18、了光學(xué)活性或者改變了原來的光學(xué)活性。因此，應(yīng)用光譜法來研究藥物小分子和生物大分子的結(jié)合機(jī)理是非常有效、非常便捷的方法。本文是對(duì)光譜分析法中的熒光光譜法進(jìn)行介紹。熒光光譜法熒光光譜法 對(duì)于藥物小分子和大分子之間相互作用來說，熒光光譜法是一種廣泛應(yīng)用且具有較多成果而且有效的一種重要的手段，它的特點(diǎn)是快速、靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)。當(dāng)有小分子和核酸發(fā)生嵌結(jié)合的時(shí)候，可以在熒光測(cè)定時(shí)看到由于該作用而發(fā)生的熒光猝滅表象。最早應(yīng)用的熒光探針是溴化乙錠( EB)，現(xiàn)如今已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中的抗癌藥物的選擇和藥物小分子和核酸的相互作用。溴化乙錠( EB)和DNA結(jié)合可以用Scatchard方程來加以描述，

19、,r/ c = k ( n - r)，用此公式作圖，可以根據(jù)斜率和截距的變化判斷藥物小分子和DNA之間的作用。而在蛋白質(zhì)中有具有內(nèi)源熒光的的色氨酸、絡(luò)氨酸，并且在340nm處有最大的熒光峰。再有藥物加入的同時(shí)，BSA的熒光強(qiáng)度呈有規(guī)律的變化，這就可以說明藥物對(duì)熒光有猝滅的作用。熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，可以根據(jù)上面的公式求得猝滅曲線，卻定猝滅的類型。并根據(jù)他們的焓變、熵變來找出他們之間的作用力。張勇等利用了熒光猝滅的方法探究了金屬離子、絲裂霉素與血清白蛋白之間的相互作用以及影響，并且計(jì)算了絲裂霉素與血清白蛋白之間的結(jié)合常數(shù)。Fe3+、Zn2+、Mg2+等離子可以是結(jié)合常數(shù)發(fā)生降低，而Cu

20、2+則增大。4高旭等在模擬動(dòng)物的生理?xiàng)l件下，采用熒光猝滅的方法研究了（BSA）和鉻之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)鉻對(duì)BSA有相對(duì)較強(qiáng)的猝滅作用。并通過對(duì)數(shù)據(jù)的研究和處理，發(fā)現(xiàn)了鉻和BSA之間是靜態(tài)的熒光猝滅，并且測(cè)定了他們的猝滅常數(shù)，確定了結(jié)合位點(diǎn)數(shù)是2。 Silva也研究了氯丙嗪與氯高鐵紅素和牛血清白蛋白的相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了氯高鐵紅素能增強(qiáng)氯丙嗪對(duì)的牛血清白蛋白的猝滅作用，使BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白蛋白相互作用的影響- 5 - 2 實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分2.1 藥品試劑與儀器藥品試劑與儀器設(shè)備設(shè)備2.1.1 藥品試劑藥品試劑牛血清白蛋白(BSA，Sigma 公司，相對(duì)分子質(zhì)

21、量：68000） ；pH 值為 7.4 的 Tris-HCl緩沖溶液；用 0.1molL-1pH=7.4Tris-HCl 緩沖溶液配成濃度為 110-4molL-1 的溶液 BSA溶液；110-3mol/L 的原花青素溶液，0.110-3molL-1 的 ZnCl2、FeCl3溶液。實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。2.1.2 儀器儀器設(shè)備設(shè)備RF-5301 型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司)；HA-180MF 電子分析天平（日本日立公司） ；TB-85 型恒溫水?。ㄈ毡緧u津公司） ；pHSJ-4ApH 計(jì)（上海雷磁儀器廠） 。2.2 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟稱取 1.211gTris 溶解配置成 100ml

22、0.1ml/L 的溶液；稱取 0.0406g FeCl3溶解，配置成250ml 110-3ml/L 的溶液；稱取 0.1395ZnCl2溶解，配置成 250ml 的溶液，再取其中的25ml 稀釋至 250ml 得約 110-3mol/LZnCl2 溶液，取 0.1mol/lTris 溶液 50ml，加 0.1mol/L 鹽酸 48.0ml, 混勻加水稀釋至 100ml 得到的溶液為 pH=7.4Tris-HCl 緩沖溶液。取 18 個(gè)10ml 的比色管對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，分別向所有試管中加入一定量的 1.010-4mol/LBSA，然后每 3 個(gè)試管為一組，給每一組中的 3 個(gè)試管分別加入一定量 1

23、.010-3mol/L 的原花青素，然后在試管中分別加入一定量 1.010-3mol/LFeCl3 （或 ZnCl2），最后向每一個(gè)試管中加入 3ml PH 值為 7.40 的 Tris-HCl 緩沖溶液，用蒸餾水定容到 10ml，靜置 30min。在室溫（295K）下，用熒光分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 300700nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描發(fā)射光譜，同時(shí)在波長(zhǎng) 235700nm 和 280700nm 范圍內(nèi)分別做同步熒光，然后分別在三種不同的溫度下掃描發(fā)射光譜，繪制出一系光譜圖。6 3 結(jié)果與討論結(jié)果與討論3.1 原花青素對(duì)原花青素對(duì) BSA 的猝滅作用的猝滅作用3.1.1 猝滅光譜猝滅光譜按照上面所述的試

24、驗(yàn)方法分別研究了 296 K、301K、305K 的溫度下，在不同濃度下原花青素對(duì) BSA 的熒光猝滅光譜。圖 1 是 296K 時(shí)的猝滅光譜。從圖 1 可以看到, 隨著原花青素濃度的逐漸增加 BSA 的吸收峰逐漸降低。這是因?yàn)榕Ｑ宓鞍踪|(zhì)中有酪氨酸和色氨酸， 使的蛋白質(zhì)具有內(nèi)源熒光，令 BSA 的量固定不變，使原花青素的濃度逐漸增加時(shí)， BSA 與原花青素的相互作用會(huì)使 BSA 內(nèi)源熒光強(qiáng)度產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅現(xiàn)象。 300350400450500020406080100120140160FWavelength/nm04圖圖 1 296K 原花青素與原花青素與 BSA 相互作用的熒光猝滅光譜圖相

25、互作用的熒光猝滅光譜圖3.1.2 測(cè)定結(jié)合常數(shù)以及猝滅機(jī)理測(cè)定結(jié)合常數(shù)以及猝滅機(jī)理 BSA 的熒光猝滅有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程，使激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的過程。動(dòng)態(tài)猝滅過程遵 Stern-Volmer 方程：F0/F=1+KSVQ=1+Kqt0Q式中，F(xiàn)0 和 F 分別是不存在和存在猝滅劑時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度，Q是猝滅劑的平衡濃度，KSV 是 Stern-Volmer 猝滅常數(shù) Kq 為雙分子猝滅速率常數(shù)，t0 是在沒有猝滅劑存在的情況下測(cè)的光壽命。根據(jù)猝滅劑存在時(shí)的熒光壽命和不存在時(shí)的熒光壽命不同，Stern-Volmer 方程式的另一種表

26、達(dá)形式為：t0/t=1+KSVQt0 和 t 分別表示沒有猝滅劑存在所測(cè)得的熒光壽命與有猝滅劑存在下所測(cè)得的熒光壽命。靜態(tài)猝滅與動(dòng)態(tài)猝滅所得的關(guān)系式相似，只是在靜態(tài)猝滅的情況下用絡(luò)合物形成常數(shù)代金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白蛋白相互作用的影響- 7 -替猝滅常數(shù)。0.00.51.01.52.02.53.03.50.00.20.40.60.81.0QF0/F-144度35度25度15度相關(guān)數(shù)據(jù)如表 1 所示：表表 1 不同溫度下白楊素對(duì)不同溫度下白楊素對(duì) BSA 的猝滅方程及猝滅常數(shù)的猝滅方程及猝滅常數(shù)溫度/KStern-Volmer 方程Kq(1013Lmol-1s-1)295F0/F-1= 0

27、.301Q + 0.00610.301303F0/F-1=0.2848Q - 0.00120.2848310F0/F-1=0.2468Q + 0.00450.2468317F0/F-1=0.2078Q - 0.0088 0.20783.1.3 研究作用力類型及熱力學(xué)性質(zhì)研究作用力類型及熱力學(xué)性質(zhì)分子間作用力有靜電引力、疏水作用力、氫鍵、范德華力等，溫度變化幅度微小時(shí)H 可看做是不變的，利用熱力學(xué)公式計(jì)算出 H、S、G 計(jì)算結(jié)果在表 1 中。由 G0 可知原花青素與 BSA 的相互作用是自發(fā)完成的，又由于 H0 且 S0，可以推斷出原花青素與 BSA之間相互作用主要以靜電引力為主，但是由于原花青

28、素是多羥基疏水化合物，所以應(yīng)該還有疏水作用力和氫鍵的存在。同步熒光光譜：8 250275300325350020406080FWavelength/nm04a300350400020406080100120140160FWavelength/nm04b圖圖 2 296K 原花青素與原花青素與 BSA 相互作用不同波長(zhǎng)的的同步熒光光譜圖相互作用不同波長(zhǎng)的的同步熒光光譜圖3.2 Fe3+對(duì)原花青素與對(duì)原花青素與 BSA 的相互作用的影響的相互作用的影響3.2.1 熒光猝滅光譜圖熒光猝滅光譜圖 1.金屬金屬 Fe3+對(duì)對(duì) BSA 的猝滅圖譜的猝滅圖譜 300350400450500020406080

29、100120140160FWavelength/nm02250275300325350020406080FWavelength/nm02a300350400020406080100120140160FWavelength/nm02b 圖圖 3 296K 鐵對(duì)鐵對(duì) BSA 的熒光猝滅圖的熒光猝滅圖從圖 3 可以看出，296K 時(shí)，金屬 Fe3+離子的加入使得 BSA 的峰逐漸呈降低的狀態(tài)，所以說對(duì) BSA 有明顯的熒光猝滅。 2.鐵對(duì)原花青素與鐵對(duì)原花青素與 BSA 相互作用的影響的猝滅圖譜相互作用的影響的猝滅圖譜 金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白蛋白相互作用的影響- 9 - 30035040045

30、0500020406080100120140160FWavelength/nm03圖圖 4 301KFe3+對(duì)原花青素與對(duì)原花青素與 BSA 相互作用的熒光猝滅光譜圖相互作用的熒光猝滅光譜圖 圖 4 從上到下依次為：a.BSA b.BSA+原花青素 c.BSA+原花青素+Fe3+ （2ml） d.BSA+原花青素+Fe3+（4ml） 根據(jù)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法研究了在一定溫度下，有 Fe3+參與時(shí)在不同濃度下原花青素對(duì)BSA 的熒光猝滅光譜。從上圖 3 可以看到, Fe3使 BSA 的峰降低，所以 Fe3+對(duì) BSA 有熒光猝滅的作用。圖 4 是 301K 時(shí)的猝滅光譜。由圖 4 中的線條 a、b 可

31、知，原花青素會(huì)使BSA 發(fā)生猝滅作用；由線條 b、c 可知，當(dāng)有金屬 Fe3原花青素與 BSA 相互作用的峰會(huì)變低，說明 Fe3+會(huì)增加原花青素對(duì) BSA 的猝滅，而且隨著原花青素濃度增加猝滅越明顯；由線條 c、d 可知，當(dāng)金屬 Fe3+的濃度增大時(shí)，F(xiàn)e3+對(duì)原花青素和 BSA 相互作用的峰變化不大，所以金屬離子對(duì)體系的影響與它的濃度大小沒有關(guān)系。由圖可得，F(xiàn)e3+、原花青素與 BSA 之間形成了三元配合物，從而產(chǎn)生了熒光猝滅，金屬的加入導(dǎo)致猝滅程度加強(qiáng)。3.2.2 同步熒光光譜同步熒光光譜 250275300325350020406080FWavelength/nm04a300350400

32、020406080100120140160FWavelength/nm03b10 圖圖 5 301KFe3+對(duì)原花青素與對(duì)原花青素與 BSA 相互作用的影響的同步熒光光譜圖相互作用的影響的同步熒光光譜圖 由圖可以看出，金屬 Fe3+使原花青素和 BSA 之間的猝滅程度加深。 金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白蛋白相互作用的影響- 11 -結(jié)結(jié) 論論隨著白楊素濃度的逐漸增加 BSA 的吸收峰逐漸降低。這是因?yàn)榕Ｑ宓鞍踪|(zhì)中有酪氨酸和色氨酸，使的蛋白質(zhì)具有內(nèi)源熒光，令 BSA 的量固定不變，使白楊素的濃度逐漸增加時(shí)，BSA 與白楊素的相互作用會(huì)使 BSA 內(nèi)源熒光強(qiáng)度產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅現(xiàn)象。白楊素與 BS

33、A 之間相互作用主要以靜電引力為主，但是由于白楊素是多羥基疏水化合物，所以應(yīng)該還有疏水作用力和氫鍵的存在。從圖 2 可以看到，Cu 2+對(duì) BSA 的峰基本沒有影響，所以 Cu 2+對(duì) BSA 沒有熒光猝滅，由圖 3、圖 4、圖 5 可知，當(dāng)有 Mn2+存在時(shí)白楊素與 BSA 相互作用的峰逐漸降低，說明Mn2+會(huì)加重白楊素對(duì) BSA 的猝滅，而且隨著白楊素濃度增加猝滅越明顯。金屬的加入導(dǎo)致猝滅程度加強(qiáng)，Mn2+、白楊素與 BSA 之間形成了三元配合物，從而產(chǎn)生了熒光猝滅。 12致致 謝謝今年是忙碌的一年，充實(shí)的一年，經(jīng)過這半個(gè)學(xué)期的不懈努力，我的畢業(yè)設(shè)計(jì)也將要圓滿完成了。將近兩個(gè)月的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷，

34、是我在大學(xué)四年里對(duì)實(shí)驗(yàn)技能的總結(jié)與實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ奶嵘?，期間我得到了老師與同學(xué)的幫助，在此我要感謝我的指導(dǎo)老師尚永輝老師，以及我的同學(xué)劉麗同學(xué)，是你們的幫助我才能順利完成這次畢業(yè)設(shè)計(jì)。在此向尚永輝老師表示誠摯的感謝和崇高的敬意。本人的畢業(yè)論文的實(shí)驗(yàn)工作大部分是在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室里完成的，尚老師對(duì)于我的大部分實(shí)驗(yàn)細(xì)心指導(dǎo)，在論文的撰寫也給予了莫大的幫助，他認(rèn)真的科研態(tài)度，教會(huì)了我對(duì)待科研的正確態(tài)度。尚老師和藹、勤懇、工作積極認(rèn)真的態(tài)度使我終生受益匪淺。四年的大學(xué)生活給我留下的不僅僅是學(xué)術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)步，更多的是美好的回憶。最后，感謝各位老師對(duì)我的論文的批閱和指正。金屬離子對(duì)原花青素與牛血清白蛋白相互作用的影響- 13 -參考文參考文獻(xiàn)獻(xiàn)1 盧繼新, 李惠芬, 蔡樂等. 藥物小分子與生物大分子相互作用的研究方法進(jìn)展J. 分析